布比卡因對膽管癌神經浸潤體外模型腫瘤細胞增殖和轉移的影響及其機制

[中圖分類號] R735.8 [文獻標志碼] A

The effect of bupivacaine on the proliferation and metastasis of tumor cells in an in vitro model of perineural invasion of cholangiocarcinoma and its mechanism CHEN Menshou ，FENG Yujie（Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery，The Afiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266oo3，China）

[ABSTRACT]ObjectiveToinvestigatetheefectofbupivacaineontheproliferationandmetastasisof tumorcels inanin vitro modelofperineural invasionofcholangiocarcinomaanditsmechanism.MethodsHumancholangiocarcinomacelline （QBC939cells）weredivided intoQBC939group（groupA），QBC939+welldiffrentiated pheochromocytoma celline（PC12） group（group B），and QBC939+PC12+bupivacaine group （group C）.The cels in group A werecultured in the QBC939 cel-specific medium for ^48h ， those in group B were co-cultured with well-differentiated PC12 cells for ^48h in addition to the treatment in groupA to establishtheinitro modelofperineuralinvasionofcholangiocarcinoma，and thosein groupCwerecultured withbupivacaine for ^48h in addition to the treatment in group B. CCK-8 assay，EDU staining，cellscratch assay，and Transwellassy were usedtomeasurecellviabilityadsesstheproliferation，migratonandinvasionabilitisoftethregrousofcell.Well-dife rentiated PCl2 cells were divided into PCl2 group（group D）and PC12+ bupivacaine group （group E），and the cells in group D were cultured in the PCl2 cell-specific medium for ^48h ，while those in group E were cultured with bupivacaine for ^48h in addition tothetreatment ingroupD.Immunofluorescencestainingassaywasused tomeasure thelengthofcellaxons，and Westernbloting wasused to measuretherelativeexpresionlevelof neuropilin-1（NRP-1）inthetwogroups.ResultsCCK-8assay，EDUstaining，cellscratchassay，andTranswellassayshowedthatcomparedwithB，groupChadsignificantlylowercellviabilityadpro liferation，migration，and invasion abilities of QBC939 cells （F=34.39-149.20，q=9.47-12.95，Plt;0.05） .Immunofluorescent stainingand Western bloting showed thatcompared withgroup D，groupEhada significantlyshorter meanlengthof cellaxons and a significantly lower relative protein expression level of NRP-1 （t=11.75，3.09，Plt;0.05） .ConclusionBupivacaine may inhibitthemalignantbologicalbehaviorsofcolangiocarcinomacellssuchasproliferation，migration，andinvasionbyibingthe axonalgrowthofneuralcelsand theexpresionof NRP-1inaninvitromodelofperineural invasionofcholangiocarcinoma.

[KEYWORDs]Bile duct neoplasms；Bupivacaine；Neuropilin-1；Neurons；Axons；Neoplasm invasiveness；Cellproliferation； Cell movement

膽管癌是一類起源于膽道上皮細胞的腫瘤，惡性程度極高[1]。由于缺少明確的影像學證據和生物學標志物，膽管癌被確診時大多已處于晚期[2-4]，且面臨治療耐藥、無法切除等問題[5-8]。復雜的腫瘤微環境導致膽管癌的治療極為困難[9]，其中神經細胞與腫瘤細胞之間的交流為腫瘤生長和轉移提供動力[10-12]。神經周圍浸潤是一種腫瘤細胞沿著神經細胞或神經細胞鞘膜生長的現象[10]，可作為膽管癌的不良預后指標[13-14]。在小鼠胰腺癌模型中，神經細胞能夠激活腫瘤細胞Rho/ROCK信號通路，并上調其肌動蛋白的表達[15]。由此可見，針對腫瘤神經周圍浸潤的治療策略開發具有重要意義。抑制腫瘤微環境內神經細胞功能的治療策略在胰腺癌、胃癌、乳腺癌中均已顯示出了一定的治療效果[16-18]。布比卡因是一種非阿片類選擇性鈉通道阻滯劑，能夠抑制神經沖動的傳導。研究表明，布比卡因可以通過抑制腫瘤微環境內神經細胞的功能，從而抑制胰腺癌進展[16]。布比卡因對膽管癌神經周圍浸潤的作用尚無報道。本研究探討布比卡因對于膽管癌神經浸潤體外模型中腫瘤細胞增殖和轉移的影響及其機制，旨在為膽管癌神經浸潤患者的治療提供新策略。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

人膽管癌細胞系（QBC939細胞，SNL-186）、高分化嗜鉻細胞瘤細胞系（PC12細胞，SNL-124）及其專用培養基（SNLM-186、SNM-001E）購自武漢尚恩生物技術有限公司，布比卡因（HY-B0405）、CCK-8試劑盒（HY-K0301）以及基質膠（HY-K6002）均購買于美國MCE公司。 β 微管蛋白3（TUBB3）抗體（AF7000）、FITC標記山羊抗兔IgG（S0008）、神經纖毛蛋白-1（NRP-1）抗體（DF7877）、β-肌動蛋白（ β- actin）抗體（AF7018）以及HRP標記山羊抗兔IgG（SO001）購買于江蘇親科生物研究中心有限公司，二甲基亞砜（D8371）和結晶紫溶液（G1063）購自北京索萊寶科技有限公司，EdU-555細胞增殖檢測試劑盒（CX003）購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司。神經生長因子（ RP00667） 購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。Transwell小室（354578）購買于美國Corning公司。

1.2 細胞分組及處理

QBC939細胞加人QBC939細胞專用培養基，高分化PC12細胞加入高分化PC12細胞專用培養基（含 50μg/L 神經生長因子，以誘導高分化PC12細胞獲得神經細胞表型），均置于 37^°C 、含體積分數0.05CO₂ 的培養箱中培養至細胞密度約為 70% 時用于后續實驗。將QBC939細胞接種于96孔板（每孔 5×10³ 個細胞）、24孔板（每孔 2×10⁵ 個細胞）當中，分為QBC939組（A組）、 QBC939+PC12 組（B組）和 QBC939+PC12+ 布比卡因組（C組），每組設置3個復孔。A組細胞使用QBC939細胞專用培養基進行培養，B組在A組基礎上加入高分化PC12細胞（QBC939細胞：高分化PC12細胞為 g：l） 共培養，C組在B組基礎上加入布比卡因 （10μmol/ L）。將經神經生長因子誘導獲得神經細胞表型的高分化PC12細胞接種于24孔板（每孔 5×10⁴ 個細胞）和6孔板（每孔 2×10⁵ 個細胞）中，分為PC12組（D組）和 PC12+ 布比卡因組（E組），每組設置3個復孔。D組細胞使用高分化PC12細胞專用培養基進行培養，E組細胞在D組的基礎上加入布比卡因（2 （10μmol/L） 進行培養。將各組細胞置于 、含體積分數 0.05CO₂ 的培養箱中培養 ^48h ，用于后續實驗。

1.3 CCK-8法檢測各組細胞活力

取96孔板中培養 ^48h 后的 A～C 組細胞，按照CCK-8試劑盒說明書進行檢測，使用酶標儀在450nm 波長下檢測各孔吸光度值，并計算細胞活力。細胞活力 （實驗組吸光度一空白組吸光度）/（對照組吸光度一空白組吸光度） ×100% 。

1.4 EDU染色實驗檢測各組細胞增殖能力

取96孔板中培養 ^48h 后的 A～C 組細胞，按照EdU-555細胞增殖檢測試劑盒說明書進行檢測。使用EVOSM5000顯微鏡觀察并拍照。EDU陽性細胞率 =EDU 陽性細胞數量/總細胞數量 ×100% .以EDU細胞陽性率表示細胞增殖能力。

1.5 細胞劃痕實驗檢測各組細胞遷移能力

取24孔板中培養 ^48h 后的 A～C 組細胞，棄去培養基，用 200μL 移液器槍頭在每個孔中間劃一道寬度基本相等的劃痕，PBS洗2次，加入RPMI-1640培養基，立即使用EVOSM5000顯微鏡觀察各組細胞劃痕并拍照（第0小時）。而后將各組細胞置于 37^°C 、含體積分數 0.05CO₂ 的培養箱當中繼續培養 ^48h ，再進行觀察并拍照（第48小時），并計算各組細胞遷移率。細胞遷移率 （第0小時劃痕面積一第48小時劃痕面積）/第0小時劃痕面積 x 100% 。

1.6Transwell實驗檢測各組細胞侵襲能力

于Transwell小室的上室面加入 60μL 基質膠（RPMI-1640培養基與基質膠 8：1 混合），待其凝固后，置于24孔板各孔中。將實驗分為 A～C 組，每組設置3個復孔。A組在Transwell小室中接種QBC939細胞（每孔 1×10⁴ 個細胞），上室加入RP-MI-1640培養基，下室加入QBC939細胞專用培養基；B組在A組基礎上于上室中加入高分化PC12細胞（QBC939細胞：高分化PC12細胞為 g：l） 共培養；C組在B組的基礎上于上室中加入布比卡因（10μmol/L） 。將各組細胞置于 37^°C 、含體積分數0.05CO₂ 的培養箱中培養 ^48h 后，取出小室，放入4% 的多聚甲醛中固定 15min ，PBS沖洗1次。放人 0.1% 結晶紫溶液中染色 10min ，PBS沖洗3次。使用棉簽將上室面的細胞擦拭干凈，并使用EVOSM5000顯微鏡觀察各組細胞小室相同視野區域并拍照，計算視野內結晶紫染色細胞數量，以表示各組細胞侵襲能力。

1.7免疫熒光染色實驗檢測各組細胞軸突長度

取24孔板中培養 ^48h 后的D組和E組細胞，加入 4% 的多聚甲醛固定 10min，0.1% 曲拉通-100透化， 5% 牛血清白蛋白封閉 ，加入TUBB3蛋白一抗 （1：1 000） 在 4^°C 下孵育 12h ，加人二抗（1：5000）在室溫下孵育 ，加入DAPI染色 10min 。使用EVOSM5000熒光顯微鏡采集圖像，而后使用ImageJ軟件對熒光信號進行定量分析。以綠色熒光胞體邊緣為起點，以軸突末端為終點，計算各組細胞的細胞軸突平均長度。細胞軸突平均長度 總細胞軸突長度/細胞總數。

1.8蛋白免疫印跡（WB）實驗檢測各組細胞NRP-1蛋白表達水平

取6孔板當中培養 ^48h 后的D組和E組細胞，使用蛋白裂解液提取總蛋白，按照體積比 4：1 加入蛋白緩沖液，混合均勻后置于金屬浴中 95°C 孵育10min 。按照雅酶制膠試劑盒說明書制備電泳凝膠，每組加入等質量的蛋白樣品進行電泳，而后電轉至PVDF膜上，使用快速封閉液室溫封閉 20min 加入NRP-1和 β -actin蛋白一抗 （1：1 000） 于 4^°C 下孵育 ^12h ，加入二抗 （1：5000） 于室溫下孵育^1h 。使用ECL發光液，在UVIWB顯影儀下顯影，使用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，并且以β -actin作為內部參照，計算各組目的蛋白相對表達水平。

1.9 統計學處理

采用GraphpadPrism軟件對數據進行統計學分析。對于符合正態分布的計量資料采用 形式表示。兩組間比較采用獨立樣本的 Ψ_t 檢驗。多組間比較采用單因素的方差分析，進一步的兩兩比較采用Tukey'sHSD檢驗。以 Plt;0.05 作為差異具有顯著統計學意義。

2結果

2.1 各組細胞的細胞活力比較

CCK-8法結果顯示， A～C 組細胞的細胞活力分別為 （100.0±4.8）% 、 （161.8±9.6）% 、 （122.6± 8.2）% ，各組間比較差異具有顯著意義（ F=95.56 ，Plt;0.05） ；其中，B組的細胞活力顯著高于A組（ q=19.32，Plt;0.05），（ 組的細胞活力顯著低于B組 （q=12.24，Plt;0.05） 。

2.2各組細胞的增殖能力比較

EDU染色實驗結果顯示， A～C 組中的EDU細胞的陽性率分別為 （37.29±5.63）% 、 62.45± 3.05% 二 （40.25±2.93）% ，各組間比較差異具有顯著意義 （F=34.39，Plt;0.05） ;其中，B組的EDU細胞陽性率顯著高于A組 （q=10.73，Plt;0.05），C 組的EDU細胞陽性率顯著低于B組 （q=9.47，Plt; 0.05）。見圖1。

2.3各組細胞的遷移能力比較

經細胞劃痕實驗檢測之后，結果顯示， A～C 組QBC939細胞的細胞遷移率分別達到了 （35.03± 2.46）%.（68.63±2.76）%.（54.13±1.86）% ，各組間進行比較差異具有顯著統計意義 （F=149.20，Plt; 0.05）。其中，B組的細胞遷移率顯著高于A組（ 24.35，Plt;0.05） ，C組的細胞遷移率顯著低于B組（ （q=10.51，Plt;0.05） 。見圖2。

2.4各組細胞的侵襲能力比較

Transwell實驗結果顯示， A～C 組的小室下室面細胞分別為 （44±6） 、 （103±8） 、 （58±4） 個，各組間差異具有顯著性 （F=78.47，Plt;0.05） 。其中，B組的小室下室面細胞顯著多于A組 （q=16.95，Plt; 0.05），C組的小室下室面細胞顯著少于B組（ ?_q= 12.95，Plt;0.05） 。見圖3。

2.5布比卡因對PC12細胞軸突長度的影響

免疫熒光染色實驗結果顯示，D組和E組中PC12細胞軸突的平均長度分別為 （75.22±6.44） 和（2 （27.44±2.86）μm， E組PC12細胞的軸突平均長度顯著短于D組，差異有顯著性 （t=11.75，Plt;0.05） 。見圖4。

2.6布比卡因對PC12 細胞NRP-1蛋白表達水平的影響

WB實驗結果顯示，D組和E組細胞中NRP-1蛋白相對表達水平分別為 0.94±0.14.0.65±0.08 E組中的NRP-1蛋白相對表達水平顯著低于D組L Δ_t=3.09，Plt;0.05） 。見圖5。

第0小時第48小時

3討論

中國膽管癌患病率顯著高于全球其他地區，且多數病例在確診時已進展至晚期[8，19]。神經周圍浸潤可通過重塑腫瘤微環境促進腫瘤進展[10，20-22]。研究表明，在小鼠胰腺導管腺癌模型中，神經周圍浸潤誘導的膽堿能信號通路異常激活可顯著抑制 CD8⁺ T淋巴細胞在腫瘤實質內的浸潤，這一機制為神經阻滯療法的抗腫瘤效應提供了理論依據[23]。局麻藥物在胰腺癌神經周圍浸潤實體瘤模型中已展現出一定的抗癌潛力[16]，但其在膽管癌神經周圍浸潤中的作用及機制尚不明確。高分化PC12細胞經過神經生長因子誘導會停止細胞分裂，其軸突會發生延伸，進而展現出神經細胞的表型特征。

圖4各組細胞免疫熒光染色實驗結果

本研究通過QBC939細胞和高分化PC12細胞共培養建立膽管癌神經浸潤細胞模型，在體外模擬膽管癌神經浸潤的腫瘤微環境，以評估局麻藥物布比卡因對膽管癌神經浸潤的抑制作用，并探討其可能的分子機制。

本研究中，CCK-8實驗結果顯示，與A組相比，B組中QBC939細胞的細胞活力顯著升高，C組中QBC939細胞的細胞活力較B組顯著降低。EDU實驗結果顯示，與A組相比，B組中QBC939細胞的增殖能力顯著增強，C組中QBC939細胞的增殖能力較B組顯著降低。細胞劃痕實驗結果顯示，B組的QBC939細胞遷移能力較A組顯著增強，C組的QBC939細胞遷移能力較B組顯著降低。Tran-swel1實驗結果顯示，B組的QBC939細胞侵襲能力較A組顯著增強，C組的QBC939細胞侵襲能力較B組顯著降低。上述結果提示，布比卡因可通過阻斷神經-腫瘤交互信號通路，抑制膽管癌神經浸潤體外模型中由神經細胞誘導增強的膽管癌細胞的細胞活力以及增殖、遷移和侵襲能力。

腫瘤神經浸潤的發生與軸突導向機制密切相關[24]。有研究表明，腫瘤細胞可通過分泌信號素、肝配蛋白等軸突導向分子模擬神經發育信號，誘導腫瘤細胞沿神經束遷移并促進其惡性進展[25]。布比卡因已經被證實可抑制神經元軸突發生[16]。基于此，本研究推測布比卡因可能通過靶向調控神經細胞軸突形成，進而抑制膽管癌神經浸潤。

TUBB3作為微管蛋白的一種，主要在神經元中表達，參與軸突生長以及微管結構的穩定。NRP-1作為轉化生長因子 ?β （TGF- ?β ）受體1的共受體，可通過激活TGF- ?β 信號通路促進乳腺癌轉移[26]。研究表明，血管內皮生長因子A與NRP-1相互作用會激活皮膚癌干細胞中FAK/Src信號傳導，從而維持皮膚癌干細胞存活[27]。本研究中，免疫熒光染色實驗結果顯示，E組細胞軸突平均長度顯著短于D組。WB實驗結果顯示，E組細胞中的NRP-1蛋白相對表達水平顯著低于D組。上述結果提示，布比卡因可能通過抑制軸突生長和抑制NRP-1表達，阻斷神經-腫瘤交互作用，進而抑制膽管癌惡性生物學行為。

綜上所述，布比卡因可能通過抑制膽管癌神經浸潤體外模型中神經細胞的軸突生長和NRP-1表達，從而抑制膽管癌細胞的增殖、遷移和侵襲等惡性生物學行為。本研究揭示了布比卡因在膽管癌神經浸潤中的潛在治療價值，有望為膽管癌的臨床治療提供新策略。

作者聲明：馮玉杰、陳門壽參與了研究設計；陳門壽參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻]

[1] BRINDLEYPJ，BACHINI M，ILYAS SI，et al.Cholangiocarcinoma[J].NatRevDisPrimers，2021，7：65.

[2] VALLEJW，KELLEYRK，NERVIB，etal.Biliarytract cancer[J].Lancet，2021，397（10272）：428-444.

[3] LAPITZA，AZKARGORTAM，MILKIEWICZP，etal.Liquid biopsy-based protein biomarkers for risk prediction，early diagnosis，and prognostication of cholangiocarcinoma[J].J Hepatol，2023，79（1）：93-108.

[4] MACIASRIR，CARDINALEV，KENDALLTJ，etal. Clinical relevance of biomarkers in cholangiocarcinoma：Critical revision and future directions[J].Gut，2022，71（8）：1669- 1683.

[5] KELLEYRK，UENOM，YOOC，etal.Pembrolizumabin combination with gemcitabine and cisplatin compared with gemcitabine and cisplatin alone for patients with advanced biliary tract cancer（KEYNOTE-966）：A randomised，doubleblind，placebo-controlled，phase3trial[J].Lancet，2o23，401 （10391）：1853-1865.

[6] LIYH，YUJF，ZHANGYJ，etal.Advances intargeted therapyofcholangiocarcinoma[J].Ann Med，2024，56（1）： 2310196.

[7] HARDINGJJ，KHALILDN，FABRISL，etal.Rationalde[J].JHepatol，2023，78（1）：217-228.

[8] CHO S Y，HWANG H， KIM Y H， et al. Refining clasification of cholangiocarcinoma subtypes via proteogenomic integration reveals new therapeutic prospects[J].Gastroenterolo gy，2023，164（7）：1293-1309.

[9]ILYAS S I，AFFO S，GOYAL L，et al. Cholangiocarcino ma----Novel biological insights and therapeutic strategies[J]. Nat Rev Clin Oncol，2023，20（7） ：470-486.

[10]LI J，CHE MJ，ZHANG B，et al. The association between the neuroendocrine system and the tumor immune microenvironment：Emerging directions for cancer immunotherapy[J]. Biochim Biophys Acta Rev Cancer，2023，1878（6）：189007.

[11] PADMANABAN V， KELLER I， SELTZER E S，et al. Neuronal substance P drives metastasis through an extracellular RNA-TLR7 axis[J]. Nature，2024，633（8028）：207-215.

[12] LE T T，PAYNE S L，BUCKWALD M N，et al. Sensory nerves enhance triple-negative breast cancer invasion and me tastasis via the axon guidance molecule PlexinB3[J]. NPJ Breast Cancer，2022，8（1） ：116.

[13] DE FRANCHIS V， PETRUNGARO S， PIZZICHINI E， et al. Cholangiocarcinoma malignant traits are promoted by schwann cells through TGFβ signaling in a model of perineural invasion [J].Cells，2024，13（5）：366.

[14] WANG H， ZHENG Q M，LU Z Y，et al. Role of the nervous system in cancers：A review[J]. Cell Death Discov，2021，7 （1）：76.

[15] MARCADIS A R， KAO E，WANG Q，et al. Rapid cancer cell perineural invasion utilizes amoeboid migration[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2023，120（17） ：e2210735120.

[16] KADURI M， SELA M，KAGAN S，et al. Targeting neurons in the tumor microenvironment with bupivacaine nanoparticles reduces breast cancer progression and metastases[J]. Sci Adv， 2021，7（41） ：eabj5435.

[17]ZHI XF，WU F J，QIAN J，et al. Nociceptive neurons interact directly with gastric cancer cels via a CGRP/Rampl axis to promote tumor progression[J]. bioRxiv， 2024： 2024.03.04. 583209.

[18] THIEL V，RENDERS S，PANTEN J，et al. Characterization of single neurons reprogrammed by pancreatic cancer[J]. Nature，2025，640（8060）：1042-1051.

[19]BANALES J M， MARIN JJ G，LAMARCA A，et al. Cholangiocarcinoma 2O2o： The next horizon in mechanisms and management[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol， 2020，17 （9）：557-588.

[20] ZHANG B，GUO X F，HUANG L Y，et al. Tumour-asso ciated macrophages and Schwann cells promote perineural invasion via paracrine loop in pancreatic ductal adenocarcinoma [J].BrJCancer，2024，130（4）：542-554.

[21]LI X Y，YANG X J，LIN SC，et al. Perineural invasion in cervical cancer[J].Cancer Lett，2025，616：217561.

[22]ZHANGYH，SANGR，BAOJY，etal.Schwann cell-derived CXCL2 contributes to cancer pain by modulating macrophage infiltrationina mouse breast cancer model[J].Brain BehavImmun，2023，109：308-320.

[23]YANGMW，TAOLY，JIANGYS，etal.Perineural invasion reprograms the immune microenvironment through cholinergic signaling in pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. CancerRes，2020，80（10）：1991-2003.

[24]GREGORYE，DUGANR，DAVIDG，etal.Thebiologyand engineered modeling strategies of cancer-nerve crosstalk[J]. Biochim Biophys ActaRevCancer，2020，1874（2）：188406. mice[J].IntImmunopharmacol，2015，25（1）：55-64.

[25]SILVERMANDA，MARTINEZVK，DOUGHERTYPM， et al.Cancer-associated neurogenesis and nerve-cancer crosstalk[J].CancerRes，2021，81（6）：1431-1440.

[26]GLINKAY，STOILOVA S，MOHAMMEDN，et al. Neuropilin-1 exerts co-receptor function for TGF-beta-1 on the membrane of cancer cells and enhances responses to both latent and active TGF-beta[J].Carcinogenesis，2011，32（4）：613-621.

[27]GRUND，ADHIKARYG，ECKERT RL.NRP-1 interacts with GIPCl and α6/β4-integrins to increase YAP1/△Np63α- dependent epidermal cancer stem cell survival[J].Oncogene， 2018，37（34）：4711-4722.

（本文編輯李京蔓 厲建強）