小麥條銹菌SNP分子標記的開發與應用

中圖分類號：S435、123 文獻標志碼：A 文章編號：1001-4330（2025）05-1219-07

0 引言

【研究意義】小麥是我國大面積種植的糧食作物之一，其病害防控效果直接影響小麥產量安全[1]。由條形柄銹菌小麥專化型Puccinia strifor-misf.sp.tritici引起的小麥條銹病是影響小麥產量的主要病害之一，傳播方向受氣流影響，最遠可傳播 1700km ，借助降雨或晨露侵染小麥葉片，導致大規模的病害發生，流行年份可造成小麥 40% 的產量損失，甚至造成小麥絕收[2.3]。種植抗條銹病小麥品種是防控小麥條銹病最經濟有效的方法，但抗病品種的培育周期長、耗人力[4-5]。隨著小麥條銹菌新型致病小種的出現，一般抗病品種在3～5年就會喪失抗病性，導致條銹菌的大爆發[6]。因此，對小麥條銹菌群體進行毒性鑒定、小種類型及遺傳結構的研究尤為重要。通過對條銹菌流行區域進行樣品采集，然后利用我國的19個鑒別寄主小麥品種對分離擴繁后的菌株進行生理小種鑒定，可以有效的明確流行區域條銹菌的流行小種的占比及毒性頻率，為抗病品種的選育與品種布局提供依據[7]。但是鑒別寄主實驗的操作繁瑣、耗時長和室內培養誤差大，且無法反應條銹菌在田間的毒性、大區流行體系和遺傳結構[8，利用分子標記技術對條銹菌群體進行遺傳結構分析，可以快速揭示各群體之間的遺傳交流、群體分化及遺傳結構差異。【前人研究進展】隨著分子生物技術的發展，隨機擴增多態DNA（randomlyamplifiedpolymorphicDNA，RAPD）、擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、簡單重復序列（simple sequencerepeat，

SSR）及單核苷酸多態性位點（Single-NucleotidePolymorphism，SNP）等分子標記技術已廣泛應用于小麥條銹菌的群體遺傳研究中[9]。早期的遺傳結構研究中主要使用 PSR 探針[10]、 AFLP^[11] 及RAPD[12]分子標記。隨著條銹菌高通量測序研究的普及，SSR分子標記也隨之出現，擁有多態性高，數量多等優點，很快成為條銹菌群體遺傳分析的主要技術[13]。基于KASP 技術（kompetitive al-lelespecificPCR，KASP）的SNP標記是一種新型的遺傳分析技術，擁有的多態性SNP位點遍及全基因組，可以快速，低成本的對SNP位點進行分型及遺傳分析。目前，僅有利用KASP-SNP技術對我國部分地區的小麥條銹菌群體遺傳結構進行的研究[9，14]，現有的KASP－SNP引物較少，使用范圍存在局限性，針對不同地區的條銹菌群體需要重新篩選合適的KASP-SNP引物。【本研究切入點】SNP位點在全基因組上分布廣泛，可以從大量的SNP位點中挑選出多態性好，分布均勻的位點，并利用這些位點開發出高度特異性的KASP-SNP引物。該方法可以直接提取攜帶條銹菌的小麥葉片DNA進行基因分型檢測，減少條銹菌分離、擴繁等的步驟，降低試驗時間及費用。已有研究發現的KASP-SNP引物數量有限，無法滿足現有研究的需求。【擬解決的關鍵問題】篩選出多態性豐富及分布均勻的SNP位點，并開發成擴增效果佳、特異性強的KASP-SNP引物，補充KASP技術在條銹菌遺傳分析研究的不足。

表1 采樣位置信息

Tab.1 Isolateslocationinformation

1 材料與方法

1.1材料

樣本：2023年5～7月從新疆伊犁河谷采集小麥條銹菌樣本，選取101個菌株進行KASP-SNP基因分型試驗。表1

設備：MatrixArrayer反應板制備儀（成都瀚辰光翼）、MatrixCycler高通量水浴熱循環儀（成都瀚辰光翼）、MatrixScanner高速熒光掃描儀（瀚辰光翼）由新疆維吾爾自治區農業科學院果蔬研究所提供;NanoDrop610分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 小麥條銹菌KASP-SNP引物設計

Bai等以PST-78為參考基因組，對14個小麥條銹菌基因組進行序列比對，篩選出209個SNP位點，用于小麥條銹菌致病基因的基因定位[15]。對209個SNP位點進行篩選，選取最小等位基因頻率 gt;0.4 、檢測率為 100% 、染色體上均勻分布的SNP位點，共篩選出40個SNP位點，使用IGV軟件查找40個SNP位點在PST-78小種基因組上的位置，并截取40個SNP位點的前后各 60bp 的序列，用在線網站（https：//www.primer3plus.com/）進行KASP-SNP引物設計。

1.2.2 條銹菌基因組DNA提取及SNP基因分型

利用CTAB法提取小麥條銹菌基因組DNA^[16] ，將提取后晾干的 DNA 溶于 1×TE 緩存液，使用NanoDrop610分光光度計檢測DNA的濃度和質量， 0D₂₆₀ nm/OD₂₈₀ nm介于 1.8～2.0 ，并稀釋至 50ng/μL 。每對引物96個反應體系配置：2×KASP mix 170μL ;正向引物 F10.51μL ，正向引物 F2 0.51μL ，反向引物 1.36μL;96 個樣品的混合試劑量為 172.38μL ，將混合試劑均勻填加到96個反應孔中后，再向每個反應孔中加入DNA模板 1μL ；平均每個反應體系為 2.8μL_? （2號PCR反應程序： 95^°C 預變性 10min 95°C 變性20s， 61^°C （ -0.6C /循環）退火45s，10個循環；95^°C 變性 20s，55^qC 退火 ^45s，35 個循環。由瀚辰光翼的MatrixCycler高通量水浴熱循環儀進行PCR反應。

1.2.3 KASP-SNP引物多態性檢測及遺傳結構

將101個條銹菌樣本的KASP-SNP基因分型數據轉化成二元基因型數據矩陣，使用POW-ERMARKER3.25軟件計算基因多樣性（Genedi-versity，GD）指數、多態性信息含量（Polymorphicinformationcontent，PIC）指數。為檢測所開發的KASP-SNP引物是否能夠進行有效的遺傳結構分析，利用過STRUCTURE2.3軟件實現，參數K的范圍為 2～10 ，經過15次重復運算后由STRUCTUREHARVESTER在線顯示其最佳數值。

2 結果與分析

2.1 KASP-SNP分子標記基因分型效果

研究表明，引物設計完成后在兩條上游引物的 5^′ 分布添加熒光標簽，即F1：GAAGGTGAC-CAAGTTCATGCT（FAM接頭）和F2：GAAGGTCG-GAGTCAACGGATT（HEX接頭）。18對KASP-SNP引物對所選取的101個條銹菌基因分型。PS1-PS18引物均可以將不同的基因型顯著的區分開，其中大部引物可以檢測出2種基因型，PS5、PS8和PS12等可以檢測出3種基因型。所開發的KASP-SNP引物可以穩定擴增出SNP位點的不同基因型，可用于后期遺傳結構的分析。圖1

圖118對KASP-SNP分子標記引物的基因分型

Fig. 1 Genotyping of 18 pairs of KASP -SNP molecular marker primers

2.2 KASP-SNP分子標記的多態性檢驗

研究表明，基因多樣性指數在 0.174～0.469 5，其中SP16的基因多樣性指數最低，SP12的基因多樣性指數最高，平均值為0.3325。多態性含量指數為 0.162 4～0.359 3 ，同樣為SP16的多態性含量指數最低，SP12的多態性含量指數最高，平均值為0.2735。與SSR引物的多態性相比，設計的18對KASP-SNP分子標記引物的多態性均高于SSR引物。表2

2.3 KASP-SNP分子標記的遺傳結構

研究表明，條銹菌的春麥群體與冬小麥群體在遺傳結構上存在一定的差異。其中春小麥群體以綠色類群為主，而冬小麥群體中大部分為紅色類群。所開發的KASP-SNP分子標記引物可以有效的區分小麥條銹菌群體之間的遺傳結構差異。表3，圖2

表2 18對KASP-SNP分子標記引物信息

Tab.2 Informationof18pairsofKASP-SNP

續表2 18對KASP-SNP分子標記引物信息 Tab.2 Informationof18pairsofKASP-SNP

表318對KASP-SNP分子標記引物多態性指數

Tab.3 Polymorphismindexof18pairsof KASP-SNPmolecularmarkerprimers

3討論

3.1小麥條銹菌是遠距離傳播的氣傳病害，通過解析條銹菌的遺傳結構、基因交流，有助于明確條銹菌的傳播路線和起源進化[17]。目前條銹菌群體遺傳結構研究的主流方法是通過SSR分子標記技術來完成，與SSR分子標記技術相比，KASP-SNP分子標記可通過條銹菌基因組上大量的SNP位點來開發，引物數量遠高于SSR引物，并且可以篩選出高度特異性的引物，可直接從攜帶病菌的葉片上提取DNA進行基因分型試驗。

3.2通過對條銹菌進行群體遺傳結構分析，可以揭示各條銹菌群體間的遺傳差異，將各群體劃分為不同的類群。有研究通過SSR分子標記對我國甘肅[18]、四川[19]、云南和貴州[20]等省的條銹菌進行遺傳結構分析，結果表明，由于不同的小麥種植區用有不同的地形、氣候等環境條件，使得不同地區的條銹菌群體在遺傳結構上存在一定差異。研究所開的18對KASP-SNP分子標記引物對春小麥和冬小麥的條銹菌群體進行遺傳結構分析，發現春小麥和冬小麥的條銹菌群體在遺傳結構上存在較大差異，能顯著劃分春小麥和冬小麥的條銹菌群體。

3.3孟巖等8開發了43對KASP-SNP分子標記，并與13對SSR引物的多態性指數進行對比，基因多樣性指數與多態性含量指數均高于SSR引物。將試驗所開發的18對KASP-SNP引物與孟巖[8]研究中的13 對 SSR 引物就進行比較，KASP-SNP引物的多態性指數也高于SSR引物。因此，遺傳結構和引物多態性分析的結果一致表明所開發的KASP-SNP引物對遺傳結構研究的有效性。使其能夠有效的對新疆小麥條銹菌群體進行遺傳結構研究。

4結論

春小麥群體 冬小麥群體選取基因組上分布均勻、多態性豐富的SNP位點，并開發出18對分型效果佳、擴增穩定和多態性豐富的KASP-SNP引物，引物多態性指數和遺傳結構檢驗均能滿足小麥條銹菌的遺傳多樣性及遺傳結構分析。

參考文獻（References）

[1]康振生，王曉杰，趙杰，等．小麥條銹菌致病性及其變異研 究進展[J]．中國農業科學，2015，48（17）：3439-3453. KANG Zhensheng，WANGXiaojie，ZHAO Jie，etal.Advances in research of pathogenicityand virulence variation of the wheat stripe rust fungusPuccinia striformis f.sp. tritici[J].Scientia Agricultura Sinica，2015，48（17）： 3439-3453.

[2]Chen X M. Epidemiology and control of stripe rust[Puccinia striformis f.sp. tritici]on wheat[J]. Canadian Journalof Plant Pathology，2005，27（3）：314-337.

[3]Welings C R. Global status of stripe rust：a review of historical and current threats[J].Euphytica，2011，179（1）：129-141.

[4］趙杰，鄭丹，左淑霞，等．小麥條銹菌有性生殖與毒性變異 的研究進展[J].植物保護學報，2018，45（1）：7-19. ZHAO Jie，ZHENG Dan，ZUO Shuxia，etal.Research advances in alternate host and sexual reproductionofwheat yellow rust pathogen Puccinia striformis f.sp. tritici Erikss.et Henn[J]. Journal ofPlantProtection，2018，45（1）：7-19.

[5]LuN H，Wang JF，Chen X M，et al. Spatial genetic diversity and interregional spread of Puccinia striformisf.sp.tritici in Northwest China[J].European Journalof Plant Pathology， 2011，131（4） ： 685 -693.

[6］陳萬權，康振生，馬占鴻，等．中國小麥條銹病綜合治理理 論與實踐[J].中國農業科學，2013，46（20）：4254-4262. CHEN Wanquan，KANG Zhensheng，MA Zhanhong，etal. Integrated management of wheat stripe rust caused by Puccinia striiformis f.sp.tritici in China[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2013，46（20）：4254-4262.

[7]Chen L，Awais M，Yang H，et al. Races CYR34 and Suwon11 -1 of Puccinia striiformis f.sp. tritici played an important role in causing the striperust epidemic inwinterwheatin Yili，Xin jiang，China[J]. Journal of Fungi，2023，9（4）：436.

[8］孟巖，楊彩柏，姜舒暢，等．基于KASP技術的小麥條銹菌 SNP分子標記開發與評價［J]．植物保護學報，2020，47 （1）： 65-73. MENG Yan，YANG Caibo， JIANG Shuchang，et al.Development and evaluation of SNP molecular markers of wheat stripe rust based on KASP technology[J]. Journal of Plant Protection， 2020，47（1）： 65-73.

[9]Ju M，Liu W，Wang L，et al. Two main routes of spore migration contributing to the occurrence of wheat stripe rust in the Jiangsu and Zhejiang coastal sporadic epidemiological region in 2019， based on phenotyping and genotyping analyses[J].Plant Disease，2022，106（11）：2948-2957.

[10]ShanWX，ChenSY，KangZS，etal.Geneticdiversityin Puccinia striiformisWestend.f.sp. tritici revealed by pathogen genome-specific repetitive sequence[J]. Canadian Journal of Botany，1998，76（4）：587-595.

[11]LiangJM，LiuXF，LiY，etal.Populationgeneticstructure andthemigrationofPuccinia striiformis f.sp. tritici between the Gansuand Sichuan basinpopulations of China[J].Phytopathology，2016，106（2）：192-201.

[12］單衛星，陳受宜，吳立人，等．中國小麥條銹菌流行小種的 RAPD分析[J].中國農業科學，1995，28（5）：1-7. SHANWeixing，CHEN Shouyi，WU Liren，et al.RAPD analysisofepidemicracesofPuccinia striiformisf.sp. tritici inChina [J].Scientia AgriculturaSinica，1995，28（5）：1-7.

[13]Ali S，Gladieux P，Leconte M ，etal.Origin，migrationroutes andworldwide population genetic structure of the wheat yellow rustpathogenPuccinia striiformisf.sp. tritici[J].PLoSPathogens，2014，10（1）：e1003903.

[14］楊彩柏．基于毒性表型及SNP標記的西藏小麥條銹菌群體 遺傳分析[D]．楊凌：西北農林科技大學，2019. YANG（Cai）（BailBo）.Population Genetic Analysisof Puccinia striiformistriticiin Tibet Basedon VirulencePhenotypeand SNP Marker[D].Yangling：NorthwestAamp;FUniversity，2019.

[15]BaiQ，WangMN，XiaCJ，etal.Identificationofsecreted protein gene-based SNP markers associated with virulence phenotypes of Puccinia striformis f.sp. tritici，the wheat stripe rust pathogen[J].InternationalJournalofMolecularSciences，2022， 23（8）：4114.

[16]AliS，GautierA，Leconte M ，et al.A rapid genotyping method foranobligate fungalpathogen，Pucciniastriiformisf.sp.tritici， based on DNA extraction from infected leaf and Multiplex PCR genotyping[J].BMCResearchNotes，2011，4：240.

[17]JiangBB，Wang C C，Guo C W，et al.Genetic Relationships ofPucciniastriiformis f.sp. tritici in Southwestern and NorthwesternChina[J].MicrobiologySpectrum，2022，10（4）： e0153022.

[18］陸寧海，詹剛明，王建鋒，等．我國小麥條銹菌體細胞遺傳 重組的分子證據[J]．植物病理學報，2009，39（6）：561- 568. LUNinghai，ZHANGangming，WANGJianfeng，etal. Molecularevidence of somaticgeneticrecombinationofPuccinia striiformisf.sp.tritici in China[J].Acta Phytopathologica Sinica， 2009，39（6）：561-568.

[19]WangSH，GaoCF，SunQY，etal.Geneticcharacterization ofPuccinia striiformis f.sp.tritici populations from different wheat cultivars using simple sequence repeats[J].Journal of Fungi，2022，8（7）：705.

[20]HuangL，YangH，XiaCJ，et al.Long-Distance Transport of Puccinia striiformisf.sp.triticibyUpperAirflowon theYunnan - Guizhou Plateau Disrupts the Balance of Agricultural Ecology inCentral China[J].PlantDisease，2022，106（11）：2940- 2947.

Development of SNP molecular markers applied to genetic structure analysis of wheat stripe rust fungus

LAI Hailin1， LI Jin² ， SHEN Yuyang2，DE Feifei2， YANG Hong3，LI Guangkuo2，LI Yue1，GAO Haifeng2

（1. Xinjiang Key Laboratory for Ecological Adaptation and Evolution of Extreme Environment Biology， College of Life Sciences， Xinjiang Agricultural University，Urumqi 83Oo52，China; 2.Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crop in Northwestern Oasis ， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Institute of Plant Protection，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830091，China; 3. Colege of Agronomy，Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052， China）

Abstract：【Objective】 This project aims to develop new KASP -SNP primers to reveal the diffrences in genetic structure among Puccinia striformis f.sp.trititc populations in diferent endemic regions.【Methods】 On the basis of existing SNP loci，we screened SNP loci with suballele frequency gt;0.4 and designed KASPSNP primers to analyze the genetic structure and primer polymorphisms of spring and winter wheat Pucinia striformis f.sp.trititc in the Ili River Valley.【Results】Eighteen pairs of KASP-SNP primers with stable amplification and obvious genotyping effect were finallyselected，there were certain geneticdiffrences between the spring and winter wheat stripe rust populations in the Ii River Valley，and the polymorphic information content index of the18 pairs of primers averaged O.273，5，and the gene diversity index averaged 0.332， 5，which was higher than the SSR average diversity index.【Conclusion】 The 18 pairs of KASP-SNP primers developed in this study are rich in polymorphism andcan be used to analyze the population genetic structure of Puccinia striformis f. sp. trititc.

Key words：wheat stripe rust； SNP molecular marker;genetic structure; KASP technique