基于ISSR分子標記的鉆天柳遺傳多樣性分析

中圖分類號：S791.43 文獻標識碼：A 文章編號：1001-9499（2025）04-0033-07

Analysisof GeneticDiversityinSalixarbutifolia Using ISSR Molecular Markers

ZHANGYu1.2 GAO Jinhui1 XUE Yonghui2 JIANG Zhen4 ZHANGGuocai3 ZHANGHeyang ZHANG Houliangl**

（1.Yichun Branch of Heilongjiang Academy ofForestry，Heilongjiang Yichun 153000; 2.Heilongjiang Agricultural Engineearing Vocational College，Heilongjiang Harbin 150088;3.Northeast Forestry University，Heilongjiang Harbin 15o04O;4.Yichun Geographic Information Processing Center，Heilongjiang Yichun 153000）

AbstractThis study established18 natural distribution sites and plots in the Greaterand Lesser Khingan Mountains from 2021 to 2022，collcting 50 samples of Salix arbutifolia.The modified CTAB method was employed for genomic DNA extraction from leaves.Through ISSR-PCR amplification，10 primers were identified，and their optimal annealing temperatures were determined.The results indicate that the extracted genomic DNA meets quality standards.The genetic diversityof Salixarbutifolia populations is relatively high，with an average polymorphic band percentage of 91.91% at the species level and 92.22% overall， indicating substantial genetic variation.The Shannon information index and Nei'sgene diversity index peaked at an elevation of 548m .The genetic differentiation coefficient （GST） was calculated at 0.2303， suggesting significant gene flow among populations.The five natural populations exhibited close genetic relationships，with genetic similarity ranging from O.8867 to 0.9651 and genetic distance from 0.0355 to 0.1203.The 29 individuals were categorized into four major groups.The findings conclude thatthe genetic diversity of Salixarbutifoliaarises from genetic variation influenced by itsbreeding system and seed dispersal mechanisms，while the impact of geographic isolation appears minimal.

Key wordsSalix arbutifolia; ISSR;genetic diversity; genetic composition

鉆天柳（Salixarbutifolia）是楊柳科中分布范圍最小的一個類群，該樹種生長迅速，樹形優美，適合作為綠化樹種，具有顯著的生態價值，常分布于河岸及溪流兩側，是理想的護岸樹種，零星分布于中國東北部分地區[1]。通過對72種柳樹及其雜交種的孢粉形態進行了研究，結果支持將鉆天柳屬并入柳屬的分類處理[2-5]。

盡管其分類學復雜、重要意義和瀕危地位，但現有的遺傳多樣性信息仍然匱乏。有少數研究主要集中于鉆天柳的種子[6-8]嫩枝、硬枝扦插[9，10]嫁接[10，1]和組培繁殖技術[12，13]，鉆天柳的生長規律與特點[14]，鉆天柳人工造林、撫育[15]和種群現狀及生物多樣性[16-19]等。關于鉆天柳的深層次研究較少且不全面，例如鉆天柳的種群、群落特征及物種多樣性[20，21等有關其資源現狀和立地造林條件、抗水濕機理、城市綠化應用與管理等應用方面，尤其是鉆天柳作為瀕危物種的遺傳多樣性、瀕危機制等方面的研究少有報道。本研究有望為今后鉆天柳的遺傳多樣性研究提供大量的數據資源，并揭示其瀕危機制，為科學制定拯救與保護策略提供理論支撐。

1材料與樣地設置

2021年6月至2022年7月，在中國大、小興安嶺地區。根據鉆天柳的天然分布區，設置了18個鉆天柳天然分布點，這些天然分布點涵蓋了鉆天柳的主要分布區域，并考慮了地理梯度、行政區劃以及氣候、土壤和生態條件的差異。

在每個天然分布點，設置調查面積為 20m×20m 的樣地，共計 7200m² 。在每個樣地內進行詳細的植被調查，記錄鉆天柳的生長狀況、數量、分布以及與其他物種的相互關系。同時，對樣地的環境因子進行了詳細記錄，如海拔、坡度、土壤類型和植被覆蓋度等。

在每個采樣點，進行3次重復取樣，以確保數據的可靠性和代表性。共采集19個種群共50株鉆天柳的有效個體樣本（表1、表2）。

2檢測方法

采用改進的CTAB方法提取鉆天柳葉片基因組 DNA^[22] 。ISSR-PCR擴增，ISSR引物的合成序列基于加拿大哥倫比亞大學于2006年發布的100條通用引物序列，由生工生物技術有限公司完成合成。50條ISSR引物按標準反應體系（table1），選取5個樣品（佳木斯湯原JMSTY01、圖強育英林場TQ01、嘉蔭明德村JYMDC01、黑河平山HHPS01、加格達奇JGDQ01）進行PCR擴增（PCR-96，BBI，Korea），篩選出條帶清晰的引物后進行復篩，并以引物的Tm 值為基礎，對每個篩選引物的退火溫度進行梯度試驗，最終確定其最適退火溫度。

采用POPGENE1.31軟件估算物種與種群多態性條帶百分率（PPB）Shannon表型多樣性指數（I） 、Nei's基因多樣性指數（He）;估算參試種群的Shannon表型多樣性指數的總體值（ISP）及其平均值 （I_POP） ，計算種群間遺傳分化系數（GST）。采用NTSYS-pc2.1軟件對種群內的遺傳距離進行非加權平均法聚類分析，繪制UPGMA聚類圖[25]。

3結果與分析

3.1最優方法的確定

通過瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的鉆天柳葉片基因組DNA，并使用NANODROP2000超微量分光光度計測定其純度和濃度。

由圖1和表4可知：使用改良CTAB法提取的鉆天柳基因組DNA，其OD260/OD280值為 1.67～ 1.84，條帶清晰明亮，無拖尾或彌散現象，表明鉆天柳基因組DNA未受RNA、蛋白質及多糖等雜質的污染，滿足ISSR分子標記技術的要求。

鉆天柳ISSR-PCR擴增實驗結果為反應體系為20μL ，每管含有 10×PCRBuffer2.5μL，DNA2μL， 0 1NTP20mmol/L，Taq 酶1U、引物 20μmol/L ISSR-PCR擴增程序為： 94^9C 預變性 5min，94^°C 變性1min，50^qC 退火 50s，72°C 延伸 3min ，34個循環，72^°C 總延伸 10min，4°C 保存。

通過建立的最優鉆天柳ISSR-PCR反應體系對哥倫比亞大學公布的UBC800-UBC900的100條隨機引物進行初篩和復篩。

由圖2可知，選出重復率好、多態性高、特異性強的引物10條，分別為 807，808，809，834，880， 881、885、886、890和891。并以引物 Tm 值為中心，通過設置退火溫度梯度實驗，確定每個引物的最優退火溫度。

以引物UBC807和UBC808為例，在PCR儀器上設置 50～65^circC 范圍內的12個梯度，以探索適合的退火溫度。

由圖3可知，當引物的退火溫度低于 50^qC 時ISSR-PCR擴增條帶模糊不清，擴增的特異性較差；當退火溫度高于 50^qC 時，ISSR-PCR擴增的條帶數量減少且強度較弱，擴增效率降低；相比之下，當退火溫度為 50^qC 時，ISSR-PCR擴增的條帶數量較多且清晰，因此確定引物UBC807和UBC808的最優退火溫度為 50% 。

同樣，根據上述原則，為10條引物確定其最適退火溫度（表5）：分別為 50.50，60.2，53.2，53.2，53.2， 54.8，50，50，54.8‰ 0

3.2居群種群遺傳多樣性

由表6可知，對鉆天柳5個天然種群29株個體進行ISSR-PCR擴增，共擴增出270個位點。

10條ISSR引物的多態性條帶比例（PPB）范圍為 66.67%～100% ，平均值為 91.91% ，在物種水平上，多態性條帶為 92.22% 。

從圖4和圖5可知：各種群Shannon表型多樣性指數 （I） 和Nei's基因多樣性指數 （He） 分別為0.125 1～0.358 8 和 0.0828～0.2360 ，平均值分別為0.2277和 0.1504 。小興安嶺北部居群的種群遺傳多樣性水平最高 ′_{I=0.3588，He=0.2360}， ，小興安嶺南部種群、小興安嶺中部種群、大興安嶺北部種群、大興安嶺南部種群的遺傳多樣性水平呈依次遞減趨勢。鉆天柳物種水平 I 和 He 分別為0.2202和0.1653，這表明鉆天柳有一定的遺傳變異。

3.3居群間的種群遺傳結構與遺傳距離

由表7可知，鉆天柳種群間的遺傳分化系數（Nei，1987）GST =0.2303 。Wright（1965）研究表明[23]，當物種種群間GST值大于0.25時，遺傳分化程度較高；當GST介于0.15-0.25時，表明遺傳分化較為顯著；GST值在0.05-0.15時，分化程度為中等；而當GST小于0.05時，遺傳分化程度則較低。因此，鉆天柳種群之間的遺傳分化程度較為顯著，居群間有基因流。

天然居群間種群的遺傳距離和遺傳相似度是評估物種親緣關系的重要參數。遺傳距離越大，種群之間的親緣關系越遠；遺傳相似度則呈相反趨勢[24]。根據表8的數據顯示，5個鉆天柳天然種群的遺傳相似度為 0.8867～0.9651 ，平均值為0.9349，遺傳距離介于 0.0355～0.1203 ，這表明5個鉆天柳天然種群之間存在較為緊密的親緣關系，可能來源于相同的起源。其中，小興安嶺南部與大興安嶺北部居群親緣關系最遠，遺傳相似度為0.8867，遺傳距離為0.1203；而大興安嶺北部居群與大興安嶺南部居群親緣關系最近，遺傳相似度為0.9651，遺傳距離為 0.0355 。

由圖6可知，鉆天柳29株個體分為4大組群，其中組群1由呼瑪06、09組成;組群2由佳木斯湯原01、02組成；組群3由新林、烏馬河、黑河、湯旺河、朗鄉、加格達奇和伊美組成；組群4由嘉蔭、阿木爾、南岔、美溪、友好、塔河和圖強組成。

3.4居群種群遺傳多樣性與生境相關性分析

鉆天柳野生資源多分布在海拔 167～551m 的河流兩側，地理范圍為 122^°33^′04.19\"～130^°39^′21.95\"E ，47^°07^′00.39\"～52^°58^′43.04\"N ，所有分布點均分布在河岸防護林帶內。該區域植被類型為寒溫帶和溫帶落葉闊葉混交林，土壤類型包括草甸土、沼澤土、沖積土以及暗棕壤。

鉆天柳種群分布呈現出間斷的“島狀\"或“點狀\"特征，甚至僅有少量個體零星分布，生境破碎化程度較為嚴重。18個分布點總計753株鉆天柳個體，其中加格達奇泔河種群最大，有428株個體，塔林林場、朗鄉保護區、南岔縣、美溪和烏馬河寶宇樣地株數均少于10株，并且結果的植株數量極為稀少，僅占總植株數量的 6.91% ，除大興安嶺加格達奇泄河種群林下幼苗數量較為豐富外，其余種群林下幼苗數量均偏少。這表明鉆天柳種群的結果率和幼苗轉化率較低，種群規模較小，面臨較為嚴峻的瀕危狀況。

運用R語言對表示鉆天柳居群遺傳特征的參數利用普通最小二乘（OLS）回歸、Pearson法和Anova法做逐步回歸、相關性和單因素方差分析，將鉆天柳6個ISSR遺傳多樣性指數引為因變量，分別是Shannon信息指數、多態位點數、多態位點百分數、Nei's多樣性指數、等位基因數、有效等位基因數，將每個采樣點搜集的3個生境因子，分別是緯度、海拔、郁閉度作為自變量，引入變量 P 值為0.05，剔除變量 P 值0.10，普通最小二乘（OLS）回歸模型較好的擬合了數據， R² 值為0.999（表9）。

當海拔在 548m 時，Shannon's信息指數、Nei's基因多樣性指數最高，平均比基準海拔高0.1341和0.0875。生境因子海拔高度與Shannon信息指數、Nei's基因多樣性指數與其之間存在顯著的相關性，隨著海拔的增高呈現不同的相關關系。海拔高度對Shannon信息指數、Nei's基因多樣性指數的解釋度均為 99.7% ，表明模型非常好地擬合了數據。方差分析也都達到顯著水平 （Plt;0.05） ，引入的截距項系數也都各自與Nei's基因多樣性指數、Shannon信息指數顯著相關 （Plt;0.05） ，其余生境因子與遺傳多樣性指標無顯著相關性。

由分析可知，海拔 548m 的樣地位于小興安嶺北部，位于大小興安嶺的交界地帶，物種組成相對豐富、具有寒溫帶和溫帶的生態特征，基因流較大，表現了較強的遺傳多樣性。

4結論與討論

4.1結論

研究結果顯示，鉆天柳基因組DNA的OD260/OD280值為1.67～1.84，條帶清晰且明亮，無拖尾或彌散現象。這表明鉆天柳基因組DNA未受RNA、蛋白質及多糖等雜質的污染，滿足ISSR分子標記技術的要求。經過初篩和復篩，選出重復率好、多態性高、特異性強的10條引物，分別為807、808、809、834、880、881、885、886、890和891，其退火溫度分別為50、50、60.2、53.2、53.2、53.2、54.8、50、50、54.8℃。

鉆天柳居群種群遺傳多樣性相對較豐富，10條ISSR引物多態條帶百分率（PPB）為 66.67%～100% ，平均值為 91.91% ，在物種層面，多態性條帶的百分比達到了 92.22% 。各種群的Shannon表型多樣性指數 （I） 和Nei's基因多樣性指數 （He ）分別為 0.1251～ 0.3588和 0.0828～0.2360 ，平均值分別為0.2277和0.1504。鉆天柳物種水平 I 和 He 分別為0.2202和0.1653，有一定的遺傳變異。當海拔在 548m 時，Shannon's信息指數、Nei's基因多樣性指數最高，平均比基準海拔高0.1341和 0.0875 。

鉆天柳種群間遺傳分化系數 （Nei，1987）G_SI= 0.2303，基因流為1.6709。其種群間遺傳分化程度明顯，居群間有基因流。5個鉆天柳天然居群保持著較近的親緣關系，遺傳相似度介于 0.8867～0.9651 之間，平均值為0.9349，遺傳距離介于 0.035 5～ 0.1203。其中，小興安嶺南部與大興安嶺北部居群親緣關系最遠，遺傳相似度為0.8867，遺傳距離為0.1203；而大興安嶺北部居群與大興安嶺南部居群親緣關系最近，遺傳相似度為0.9651，遺傳距離為0.035 5。

采集的19個種群50株個體中有效數據為5個天然居群29株個體，最終將29株個體分為4大組群，其中組群1由呼瑪06、09組成;組群2由佳木斯湯原01、02組成；組群3由新林、烏馬河、黑河、湯旺河、朗鄉、加格達奇和伊美組成；組群4由嘉蔭、阿木爾、南岔、美溪、友好、塔河和圖強組成。

4.2討論

物種的遺傳多樣性水平是其適應環境能力的重要指標，遺傳多樣性越高，適應環境的能力通常越強[28]。一般而言，瀕危物種和分布范圍狹窄的物種往往遺傳多樣性較低。研究結果顯示，鉆天柳具有較高的遺傳多樣性，其多態性條帶百分率（PPB）平均值為 91.91% ，物種層面的多態性條帶百分率為 92.22% ，顯著高于植物平均多態性條帶百分率0 71.02% ）。植物遺傳多樣性的主要來源是遺傳變異與基因交流[25]。鉆天柳的基因流為1.6709，表明其種群間存在一定的遺傳信息交流，但遺傳分化較為顯著。作為溫帶和寒溫帶闊葉混交林河岸生態系統中的標志性物種，鉆天柳可能起源于一個在溫帶及寒溫帶廣泛分布、具有相對豐富遺傳基礎的祖先。然而，隨著生境片段化的加劇，基因流受到阻礙，鉆天柳仍保留了一部分祖先的遺傳多樣性。此外，作為長壽命、異花授粉的樹種，這些特性有助于維持其遺傳變異水平。因此，綜合分析表明，鉆天柳的遺傳多樣性主要來源于顯著的遺傳變異。

通常認為，物種種群的遺傳結構是生活史、交配系統、種子傳播機制、基因流以及地理分布等多種因素綜合作用的結果[26]。鉆天柳采用異交交配系統，這可能是其種群內遺傳分化較大的重要原因之一。其果實為蒴果，種子體積微小。在野外考察和采樣過程中發現，鉆天柳幼苗分布較為分散，由此推測鉆天柳主要依靠風力進行種子傳播，這可能是其基因流相對較強的主要原因。相關研究表明，基因流的強弱對物種種群的遺傳分化具有顯著影響[27]。當物種的基因流值低于1時，便無法有效抵消遺傳漂變導致的種群間遺傳分化[28]。鉆天柳的基因流值 M_n=1.6709 ，遠高于1，表明其不易發生遺傳漂變，因此對遺傳分化的影響較小。UPGMA聚類分析結果顯示，各種群的聚類位置與其地理分布位置并不完全一致。例如，加格達奇單株與朗鄉單株雖地理距離較遠，但卻歸為同一群組，而與其地理位置較近的南岔單株和美溪單株則聚為另一群組。這表明，地理隔離對鉆天柳種群的遺傳分化影響并不顯著。

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