沙棘枝干總黃酮的提取和抗氧化活性研究

中圖分類號R285文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號 0517-6611（2025）11-0172-09

doi：10.3969/j. issn. 0517-6611.2025.11.037開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Extractionand Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Sea-buckthorn Branches and Stems

XU Xuan， SHEN Yan，CHEN Yin （Zhejiang Ocean University，Zhoushan，Zhejiang 316000）

AbstractUsingsea-bucktobrancesasrmaterials，teetractionprocessoftotalfavonoidsasotiizedusinsinglefactorprmentsandresposesfaceethdology，nditsprotetieectolohlicliverjury（A）wssudiedTeesultssowdatetotal flavonoid content in the branches and trunks of sea-buckthorn was 0.64% . The optimal extraction process for total flavonoids from sea-buckthorn branches was ultrasonic frequency of 50kHz ，powerof 2OoW，extraction temperatureof 55^°C ，liquid-material ratio of 23：1，ethanol concentration of 61% ，extraction time of 2 hours.Under these conditions，the total flavonoid extraction amount was 4 .19mg/g . Total flavonoids were purified and enriched using X-5 macroporous resin. In vitro antioxidant tests showed that the 40% ethanol purified product had the best antioxidantactivity.ThescavengingratesofDPPH，ABTS，hydroxylandsuperoxideanionradicalswere3.17，37.O6，792.51and （204號 262.42μg/mL ，respectively.Cellexperimentsshowedthattotalflavonoids fromsea buckthornbranchescould effctivelyreduce thedamageof ethanol to HepG2 cells，and protect HepG2 cells through the Keapl/Nrf2/HO-1 pathway.

KeywordsSea-buckthorn branches;Total flavonoids;Extraction;Antioxidant activity

沙棘（HippophaerhamnoidesLinn.）又稱為酸棗、醋柳等，是胡頹子科沙棘屬的一種落葉性灌木漿果植物[1]，主要分布于我國西南和西北地區(qū)[2]，被視為一種藥食同源食物?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究，沙棘可降低膽固醇、緩解心絞痛發(fā)作和防治冠狀動脈粥樣硬化性心臟，可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激和自由基的傷害以及抑制癌細(xì)胞生長擴(kuò)散[3]。沙棘的根、莖、葉、花、果特別是果實(shí)含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，包括多糖、脂肪酸、氨基酸、甾醇類、黃酮類和多酚類等[4]，可以廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等國民經(jīng)濟(jì)的許多領(lǐng)域。果實(shí)人藥具有正咳化痰、健胃消食、活血散瘀之功效，而且自前對沙棘的開發(fā)利用主要集中在果實(shí)中的多糖和黃酮類成分以及沙棘籽中的油脂類成分。由于沙棘特殊的采收方式以及修剪方式會產(chǎn)生大量的沙棘枝干和樹葉，對沙棘枝干中活性成分的研究和開發(fā)利用將有助于沙棘資源的充分利用和深度開發(fā)。

肝損傷是肝臟在各因素影響下觸發(fā)的損傷反應(yīng)，酒精性肝損傷（ALI）是較為常見的一種，其患者肝功能指標(biāo)會出現(xiàn)明顯異常，如谷丙轉(zhuǎn)氨酶、轉(zhuǎn)肽酶和白細(xì)胞數(shù)量會有明顯升高[5]。人飲酒后，多數(shù)酒精進(jìn)人肝臟進(jìn)行分解，其中的代謝分為主要的氧化途徑和次要的非氧化途徑。酒精本身及酒精氧化代謝產(chǎn)生的乙醛和自由基等中間產(chǎn)物是影響人體健康的主要因素，它們以多種方式共同作用誘導(dǎo)細(xì)胞壞死和組織產(chǎn)生免疫反應(yīng)，激活炎癥，從而造成肝損傷[。已有研究表明，與ALI有關(guān)的通路和靶點(diǎn)包括IL-6/STAT3炎癥信號通路[7] TGF-β1/Smad 信號通路[8]、PERK/eIF2α 通路[9]Bcl-2/Bax信號通路[10]、脂聯(lián)素信號通路[1]、AMPK/SIRT1信號通路[12] NF-κB 信號通路[13]、庫普弗細(xì)胞活化信號通路[14]、JAK/STAT信號通路[15]等。

很多物質(zhì)如維生素和動植物天然活性成分對酒精性肝損傷具有保護(hù)作用，包括多肽、萜類、黃酮類、多酚類、多糖類等[16]，主要是這些物質(zhì)具有毒性小、副作用少、參與多途徑和多靶點(diǎn)等優(yōu)點(diǎn)，其作用機(jī)理主要是與酒精代謝過程中產(chǎn)生的醛類結(jié)合或者清除酒精代謝產(chǎn)生的過剩自由基。而且黃酮類化合物大量存在于各種天然來源的植物中，根據(jù)結(jié)構(gòu)可分為六大類即黃酮類、黃酮醇類、兒茶素、黃烷醇類、花青素類和異黃酮類[17]。研究者們用各種技術(shù)對沙棘不同部位提取物進(jìn)行了分離和鑒定，發(fā)現(xiàn)提取物中富含黃酮類成分[18]，主要包括蘆丁、槲皮素、異鼠季素、山柰酚等昔元及其與葡萄糖和鼠李糖等組成的糖苷?；诖?，該研究以沙棘枝干為原料，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化其總黃酮提取工藝并研究其對ALI的保護(hù)作用，以期為沙棘枝干的高效利用和后期藥物的開發(fā)提供參考。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1試材。沙棘枝干采摘自新疆，清洗后， 50^qC 烘至恒重，粉碎。索氏提取法脫脂后備用，同時留下未脫脂部分測定其脂肪含量。人肝腫瘤細(xì)胞HepG2購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.2試劑。石油醚、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、六水合氯化鋁、無水乙醇、蘆丁、鹽酸均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水飛薊素、轉(zhuǎn)膜液、緩沖液、細(xì)胞增殖和毒性（CCK-8）檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司；HepG2細(xì)胞專用培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技有限公司；胰蛋白酶-乙二胺四乙酸購自賽文創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.1.3儀器與設(shè)備。藥材粉碎機(jī)（濟(jì)南慧峰機(jī)械設(shè)備有限公司）;MSA225S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；-80°C 冰箱（賽默飛科技中國有限公司）；TGL-16G離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器有限公司）；SK5210LHC超聲清洗機(jī)（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；烘箱（滄州翰銘儀器設(shè)備有限公司）;脂肪測定儀（山東云唐智能科技有限公司）；分光光度計(jì)（上海穩(wěn)贏機(jī)電設(shè)備有限公司）;Multisjan酶標(biāo)儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1主要營養(yǎng)成分和活性成分測定。

1.2.1.1 水分。采用直接干燥法[19]，精密稱取原料 5.00g ，平鋪于皿中，在 100^°C 下干燥 5h ，將蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻，精密稱定重量。再在 100^°C 干燥1h，冷卻，稱重，至連續(xù)2次稱重的差異不超過 5mg 。根據(jù)損失重量，計(jì)算原料中水分的含量。

1.2.1.2 灰分。準(zhǔn)確稱取 5.00g 原料，用直接灰化法[20]測定灰分含量。

1.2.1.3脂肪。用索氏提取法測定脂肪含量[21]。將提取杯烘干，準(zhǔn)確稱取提取杯質(zhì)量，將未脫脂的原材料用濾紙包好，每份 ，石油醚為提取溶劑，放入提取杯后，以 60^°C 在脂肪測定儀上進(jìn)行加熱回流提取，直至石油醚無色，將提取杯中剩余少量石油醚旋蒸干，稱取提取杯質(zhì)量，計(jì)算前后差異和脂肪含量。

1. 2. 1. 4 總多糖。

（1）樣液提取。準(zhǔn)確稱取 1.00g 脫脂原料，與 20mL 純水一起加入容器混勻，在沸水中提取 30min ，反復(fù)提取3次，提取液過濾合并后純水定容到 50mL 并冷卻得到樣液。

（2）含量測定。采用苯酚硫酸法[22]測定總多糖含量。將 10mg 葡萄糖溶于 100mL 純水配制成 0.1mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，分別吸取 0.100，200，300，400 和 500μL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入試管，用純水稀釋到 500μL ，加入 300μL 的 6% 苯酚和 1.5mL 的濃硫酸，搖勻，沸水浴 15min ，冷卻后在490nm 波長下測定吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用相同方法測定樣液吸光度并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得到總多糖含量。

1.2.1. 5 蛋白質(zhì)。

（1）樣液提取。取脫脂后的原料 1.00g ，加 20mL 純水混勻，在 50^qC 條件下浸泡 ^1h ，然后常溫超聲提取 30min ，離心收集上清，過濾。共提取2次，合并2次濾液并用純水定容到 50mL 。

（2）含量測定。采用考馬斯亮藍(lán)法[23]測定蛋白質(zhì)含量。配制 0.200，400，600，800 和 1000μg/mL 牛血清蛋白溶液，每個試管加人 0.1mL 蛋白溶液和 5mL 考馬斯亮藍(lán)G250溶液，搖勻后常溫放置 2min ，在 595nm 測定吸光度，以牛血清蛋白在體系中的濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用相同方法測定樣液吸光度并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得到蛋白質(zhì)含量。

1. 2. 1. 6 總黃酮。

（1）樣液提取。將脫脂后的樣品稱取 1. 00g ，加入25mL 的 60% 乙醇混勻，超聲提取 1.5h ，離心取上清液，再加人 25mL 的 60% 乙醇混勻，超聲提取同樣時間，如此反復(fù)3次，合并3次上清并用 60% 乙醇定容到 100mL 備用。

（2）含量測定。采用氯化鋁法[24測定總黃酮含量。取0.010g 蘆丁，用少量 60% 乙醇溶解后，加人 60% 乙醇定容至100mL ，混合均勻得濃度為 0.1mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別精密吸取的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 和 0.6mL 于EP管中，分別加入 5% 三氯化鋁溶液 0.5mL ，混勻后用 60% 乙醇定容至刻度，搖勻，室溫下靜置 10min 。以不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液為空白對照，于 400nm 波長下測定吸光度，以顯色液中蘆丁質(zhì)量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用相同方法測定樣液吸光度并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得到總黃酮含量。

1.2.2總黃酮提取條件優(yōu)化試驗(yàn)。選擇效率高、結(jié)果穩(wěn)定的超聲波水浴提取法，溶劑為乙醇水混合溶液，超聲波頻率為50kHz ，功率為 200W 。選擇提取時間、提取溫度、液料比和乙醇濃度這4個因素進(jìn)行試驗(yàn)，每個單因素試驗(yàn)重復(fù)3次。

乙醇濃度因素：稱取 1.00g 脫脂過的原料，乙醇濃度設(shè)置為 20%.40%.60%.80%.100% ，在提取時間 ^2h 提取溫度50^qC 和液料比 20：1（mL：g） 條件下提取，所得溶液離心過濾，測定總黃酮提取率。

提取時間因素：提取時間設(shè)置為 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5， 3.0h ，在乙醇濃度 60% 、提取溫度 50^qC 和液料比 20：1 條件下提取，所得溶液離心過濾，測定總黃酮提取率。

液料比因素：液料比設(shè)置為 21，在乙醇濃度 60% 、提取溫度 50^qC 和提取時間 ^2h 條件下進(jìn)行，所得溶液離心過濾，測定總黃酮提取率。

溫度因素：提取溫度設(shè)置為 40，45，50，55，60^°C ，在乙醇濃度 60% 液料比 20：1 和提取時間 ^2h 條件下進(jìn)行，所得溶液離心過濾，測定總黃酮提取率。

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇濃度、液料比和溫度進(jìn)行響應(yīng)面法的設(shè)計(jì)和試驗(yàn)。用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化，根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，得出總黃酮最佳提取工藝方案。

1.2.3總黃酮的純化。將沙棘枝干總提取物旋蒸濃縮，加入5倍體積的乙醇，醇沉除去多糖和蛋白，繼續(xù)濃縮并冷凍干燥形成粉末。上樣前用純水溶解并加入少許乙醇稀釋成濃度為 1mg/mL 左右。濕法上柱，填料為X-5大孔樹脂，上樣 30mL ，吸附 1.5h ，先用4倍純水沖洗，再分別用2倍20% 40% ） 60% ） 80% 、 100% 乙醇洗脫。收集洗脫液，濃縮凍干，并檢測其中的總黃酮含量。

1.2.4 體外抗氧化活性。

1.2.4.1DPPH自由基清除能力測定。配制 0.1mmol/L 的DPPH醇溶液和 0.5mg/mL 的 v_c 水溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配，避光保存。配制一定濃度的樣品溶液，樣品組為樣品溶液 100μL 中加入DPPH醇溶液 100μL ；空白組為樣品溶液 100μL 中加入無水乙醇 100μL ；對照組為DPPH醇溶液 100μL 中加人純水 100μL 。溶液混合搖勻后，在 517nm 測吸光度，以v_c 為陽性對照[25]。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

清除率 =[1-（A_s-A_b）/A_c]×100% 式中： Ω_：As 為樣品組吸光度； A_b 為空白組吸光度； A_c 為對照組吸光度。1.2.4.2ABTS自由基清除能力測定。將 5mL 的 7mmol/L ABTS[2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽]和 88μL 的 140mmol/L 過硫酸鉀混合，在室溫、避光的條件下靜置過夜，形成自由基儲備液。使用前用無水乙醇稀釋成工作液，要求其在 30^qC.734nm 波長下的吸光度為0.7。取100μL 不同濃度的樣品乙醇溶液，加入 2mL 的ABTS溶液，振蕩，在 734nm 測定反應(yīng)液的吸光度，以 v_c 為陽性對照[26]ABTS自由基清除率計(jì)算公式如下：

清除率 =（A_c-A_s）/A_c×100% 式中： A_s 為樣液和ABTS溶液混合后的吸光度； A_c 為無水乙醇和ABTS溶液混合后的吸光度。1.2.4.3羥基自由基清除能力測定。取 50μL 不同濃度的樣品溶液，依次加入 50μL 的 FeSO₄ 水溶液（ 6mmol?L ）、100μL 的 H₂O₂ 水溶液（ 6mmol/L ），充分搖勻后，室溫放置10min ，加人 50μL 水楊酸溶液 （ 6mmol/L ），溶劑為乙醇，充分搖勻后，室溫放置 30min 。然后以 4 000r/min 離心10min ，取上清液，在 510nm 測吸光度，以 v_c 為陽性對照[27]。羥基自由基清除率計(jì)算公式如下：

清除率 =（A₀-A_i）/A₀×100% 式中： ?：A₀ 為空白組（以 50μL 純水代替樣品加人反應(yīng)體系中）吸光度； ?_?A_i 為樣品組吸光度。1.2.4.4超氧陰離子自由基清除能力測定。配制2.52mmol/L 的氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）溶液、 624μmmol/L 的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）溶液和 120μmmol/L 的吩嗪硫酸甲酯（PMS）溶液。在 100μL 的 NBT溶液中加人100μL NADH溶液、 100μL 樣品溶液和 100μL PMS 溶液，搖勻，在 25^°C 水浴 5min ，在 560nm 測定吸光度，以 v_c 為陽性對照[28]。超氧陰離子自由基清除率計(jì)算公式如下：

清除率 =（A_s–A_c）/A_s×100% 式中 Ω：A_s 是對照組（用純水替換樣品溶液加入反應(yīng)體系）吸光度： ?_{^Ac 是樣品組吸光度。1.2.5沙棘枝干總黃酮對酒精誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞損傷模型的作用效果。1.2.5.1HepG2細(xì)胞復(fù)蘇。從 -80°C 的冰箱中取出凍存的細(xì)胞，快速在 37^°C 水浴中融化，隨后在凍存管中加入1＼～2mL 完全培養(yǎng)基，吹散，快速將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至 10mLEP 管中， 1200r/min 離心 5min ，棄掉上清，加入HepG2細(xì)胞專用培養(yǎng)基，反復(fù)吹打使得沉降成團(tuán)的細(xì)胞均勻分布在培養(yǎng)基中，放入 37% （204號 CO₂ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.5.2酒精誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞損傷模型的建立。細(xì)胞在對數(shù)生長期長到密度 90% 左右時，消化傳代，吹成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行計(jì)數(shù)，制備成 1×10⁴ 個/孔的細(xì)胞懸液，并加入96孔板中置于 37% （20號 CO₂ 培養(yǎng)箱中孵育 24h ，加入濃度梯度為 50100200400.800μmol/L 的無水乙醇 20μL 誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，吸出孔板中所有溶液，每孔加入 100μL 含 10% CCK-8的培養(yǎng)基， 后在 450nm 測定吸光度。細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下：

細(xì)胞存活率 =OD_iffuceff/OD_∵iffuceff×100%

1.2.5.3細(xì)胞毒性檢測。細(xì)胞在對數(shù)生長期長到 90% 左右時，消化傳代，吹成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行計(jì)數(shù)，制備成 1× 10⁴ 個/孔的細(xì)胞懸液，并加入96孔板中置于 37% （204號 CO₂ 培養(yǎng)箱中孵育 24h ，以DMSO將 40% 乙醇洗脫組分溶解為80mg/mL ，再用PBS稀釋到 0.1% ，加入不同濃度的沙棘枝干總黃酮樣品 20μL 培養(yǎng) 24h ，吸出孔板中所有溶液，每孔加入 100μL 含 10% CCK-8的培養(yǎng)基， ^1h 后在 450nm 測定吸光度。細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下：

細(xì)胞存活率 =OD_ijfigeff/OD_ggH^*H;HH;H×100%

1.2.5.4不同濃度沙棘枝干總黃酮對HepG2細(xì)胞酒精損傷的保護(hù)作用。用 400mmol/L 的無水乙醇造模，作用于細(xì)胞24h 建立酒精損傷模型，用 20μg/mL 水飛薊素作為陽性藥對照組，用濃度為 5.20.80μg/mL 的沙棘枝干總黃酮保護(hù)細(xì)胞，然后加入無水乙醇損傷細(xì)胞。采用CCK-8法測定細(xì)胞成活率，以此來判斷不同濃度沙棘枝干總黃酮對被無水乙醇損傷細(xì)胞的保護(hù)效果。

1.2.5.5細(xì)胞樣品制備和蛋白免疫印跡試驗(yàn)。細(xì)胞在對數(shù)生長期長到 90% 左右時，消化傳代，吹成單細(xì)胞懸液，接種于直徑 100mm 的培養(yǎng)皿中，每個血加入 9mL 懸液，約 3× 10⁶ 個細(xì)胞，將培養(yǎng)皿置于 37% CO₂ 培養(yǎng)箱中孵育24h ，空白組和模型組加入 1mL 的PBS，陽性對照孔加入1mL 濃度為 20μg/mL 的水飛薊素，其同樣先用DMSO溶解，然后用PBS稀釋到 0.1% ，每孔分別加入濃度為5、20、80μg/mL 的沙棘枝干提取物 40% 乙醇洗脫組分 1mL 。將培養(yǎng)皿置于 培養(yǎng)箱中孵育 24h ，加入乙醇造模液 1mL ，于相同條件下再孵育 24h 。將培養(yǎng)皿拿出置于冰上，棄去血內(nèi)所有液體，PBS清洗3次，加入高效細(xì)胞裂解液，冰上裂解 30min ，冷凍離心 10min ，轉(zhuǎn)速 12000r/min ，棄去沉淀，獲得總蛋白樣品。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）按大小分離蛋白質(zhì)，再通過電印跡轉(zhuǎn)移到膜上，然后用封閉溶液處理膜，加入一抗和二抗依次孵育。將濾膜放入配好的顯色液中反應(yīng) 1min ，計(jì)算機(jī)掃描圖像，并由生物圖像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國，型號ModelGelDoc2000）分析處理。

1.3統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)處理和圖表制作使用Excel2019和Origin2021;顯著性差異用IBM SPSS Statistics。

2 結(jié)果與分析

2.1沙棘枝干中的成分經(jīng)分析，沙棘枝干中水分、灰分、總多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和總黃酮占比分別為 8.73%.1.30% 、5.75% 、0. 82% 、1. 13% 和 0.64% 。沙棘枝干大多由較難分解的木質(zhì)素和纖維素組成，水分和總多糖相對來說含量較高，無機(jī)鹽、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)含量較少，因?yàn)榇蟛糠侄歼\(yùn)送至花、果實(shí)和葉中。總黃酮含量在 1% 以下，可能是因?yàn)楣麑?shí)和葉是儲存營養(yǎng)的器官，所以枝干的總黃酮含量較少。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1乙醇濃度對總黃酮提取率的影響。從圖1可以看出，在乙醇濃度為 0～100% ，總黃酮提取率呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)乙醇濃度為 60% 時，提取率最大?？赡苁且?yàn)樯臣Ω芍械狞S酮類物質(zhì)與 60% 乙醇的極性最為接近，所以在其中溶解度最大，之后隨著乙醇濃度的繼續(xù)增大，溶液極性發(fā)生變化，總黃酮溶解度減小，提取率也變小。所以選定乙醇濃度為 60% 。

2.2.2提取時間對總黃酮提取率的影響。從圖2可以看出， 0.5～2.0h 總黃酮提取率逐漸增加，到 2.0h 之后，提取率變化幅度很小。說明總黃酮在 2.0h 內(nèi)已經(jīng)被溶出大部分，之后只是繼續(xù)延長提取時間的話，提取率很難有明顯提高，所以選擇提取時間為 2.0h 。

2.2.3液料比對總黃酮提取率的影響。從圖3可以看出，液料比小于 20：1 時，總黃酮提取率隨著液料比的增大而增大，原因是隨著溶液體積的增加，溶劑和原料之間的接觸面積增大，總黃酮向溶液中轉(zhuǎn)移的速度加快；之后繼續(xù)增大液料比，總黃酮提取率反而下降，可能是由于過多的溶劑導(dǎo)致原料內(nèi)其他物質(zhì)的溶出，影響了總黃酮的提取率?？紤]到之后還有醇沉、旋蒸濃縮等步驟，為了避免溶劑浪費(fèi)，所以選擇液料比為 20：1 。

2.2.4提取溫度對總黃酮提取率的影響。從圖4可以看出，從 40% 開始，總黃酮提取率隨著溫度升高而增大，到55^°C 后達(dá)到最大值，隨后開始下降。當(dāng)提取溫度升高時，物質(zhì)內(nèi)部分子運(yùn)動也加快，所以擴(kuò)散和滲透的速度也加快，黃酮類物質(zhì)在溶劑內(nèi)的溶解度也隨溫度升高而變大，但是當(dāng)溫度太高時，可能會使原料中的總黃酮發(fā)生氧化。所以選擇提取溫度為 55^°C 。

2.3響應(yīng)面試驗(yàn)選取溫度、液料比和乙醇濃度3個因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，超聲提取時間均為 ^2h 。中心點(diǎn)為溫度55^°C 、液料比 20：1 和乙醇濃度 60% ，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

用Designexpert8.0軟件進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸方程的擬合，得出二次多項(xiàng)回歸方程：總黃酮提取量 0.160 0B+0. 001 3C+0. 026AB+0. 087AC+0. 016BC-0. 15A²- 0.13B²-0.23C²

由表2可知，建立的回歸模型 Plt;0.01 ，差異極顯著；失擬項(xiàng) P=0.773 9 ，不顯著，表明模型的擬合度較好； R²= 0.9689，且 R_Adj²=0.929 0 ，表明擬合模型可信度較高，試驗(yàn)誤差較小。該響應(yīng)面模型具有顯著性，可以用此模型對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和預(yù)測。一次項(xiàng)中因素 B （液料比）對結(jié)果影響極顯著。從 F 值可知單因素的影響順序?yàn)?Bgt;Agt;C ，二次項(xiàng)中 A²?B² 和 C² 對結(jié)果影響都極顯著； AC 交互對結(jié)果影響顯著， _，AB 和 BC 交互對結(jié)果影響不顯著

如圖5所示，在乙醇濃度一定時，溫度為 50～60^circC ，總黃酮提取量先升高后降低，影響較為明顯，而液料比為 15：1～ ，總黃酮提取量先升高后稍微降低，影響不明顯；等高線圖顯示溫度和液料比交互顯著。如圖6所示，在液料比一定時，溫度為 50～60^cC ，乙醇濃度為 40%～80% ，總黃酮提取量先升高后降低；但是在等高線圖中顏色較淺，沒有紅色范圍出現(xiàn)，說明這2個因素交互對試驗(yàn)結(jié)果的影響不明顯。如圖7所示，在溫度一定時，乙醇濃度為 40%～80% ，總黃酮提取量先升高后降低，影響較為明顯；而等高線圖顯示出橢圓形，說明乙醇濃度和液料比交互極顯著，對總黃酮提取量的影響極明顯。

Fig.5Response surface and contour plots of the interaction between liquid-material ratio and temperatu

綜上所述，在超聲波頻率為 50kHz 、功率為 200‰ 的條件下，沙棘枝干總黃酮最佳提取工藝為提取溫度 55.36^°C 、液料比 23.12：1 乙醇濃度 60.77% 、提取時間 ^2h ，預(yù)計(jì)的總黃酮提取量理論值為 4.07mg/g 。進(jìn)一步驗(yàn)證采用優(yōu)化條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，優(yōu)化條件為提取溫度 55^°C 、液料比 23：1 、乙醇濃度 61% 、提取時間2h，總黃酮提取量為 4.19mg/g ，與理論值的誤差為 2.95% ，說明試驗(yàn)結(jié)果與模型符合良好，并達(dá)到試驗(yàn)過程中的最高提取量，說明此響應(yīng)面模型具有可行性。

2.4純化產(chǎn)物抗氧化試驗(yàn)

2.4.1純化前后總黃酮含量變化。粗提物中的總黃酮含量為 1.24% 。其中 20%.40%.60% 乙醇洗脫液可用肉眼觀察到棕黃色， 40% 乙醇洗脫液的顏色最深，旋蒸后凍干樣的總黃酮含量也最高，為 12.30% 20% 乙醇洗脫液次之，凍干樣的總黃酮含量為 8.62% 60% 乙醇洗脫液顏色最淡，凍干樣的總黃酮含量為 3.17% 。 80% 和 100% 乙醇洗脫液肉眼觀察無色且無黃酮類物質(zhì)檢測出。

2.4.2 體外抗氧化活性。

2.4.2.1DPPH自由基清除能力。已知 IC₅₀ 值越小，清除自由基效果越好。如圖8所示，其中 20% 乙醇洗脫組分、 40% 乙醇洗脫組分 60% 乙醇洗脫組分 的DPPH自由基清除率 IC₅₀ 值分別為 8.45，3.17，22.69，2.40μg/mL， 。從圖8可以看出，在 2～10μg/mL， 20% 和 40% 乙醇洗脫組分對DPPH自由基的清除效果上升得很快； 40% 乙醇洗脫組分對DPPH自由基的清除效果最好，但比 v_c 弱； 20% 乙醇洗脫組分次之， 60% 乙醇洗脫組分效果最差。當(dāng)樣液濃度在 8μg/mL 以上時， 40% 乙醇洗脫組分和 v_c 溶液的清除率上升速度均開始減緩且相差很小。這證明 40% 乙醇洗脫組分清除DPPH自由基的效果相對較好。

Fig.6Response surface and contour plot of the interaction between ethanol concentration and temperature

Fig.7Response surfaceand contour plotof the interaction between ethanol concentration and liquid-material ratio

2.4.2.2ABTS自由基清除能力。從圖9可以看出， 20% 乙醇洗脫組分、 40% 乙醇洗脫組分、 60% 乙醇洗脫組分、 v_c 的IC₅₀ 值分別為 45.80，37.06，75.79，32.98μg/mL 。在 20～ 100μg/mL ，幾種樣品溶液對ABTS自由基的清除率均呈上升趨勢。 40% 乙醇洗脫組分對ABTS自由基的清除效果最好，但比 v_c 弱； 20% 乙醇洗脫組分次之， 60% 乙醇洗脫組分效果最差。所以沙棘枝干總黃酮提取純化產(chǎn)物對ABTS自由基的清除效果是 V_cgt;40% 乙醇洗脫組分 gt;20% 乙醇洗脫組分 ?gt;60% 乙醇洗脫組分。

2.4.2.3羥基自由基清除能力。從圖10可以看出， 20% 乙醇洗脫組分、 40% 乙醇洗脫組分、 60% 乙醇洗脫組分 .v_c 的IC₅₀ 值分別為 905.80，792.51，1785.32，597.06μg/mL 。在200～1000μg/mL ，幾種樣品溶液對羥基自由基的清除率均呈上升趨勢。但是 40% 乙醇洗脫組分的清除率上升速度最快，而 20% 乙醇洗脫組分在溶液濃度達(dá)到 800μg/mL 之后變緩， 60% 乙醇洗脫組分的清除率上升速度最小?？梢?40% 乙醇洗脫組分對羥基自由基的清除效果最好，比 v_c 弱； 20% 乙醇洗脫組分次之， 60% 乙醇洗脫組分效果最差。總體來看，對羥基自由基的清除效果是 V_cgt;40% 乙醇洗脫組分 gt;20% 乙醇洗脫組分 gt;60% 乙醇洗脫組分。

2.4.2.4超氧陰離子自由基清除能力。從圖11可以看出，20% 乙醇洗脫組分、 40% 乙醇洗脫組分、 60% 乙醇洗脫組分、v_c 的 IC₅₀ 值分別為 394.87.262.42.709.55 和 60.99μg/mL 在 200～1000μg/mL ，幾種樣品溶液對超氧陰離子自由基的清除率均呈上升趨勢，而 v_c 在最低濃度時，清除率就很高。40% 乙醇洗脫組分的清除率上升速度最快，在到達(dá)600μg/mL 時幾乎不再增長，并且在濃度為 1000μg/mL 時，40% 乙醇洗脫組分和 20% 乙醇洗脫組分對超氧陰離子自由基的清除能力沒有顯著差別。而 60% 乙醇洗脫組分的清除率上升速度最小?？梢?40% 乙醇洗脫組分對超氧陰離子自由基的清除效果最好，但比 v_c 弱； 20% 乙醇洗脫組分次之，60% 乙醇洗脫組分效果最差。總體來看，對超氧陰離子自由基的清除效果是 V_cgt;40% 乙醇洗脫組分 gt;20% 乙醇洗脫組分 gt;60% 乙醇洗脫組分。

2.4.3無水乙醇誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞酒精性肝損傷模型的建立。從圖12可以看出，在 0～800mmol/L ，相較于空白組，細(xì)胞存活率隨乙醇濃度升高而呈現(xiàn)下降趨勢，乙醇濃度每擴(kuò)大2倍時，細(xì)胞存活率與前一組有顯著差異，細(xì)胞存活率接近50% 時，視為成功造模。乙醇濃度為 400mmol/L 時，細(xì)胞存活率為 52.31% ，因此選取此乙醇濃度為造模成功時的濃度。

注：不同小寫字母表示差異顯著（ Plt;0.05） 。

Note：Different lowercase lettersindicate significant differences （Plt;0.05） ：

2.4.4不同濃度沙棘枝干總黃酮對HepG2細(xì)胞的生物毒性。從圖13可以看出，沙棘枝干總黃酮在 0～80μg/mL ，細(xì)胞存活率沒有顯著差異，并且都接近 100% ，說明沙棘枝干總黃酮在此濃度范圍內(nèi)對細(xì)胞幾乎沒有毒性。

2.4.5不同濃度沙棘枝干總黃酮對HepG2細(xì)胞酒精損傷的 保護(hù)作用。從圖14可以看出，沙棘枝干總黃酮低劑量使細(xì) 胞存活率到達(dá) 53.22% ，中劑量使細(xì)胞存活率到達(dá) 71.64% 高劑量使細(xì)胞存活率到達(dá) 90.70% 。說明沙棘枝干總黃酮濃 度與細(xì)胞存活率呈劑量依賴性。

2.4.6沙棘枝干總黃酮對 Keap1/Nrf2/H0-1 信號通路蛋白表達(dá)的影響。從圖15＼～16可以看出，模型組的Keap1蛋白的表達(dá)量有明顯下降，對比空白組，差異極顯著；與模型組比較，低劑量、中劑量和高劑量給藥時，Keap1蛋白的表達(dá)量均有不同程度的上升，但是低劑量的效果不顯著，中劑量和高劑量的效果極顯著。說明不同濃度的沙棘枝干總黃酮對酒精性肝損傷的保護(hù)作用隨著濃度的升高而增大，而且具有濃度依賴性。

注：不同小寫字母表示差異顯著（ Plt;0.05） N°

Note：Different lowercase letters indicate significant differences 0 Plt;0.05） ：

注：與空白組比較，### ?Plt;0.001Ω ;與模型組比較， ***P?0.001 ，**Plt;0.01 。

Note：Compared with the blank group， ##Plt;0.001 ;Compared with the model group，*** Plt;0.001 ， **Plt;0.01

Fig.15Effects of total flavonoids in sea-buckthorn branches on the expression levels of Keap1/Nrf2/HO-1 signaling pathwayproteins

從圖15和圖17可以看出，模型組的Nrf2蛋白的表達(dá)量有明顯下降，對比空白組，差異極顯著；與模型組比較，低劑量、中劑量和高劑量給藥時，Nrf2蛋白的表達(dá)量均有不同程度的上升，且中劑量和高劑量的效果極顯著。說明不同濃度的沙棘枝干總黃酮對酒精性肝損傷的保護(hù)作用隨著濃度的升高而增大，而且具有濃度依賴性。

從圖15和圖18可以看出，模型組的H0-1蛋白的表達(dá)量有明顯下降，對比空白組，差異極顯著；與模型組比較，低劑量、中劑量和高劑量給藥時，HO-1蛋白的表達(dá)量均有不同程度的上升，且中劑量和高劑量的效果極顯著。說明不同濃度的沙棘枝干總黃酮對酒精性肝損傷的保護(hù)作用隨著濃度的升高而增大，而且具有濃度依賴性。

注：與空白組比較， ###Plt;0.001 ;與模型組比較，* **P?0.001 ， **P?0.01_o （20

Note：Compared with the blank group，### Plt;0.001 ；Compared with the model group，*** Plt;0.001 **Plt;0.01

Note：Compared with theblank group，### Δ^tPlt;0.001 ;compared with the model group， ****Plt;0.001 ：

圖17沙棘枝干總黃酮對HepG2細(xì)胞 Nrf2 蛋白表達(dá)水平的影響Fig.17Effect of total flavonoids from sea-buckthorn branchesonthe expression level ofNrf2 protein in HepG2 cells

3結(jié)論與討論

該試驗(yàn)得到的沙棘枝干總黃酮最佳提取工藝為超聲頻率 50kHz 、功率 200‰ 、提取溫度 55^°C 、液料比 23：1 乙醇濃度 61% 、提取時間 ²h ，在此條件下總黃酮提取量為4.19mg/g 。

注：與空白組比較， ###Plt;0.001 ;與模型組比較， ???Plt;0.001， □ Note：Compared with the blank group，### Plt;0.001 ; compared with the model group， *****0.001

楊歡歡等[27]用微波輔助提取沙棘果渣，發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙醇濃度為 70% 、料液比 1：25 （ ）、微波時間 2.5min 、功率為600‰ 時，總黃酮提取量為 22.13mg/g 。吳翠芳等[28]用超聲提取沙棘漿果，發(fā)現(xiàn)提取時間為 23min 、提取溫度為 80^qC 、乙醇濃度為 50% 、料液比為 1：20 、總黃酮得率達(dá)到2.315mg/g 。劉馨雨等[29]用超聲波微波協(xié)同提取沙棘葉，發(fā)現(xiàn)在乙醇體積分?jǐn)?shù)為 61% 、協(xié)同提取時間為 18min 、微波功率為 $4 4 6 ～ ＼mathrm { ＼textW }$ 的條件下，總黃酮得率為 42.09mg/g 。結(jié)合上述案例可以看到沙棘枝干中總黃酮含量少于果實(shí)和葉子，而且單純超聲提取的效果也不如微波和超聲協(xié)同提取。

該研究表明，沙棘枝干提取物的3種純化產(chǎn)物的不同類型自由基清除效果較為一致，均為 40% 乙醇洗脫組分 gt;20% 乙醇洗脫組分 gt;60% 乙醇洗脫組分，但是比 v_c 抗氧化能力還是偏弱。選取 40% 乙醇洗脫組分，用HepG2細(xì)胞造模從抗炎層面進(jìn)行護(hù)肝效果研究，結(jié)果表明，沙棘枝干總黃酮能通過 Keap1/Nrf2/HO-1 通路，減輕炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)了HepG2細(xì)胞，減輕了由無水乙醇制造的損傷。之后的研究中，還需要進(jìn)一步對其組成成分進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行動物試驗(yàn)的研究。

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