巴戟天種質資源SCoT分子標記遺傳多樣性分析

關鍵詞：巴戟天；種質資源；SCoT；遺傳多樣性；聚類分析；mantel檢驗中圖分類號： S567.1Σ⁺90.32 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）11-0031-08

巴戟天（MorindaofficinalisHow）為茜草科巴戟天屬植物，其干燥根入藥，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功效，主治陽痿遺精、月經不調等病癥[1]。近年來，隨著人們生活水平的提高，巴戟天作為“藥食兩用”性中藥，市場需求量急劇增加，供不應求，導致人們過度采挖，使得巴戟天野生資源已接近枯竭，其商品藥材絕大多數來源于栽培，經過長期的自然選擇和人工嫁接，種質資源已經分化[2。關于巴戟天種質資源的研究，有學者采用RAPD[3]、ISSR[4]、SRAP和CDDP分子標記[5]進行研究，但多為一代分子標記技術。目標起始密碼子多態性（SCoT）是基于PCR擴增的二代分子標記技術，是由Collard等開發的一種新穎的標記技術[]，基于基因的ATG翻譯起點相應的側翼序列設計引物，該方法結合了前述分子標記技術的優勢，具有操作簡單、重復性好、多態性高等優點，可作為RAPD等傳統分子標記的有效補充[7]。SCoT分子標記在各類植物上都有較強的通用性，近年來SCoT分子標記已在廣西葛根[8]、地黃[9]、廣藿香[10]、白芨[]、枸杞[12]青錢柳[13]、金線蓮[14]、梔子[15]等多種中藥材的遺傳多樣性分析研究中得以應用，而國內外未見有關于巴戟天SCoT分子標記研究的文獻報道。

本試驗選用條帶清晰、多態性好的7條SCoT引物對32個居群巴戟天的遺傳多樣性進行分析，了解不同居群間的親緣關系，以期為新品種選育、優良基因的挖掘提供參考依據。

1材料與方法

1.1 試驗材料

183份巴戟天樣品分別于2023年采集自廣西、廣東、福建和海南4個省份32個居群，樣品清洗后置于含硅膠的密封袋中，于 -20^°C 冰箱中保存，樣品信息見表1。巴戟天經廣西中醫藥大學戴忠華副教授鑒定為茜草科巴戟天屬巴戟天。

1.2 試驗儀器與試劑

試驗儀器與試劑包括梯度PCR儀（美國Bio-

Rad公司）凝膠成像儀（GelLogic）、天根植物DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司） .2×Hieff PCRMasterMix（上海翌圣生物科技股份有限公司）、GelRed染料（Biotium）、瓊脂糖（BioFroxx）、5×TBE 緩沖液（北京索萊寶生物科技有限公司）。

1.3總DNA提取及檢測

按照試劑盒DNA提取方法提取巴戟天總DNA，提取產物經 1% 凝膠電泳檢測；采用超微量紫外分光光度計檢測巴戟天總DNA純度及其濃度，并將樣品濃度稀釋到濃度為 20ng/μL ，置于 -20°C 冰箱中保存。

1.4 引物篩選

83條引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其中36條引物為參照Collard等的研究開發的通用引物，47條引物為自設引物，以183份巴戟天樣品進行引物篩選，對PCR產物進行凝膠電泳檢測，篩選出條帶清晰、多態性好的引物進行PCR擴增。

1.5 PCR擴增與產物檢測

PCR反應體系 （20μL）：0. 5μLDNA 模板（ 20μg/mL ）， 1μL 上、下游引物 ?10μmol/L ）， 8μL 2× Hieff PCR Master Mix， ddH₂0 加至 20μL ;PCR程

序 ：95C3min;95C25s，52.2C60s，72C 110s，45個循環； 。PCR產物置于1.0% 瓊脂糖凝膠中檢測。

1.6 數據與統計

對凝膠電泳圖進行分析，以條帶有無為依據，將電泳圖轉化為“1”“0”矩陣表。通過POPGENE32軟件分析Nei's基因多樣性指數 （H） 等遺傳信息參數。基于居群間遺傳相似度矩陣，利用NTSYS2.10進行聚類分析。應用GENALEX軟件對巴戟天居群的地理距離、遺傳距離進行mantel檢驗，分別用于檢測個體間的相互關系和地理距離、遺傳距離的相關性。

2 結果與分析

2.1擴增產物的多態性

使用7條SCoT引物對183份樣品進行擴增，部分引物（SCoT-51）的瓊脂糖凝膠電泳擴增結果如圖1所示，不同引物的多態性位點指數如表2所示。

總擴增條帶位點均值為15.2857，最高的是引物SCoT-35（20），最低的是引物SCoT-51（13）；多態性位點最高的是引物SCoT-35（20），最低的是引物SCoT-51（8），均值為14.4281;多態性位點占比均值為 94.39% ，引物SCoT-51最低 （61.54% ），其次是引物SCoT-77（92. 86% ），其余5條引物多態性位點占比均最高（ 100.00% ）。

2.2不同居群的樣品遺傳多樣性分析

32個巴戟天居群的遺傳多樣性指數見表3。在物種水平上，等位基因數 （N_a）=1.943 9 ，有效等位基因數 （N_e）=1. 6853 ，Nei's基因多樣性指數（H）=0，3742 ，Shannon's信息指數 （I）=0.541 7 ：在各栽培居群遺傳多樣性指數的平均值， N_a= 1.5592，N_e=1.3954，H=0.2223，I=0.3248 ；在各野生居群遺傳多樣性指數的平均值， N_a=1.6154 ，N_e=1.4583，H=0.2521，I=0.3651 。整體上，野生居群遺傳多樣性高于栽培居群。

巴戟天各居群擴增出的多態性位點數在 38～ 82之間，廣東陽江市（YJ）居群擴增位點數最高，多態性比率為 76.64% ，說明廣東陽江市（YJ）居群巴戟天的遺傳多樣性比較高;廣東博羅（BL）僅擴增出38個多態性位點，為多態性位點數最少的居群，其多態性比率為 35.51% 。所研究的32個居群巴戟天物種水平多態性比率為 94.39% ，表明32個巴戟天居群資源間的遺傳多樣性較高。

基于 H 來看， H 在巴戟天各居群的變化范圍在0.143 3～0.310 2 ，居群水平平均值為0.2344，其中，廣東陽江市（YJ）、福建平和（PH）、廣西浦北（PB）等居群的Nei's基因多樣性指數較高，分別為0.3102.0.3099.0.2883 ，上述居群均為野生品種，說明巴戟天居群間存在著遺傳差異，且野生居群遺傳多樣性水平相對較高。Shannon信息指數（I）在0.2095～0.4499 之間，平均水平為0.3411，其中，廣東陽江市（YJ）、福建平和（PH）、廣西浦北（PB）居群的shannon多態信息指數 I 較高，分別為0.4499.0.4446.0.4163 。

2.3種質的遺傳分化

根據POPGENE32軟件對巴戟天居群Nei's基因多樣性指數的分析結果，32個巴戟天居群的居群總基因多樣性（ ?H_t ）值為0.3721，居群內基因多樣性 （H_s） 值為0.2344。居群間遺傳分化系數（ G_st 值為 0.3700gt;H_s ，巴戟天居群間的遺傳分化高于居群內；基因流 N_m 值為 0.8512lt;1 ，則表明32個居群之間基因交流不頻繁。

2.4相似度與遺傳距離的分析

根據32個居群之間的遺傳距離 （D） 和遺傳相似度 （I） （表4）可知，巴戟天的居群遺傳距離存在一定差異，總體范圍在 0.054 0～0.401 4 之間，廣東陽江市（YJ）居群與廣東茂名市（MM）居群之間遺傳距離最小，廣西八步區（BBQ）居群與海南樂東市（LD）居群之間遺傳距離最大；遺傳相似度范圍在 0.6694～0.9474 之間，其中廣東陽江市（YJ）居群與廣東茂名市（MM）居群之間的遺傳相似度最大，為0.9474，廣西八步區（BBQ）居群與海南樂東市（LD）居群之間的遺傳相似度最小，為0.6694。

2.5 NTSYS聚類分析

采用NTSYS2.10軟件根據居群間的遺傳相似度對不同產地巴戟天進行聚類分析，結果見圖2。遺傳相似度在0.79時，32個巴戟天居群分為2類，第1類包括海南瓊中縣（QZ）、海南五指山市（WZS）、海南樂東市（LD）、海南儋州市（DZ）和海南保亭縣（BT）5個居群，在遺傳相似度為0.83時聚為一支，它們均產自海南，且為野生種質;第2類包括廣東、廣西和福建的27個居群。遺傳相似度在0.82時，廣西賀州八步區（BBQ）廣西梧州波塘鎮（BTZ）廣西防城港市大菉鎮（DL）廣西防城港市東興市（DX）、廣西梧州市藤縣（TX）、廣東省揭陽市普寧市（PN）、廣西藥用植物園（NN）居群聚為一支，DL、DX為野生種質，其他5個居群的巴戟天為栽培品；當遺傳相似度在0.84時，廣西的5個栽培居群聚為一支；遺傳相似度在0.85時，廣東德慶縣（DQ）、廣東惠州博羅縣（BL）、廣東肇慶高要區（GY）、福建龍巖市（LY）、福建漳州云霄縣（YX）、廣東云浮郁南縣（YN）居群聚為一支，這6個居群的巴戟天均為栽培品；遺傳相似度為0.87時，5個野生居群福建平和縣（PH）、廣西浦北縣（PB）、廣東陽江市（YJ）、廣東茂名市（MM）和廣東廣寧縣（GN）居群聚為一支；遺傳相似度為0.89時，廣西的2個野生居群廣西防城港市那良鎮（NL）和廣西容縣（RX）居群聚為一支。聚類分析中，同為野生種質或同為栽培種質的樣品之間遺傳相似度更高，親緣關系更近，地理距離相近的樣品親緣關系也更為接近。

2.6遺傳距離與地理距離相關性的mantel檢驗

mantel檢驗結果（圖3）顯示， r=0.261 4，P= 0.001lt;0.05 ，說明巴戟天遺傳距離與地理距離存在著顯著相關性，巴戟天各居群間的遺傳變異會受地理隔離的影響，這也支持了聚類分析（UPGAM）的分析結果。

3討論與小結

本研究采用SCoT標記對不同產地巴戟天樣品進行分析，7條SCoT引物共擴增條帶107條，多態性條帶101條，多態性百分比為 94.39% ;Nei's基因多樣性指數 （H） 為0.3742、Shanmon's信息指數 （I） 為0.5417，說明巴戟天種質資源遺傳多樣性豐富，SCoT法適用于巴戟天樣品的遺傳多樣性分析。另外，栽培居群 H=0，222 3，I=0.324 8 ，野生居群H=0.252 1.I=0.365 1 ，說明野生巴戟天遺傳分化程度較栽培品高，有學者指出，植物的繁育方式是影響遺傳多樣性的主要因素[16-17]。野生巴戟天為有性繁殖，栽培品多以扦插的無性生殖方式進行繁衍，有性繁殖可傳遞親本的遺傳信息，利于基因重組和基因突變，使得野生巴戟天居群具有較高的遺傳多樣性；但是，栽培居群的遺傳多樣性沒有明顯低于野生居群，這可能是由于巴戟天栽培歷史悠久，可以追溯至18世紀初[18]，在長期栽培過程中進行了多次選擇和優化，從而形成了具有較高遺傳多樣性的栽培居群。

聚類分析表明，遺傳相似度在0.83時，5個海島居群聚為一支，瓊州海峽將海南島與其他地區隔開，導致海南島5個居群與廣東、廣西和福建的27個居群遺傳分化較大，呈現出地理隔離對巴戟天遺傳分化的影響;遺傳相似度在0.84時，來自廣西的5個居群的巴戟天聚為一支，說明產地對巴戟天樣品間遺傳分化也產生了影響。

聚成一支的5個海南居群都是野生種質；遺傳相似度在0.878時，來自廣西的1個居群、福建的1個居群和廣東的3個野生居群聚為一支；遺傳相似度在0.89時，廣西的2個野生居群聚為一支。遺傳相似度在0.82時，來自廣西的6個居群與廣東的1個栽培居群聚為一支;遺傳相似度為0.85時，來自廣東4個栽培居群和福建的2個栽培居群聚為一支。聚類分析結果表明，同為野生種質或同為栽培種質的樣品之間遺傳相似度更高，親緣關系更近。廣東、廣西和福建的多個栽培居群遺傳距離較近，各栽培居群間遺傳分化受地理分布因素影響較弱，可能是由于巴戟天栽培品多以扦插的方式進行繁殖，且多數種苗來自廣東德慶，導致栽培品基因穩定，變異較少，造成遺傳背景相似[19]，使得巴戟天栽培品居群間遺傳分化地域性不明顯。本研究揭示巴戟天種質資源遺傳分化情況，為巴戟天種質資源的保護、良種繁育和栽培以及巴戟天藥材的質量研究提供理論參考和科學依據

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