基于環境DNA宏條形碼技術的大洋河下游魚類多樣性研究

中圖分類號S932. 文獻標識碼A文章編號 0517-6611（2025）12-0059-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.12.015

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on the Fish Diversity in the Downstream of Dayang River Based on Environmental DNA Metabarcoding Technology ZHUChun-yue，YANGPei-min，LIUZhong-hangetal（LiaoningItituteofFreshwaterFisheries/LiaoningKeyLaboratoryofquatic Animal Diseases Control，Liaoyang，Liaoning111000）

AbstractInodetounderstandthspecicompositooftifisspecisommunitisandprotectheirdiversityintedowsteamof DayangRiverviroetalDmetabarodinehgasusdtoaletespisdvesityofsiedostreaoagi er.Throughthecolletionandhigh-troughputsequencingaalysisofDA（eDNA）samplesfromthedownstreamenvironentoftheDayang River，atotalofsiesofsectediplsfrotreaftaoitga，， 9orders.Amongtherders，Cypriniforeshdthelgestspeiesumber34speies）folowdbyGobfos（1Ospecies）llfs speciesHophalmchorinlematocesdilssdgheratiedaethotaleatiea 83.85% .Overall，thediversiyandabundanceoffshatestuarinesites（K）werelowerhilethoseinLingdongsection（S）wereighr.Comparedwithtradioalsiods，oealetabarodinhdthdaagofstigssiivitydiou beusedaasupnttodalsysouesuryTsdyouldeichtesructuraladfucioaloaoofsoucs inthlowerrachsofthengRivendproidesicfaiosuprtsforthsteatcaagentdesatoofishc in this water area.

KeyWordsEnvironmental DNA（eDNA） technology;Fish diversity;Dayang River

大洋河發源于遼寧省岫巖縣偏嶺鄉一棵樹嶺南側，流經岫巖縣，至東港市黃土坎入黃海[1]。干流全長 230km ，流域面積 6504km² ，是遼河與鴨綠江之間最大的河流，多年平均徑流量為31億 m^3[2] 。大洋河水生態系統保護較好，大部分河段為沙礫底質[。該流域內無污染，且干流沒有大型水庫[3]，魚類資源較為豐富[4]。目前關于大洋河的研究多集中在單一物種生物學研究[1，5-6]、水質資源評估與保護[7-9]、洪水分析與預報技術方面[10-I]。迄今為止關于魚類資源多樣性的研究較少，僅在1980年對大洋河進行了魚類資源的調查。由于近年來大洋河流域內環境的變化和支流水壩的建設[3]，及時準確掌握水域內的魚類生物量和時空動態分布有助于開展魚類資源的保護、開發和合理利用。

環境DNA宏條形碼技術（eDNAmetabarcoding）是一種利用DNA 條形碼和高通量測序（high throughput sequencing，HTS）相結合，對環境樣本中的eDNA進行快速檢測，從而獲取環境樣本中DNA所屬物種的分類學信息和基因功能信息的研究方法[12-13]。其原理是收集物種通過細胞脫落、尿液/糞便排泄等方式殘留在環境中的DNA，然后利用特定的引物擴增出物種（或生物群落）特定DNA序列，并通過高通量測序確定物種種類組成和多樣性特征[14-15]。與傳統檢測方法相比，eDNA具有較高的靈敏度，可以檢測到少量DNA拷貝，采樣方案相對簡單，即采樣 0.5～3.0L 水即可對水域中的生物進行檢測[16-17]。最初，eDNA 技術被用于分析土壤環境中微生物的多樣性以及物種鑒定[18-19]，后來被應用于檢測評估淡水環境中生物的多樣性和種類[20-22]，現在已被廣泛應用于海洋和河口等不同生態系統的生物多樣性檢測、評估[23-24]該研究利用環境DNA宏條形碼技術對大洋河下游開展魚類資源調查，分析了大洋河下游魚類組成、生物量和多樣性指數，以客觀評估大洋河下游魚類資源現狀，以期為大洋河的生態修復效果評估與方案優化提供數據支撐。

1材料與方法

1.1采樣時間及采樣地點試驗所用環境樣本為2023年10月20—23日采自大洋河下游的水域樣本，此次調查按離海遠近在河流下游選取3個地點，即河口（K）、黃土坎段（H）和嶺東段（S）。為了檢測到整個區域，分別在每個地點河流的斷截面取3個點，包括河流兩岸和中間段，共9個位點，具體采樣位點信息見圖1。

1.2環境DNA樣本采集、處理及提取每個采樣位點采集表層、中層和底層水樣各 3L ，混勻。為了避免樣品交叉感染，取樣品和手套均為一次性，采樣后丟棄。各位點水樣在采集后 24h 內處理完畢，使用 0.22μm 無菌濾膜真空抽濾，抽濾前用84消毒液對抽濾裝置進行浸泡消毒處理，得到濾膜（各點位5＼～7個平行），放置在無菌無酶的 2mL 離心管中保存至 -80°C 冰箱中。在DNA提取前，先在無菌管中將每個濾膜剪成小塊，再利用DNeasyPowerWaterKit試劑盒（QIAGEN）對濾膜進行基因組DNA提取。最后，利用 1% 瓊脂糖凝膠電泳對提取的基因組DNA進行質量檢測。

1.3PCR擴增及高通量測序使用已報道的魚類eDNA通用引物Tele02-F（AAACTCGTGCCAGCCACC）和Tele02-R（GGGTATCTAATCCCAGTTTG）進行 PCR 擴增[25]。PCR 擴增體系為 5×Fast Pfu Buffer 4μL，2.5 mmol/L dNTPs 2μL 正反引物（ 5μmol/L ）各 0.8μL 、FastPfu DNA Polymerase0.4μL 、模板DNA 10ng ，補雙蒸水至 20μL 。PCR反應程序為 個循環;72^°C 延伸 10min 。參照電泳初步定量結果，使用QuantiFlu-orT-ST藍色熒光定量系統（Promega 公司）進行檢測定量，檢測完成后利用IlluminaPE250進行文庫構建。

1.4數據統計與分析使用USEARCH軟件（version10，ht-tp：//www.drive5.com/usearch/）和 GOLD 數據庫（https：//gold.jgi.doe.gov/），采用denovo和reference相結合的方式去除嵌合體，按照 97% 相似性對OTU（operational taxonomic u-nits）進行聚類分析，得到OTU的代表序列，生成OTU表格。采用UCLUST 算法（https：//www.drive5.com/usearch/manual/uclust_algo.html）對序列相似性 97% 的OTU代表序列進行分類學分析，統計各樣本在各個分類水平的群落組成。使用Mothur 軟件[26-27]（version v.1.30.1，http：//www.mothur.org/wi-ki/Schloss_SOP#Alpha_diversity）進行 ∝ 多樣性分析，再使用在線分析軟件（http：//www.cloud.biomicroclass.com/Cloud-Platform/SoftPage/FLO）繪制OTU花瓣圖[28]。基于各采樣點物種序列豐度，利用R語言vegan包繪制物種相對豐度圖[29]。

2 結果與分析

2.1環境DNA測序結果對來自大洋河下游的9個水樣進行了分析，共獲得9740369個原始序列，其中9732280個高質量序列，平均長度為 171bp 。在序列相似性 ?97% 的情況下，通過聚類共獲得963個OTU。eDNA樣品的高通量測序統計數據如表1所示。

2.2魚類物種組成將 OTU與GenBank數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）進行比較，對注釋序列的OTU進行分類。共檢測到61種魚類，隸屬于9目21科52屬，其中以鯉形目（Cypriniformes）最多，有34種（占檢測物種數的 56% ）；其次為蝦虎魚目（Gobiiformes），有10種（占檢測物種數的 16% ）。不同采樣位點魚類屬水平相對豐度如圖2所示。整體來看，各采樣位點相對豐度排名前3位的屬為鰱鰱屬 Hypophthalmichthys 鯽屬Carassius鯪屬Planiliza 棘蝦虎魚屬Acanthogobius屬Coilia 副泥鰍屬Paramisgurnus未分類Unclassified 屬 Hemibaarbus原鯉屬Procypris 小鉤屬Microphysogobio鲇屬Silurus 其他Other縞虎魚屬Tridentiger100Hrrraageeeiaaree 80604020】H-1 H2H-3K-1K-2K-3S-1S-2 S-3樣本編號 Sample number屬（Hypophthalmichthys）鮫屬（Planiliza）和屬（Coilia），鰱屬和鮫屬在K（河口）采樣位點相對豐度較高，屬在H（黃土坎段）采樣位點相對豐度較高。基于環境DNA檢測結果的大洋河下游優勢魚類物種統計見表2。

2.3魚類多樣性分析此次測序得到的魚類樣本稀釋曲線如圖3所示，9個采樣位點測序深度均達到平臺期，證實了后續多樣性分析的可行性。由表3可知，在大洋河下游魚類物種的多樣性指標中，Chao指數的變化范圍為 2 059.667～ 3116.824，物種豐富度指數的變化范圍為 1 397～2 451 。Shannon多樣性指數的變化范圍為 3.198 1～5.302 3， Simpson多樣性指數的變化范圍為 0.1011～0.2710 。ACE指數的變化范圍為2126.576＼～3234.492，Pielou均勻度指數的變化范圍為 0.301394～0.470934. 。盡管各采樣位點的魚類物種多樣性指標略有差異，但K-2的Simpson多樣性指數最高，其余指標均為S-1最高。

2.4魚類物種差異分析利用在線分析軟件，根據獲得的樣本OTU統計表，繪制9個采樣位點樣本的OTU花瓣圖。各樣本共有和特有OTU如圖4a所示。由圖4a可知，9個采樣位點樣本共有OTU占比較高，且S-1和S-2這2個采樣位點具有較多的特有OTU。為了比較大洋河下游不同區域魚類物種的組成，對S、H、K3個地點進行了分析，各地共有和特有OTU如圖4b所示。嶺東段（S）的特有OTU數量最多，黃土坎段（H）次之，河口（K）最少。

3討論

3.1大洋河下游魚類物種組成及多樣性大洋河處于遼河多雨區，魚類種類繁多[4]，河口連接黃渤海，一些廣鹽性魚類容易進入大洋河繁殖生存[30]。近年來，由于環境破壞和水利工程建設等原因，漁業資源呈逐年減少趨勢[31]，因此了解大洋河流域魚類群落的組成和結構有利于稀有瀕危魚類的研究、保護和可持續開發利用。目前針對大洋河魚類研究方法主要為傳統捕撈法，該方法對魚類種群群落具有破壞性，實施過程較為費時、費力，且需要專業研究人員進行分類、鑒定[32]。該研究利用eDNA技術分析了大洋河下游3個區域共9個位點的魚類組成，共檢測到61種魚類，隸屬于9目21科52屬。其中，鰱屬的相對豐度較高，其次為鮫屬和屬。

Fig.4Petal map of OTU of fish species at different sampling sites in the downstream of Dayang River

該研究采用多樣性指標來表征大洋河下游水域的魚類物種多樣性。多樣性指標的大小可以反映物種群落的豐度和多樣性[33]，包括物種豐富度指數、Shannon 多樣性指數和Pielou均勻度指數等。其中，Chao指數和物種豐富度指數表征物種豐度;Shannon多樣性指數、Simpson多樣性指數、ACE指數和Pielou均勻度指數表征物種的豐富度。9個采樣位點中S-1位點具有較高的Chao指數、物種豐富度指數、Shan-non多樣性指數和Pielou均勻度指數，表明相較于其他位點，S-1具有較高的魚類物種豐度和多樣性。除Simpson多樣性指數外，各地點3個位點所有指標的平均值均表現為 K。

10月大洋河水溫呈上升趨勢，而溫度的升高有利于多種喜溫浮游動植物的生長和繁殖，生物多樣性增加，初級生產力提高，有利于魚類的繁衍聚集，因此魚類的多樣性更高[34]。

3.2傳統捕撈法與eDNA技術檢測結果的比較傳統捕撈法與eDNA技術在魚類資源調查中存在一定差異。凌嵐馨等[32]通過環境DNA技術與傳統捕撈法對崇明島內河魚類多樣性進行了調查研究，結果發現eDNA技術檢測到的魚類物種數量多于傳統捕獲法所獲得的物種數量，且檢測的物種多樣性明顯高于傳統捕獲法。根據歷史文獻[4記載，采用傳統捕撈法在大洋河下游共監測到魚類47種，隸屬于22科。與該研究結果相比，相同種類有16種，包括花棒魚（Abbottinarivularis）鯽魚（Carassiuscuvieri）長吻魚骨（Hemibarbuslon-girostris）白鰱（Hypophthalmichthysmolitrix）等;新增了烏原鯉（Procyprismera）異育銀鯽（Carassiusgibelio）矛形蝦虎魚（Acanthogobius hasta）、副鰍（Paramisgurnus dabryanus）等 45種魚類；在歷史文獻中有記載而此次沒有調查到的魚類種類有31種，包括彈涂魚（Periophthalmuscantonensis）、香魚（Plecoglossusaltivelis）黃顙魚（Pelteobagrusfulvidraco姑魚（Johnius belangeri）、烏（Ophiocephalusargus）、日本鰻（Anguillajaponica）和鯰魚（Parasilurusasotus）等（表4）。利用eDNA技術檢測到的魚類種數遠大于傳統捕撈法獲得的魚類種數，造成這種差異的原因可能包含以下方面： ① eDNA技術具有較高的靈敏性，可以檢測到生物量較低的物種[33]； ② 采樣時間間隔較長，大洋河下游的優勢魚類物種和群落組成發生了變化[35]； ③ 魚類習性和環境因素的變化可能影響了魚類多樣性[36]； ④ 由于eDNA測定選擇的引物特異性不強，造成數據庫比對結果存在一定差異，從而導致結果不準確[32]； ⑤ 比對數據庫不夠完整，使測得的序列無法進行比對。該研究發現有7.46% 的物種未能進行分類，這種現象在eDNA技術被廣泛應用于魚類資源調查前就有出現[37]。此外，現有數據庫中還存在大量的錯誤信息，這也影響了研究結果的準確性[7]。

3.3魚類生物量分析凌建忠等[38]研究表明生態系統中生物的eDNA豐度與生物量密切相關，可用于生物量的評估。Tillotson等[39利用eDNA技術評估不同河流中鮭魚的生物量，證實了eDNA技術用于物種生物量評估的可行性。該研究eDNA檢測結果表明，大洋河下游10月魚類的優勢種為鰱屬、鮫屬和屬，其中魴屬主要為刀（C.nasus），相對豐度為 16.08% 。作為一種中小型洄游魚類，刀原產于我國長江地區，與河豚、魚并稱“長江三鮮”。據歷史資料記載我國野生刀資源豐富[40，但近年來由于水利建設、環境污染和過度捕撈等原因，我國野生刀資源銳減，2018年被世界自然保護聯盟（IUCN）列為瀕危魚類[4I]。遼寧是北方地區刀的主要洄游區域，主要包括遼河、大洋河和鴨綠江[42]。目前，僅在大洋河發現小規模刀漁汛[5.43]。刀作為我國重要的經濟魚類之一，近年來對其開展了大規模的放流活動，用來恢復刀魚類資源。該研究在大洋河下游3個地點均檢測到刀魴，并發現其為調查區域的優勢種，表明大洋河水域的刀資源恢復良好。

4結論

該研究利用eDNA宏條形碼技術分析了大洋河下游魚類物種的多樣性，獲得了較為豐富的魚類物種信息，共鑒定出61種魚類，隸屬9目21科52屬。與歷史調查數據相比，該研究發現通過eDNA技術獲得的魚類多樣性高于傳統捕撈法，證實了eDNA技術應用于魚類資源調查的可行性。下一步將繼續擴大采樣范圍和采樣時間，從時間和空間上開展更加全面的大洋河魚類多樣性調查，為大洋河魚類資源的保護、開發和合理利用提供科學依據。

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