蝴蝶蘭莖段組織石蠟切片方法的優化研究

摘" 要：蝴蝶蘭莖部著生、潛伏于葉基部的腋芽在適宜環境下能夠萌發并伸長分化形成花梗，其分化過程的顯微觀察是探明蝴蝶蘭花發育進程及影響因素的重要研究內容之一。為了建立一套適用于軟硬相連接的帶腋芽莖段的石蠟切片方法，以蝴蝶蘭金蝶（Phalaenopsis Lioulin Phoenix ‘LM41’）帶腋芽的莖段為試驗材料，針對主要影響石蠟切片效果的固定時長、軟化液濃度和軟化時長、脫水等制備步驟進行優化。結果表明：固定時對固定液抽真空并延長固定時間至48 h及以上有利于固定液充分滲透，材料固定效果最佳；使用濃度為10%、12%的氫氟酸溶液軟化12、15"d并在軟化期間抽真空30"min，可使木質化程度較高的莖段組織脆度和硬度大大降低，達到切片的軟硬度要求，有效解決軟化不均勻造成的組織分離破碎問題；脫水處理設置從30%～100%乙醇的7個逐級脫水梯度，并增加無水乙醇到二甲苯逐漸置換的步驟，可以避免蝴蝶蘭組織材料收縮變形，保證組織形態的完整性。優化后的制備方法解決了常規石蠟切片中蝴蝶蘭帶腋芽莖段（含軟硬相連接組織）的軟化不徹底、組織與石蠟分離、蠟帶皺縮破碎、切片空洞等問題，所獲切片的整體結構趨于完整，染色均勻且鮮艷，各部位組織細胞著色明顯，能清晰區分開幼嫩的芽組織和木質化的莖組織。本研究形成了一套適用于蝴蝶蘭帶腋芽莖段（含軟硬相連接組織）的石蠟切片制備方法，為深入研究蝴蝶蘭潛伏腋芽萌發的分化過程提供技術基礎。

關鍵詞：蝴蝶蘭；腋芽；莖；石蠟切片中圖分類號：S682.31 """""文獻標志碼：A

Optimization of Paraffin Section Method of Phalaenopsis Tissue

FENG Caiyun^1，2， HE Yaping^1，2， LYU Fubing²， CHEN Heming²， YAN Shijuan³， AI Ye^1*， XIAO Wenfang^2*

1. College of Landscape Architecture and Art， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 2. Environmental Horticulture Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences / Guangdong Key Laboratory of Ornamental Plant Germplasm Innovation and Utilization， Guangzhou， Guangdong 510640， China; 3. Agro-biological Gene Research Center， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510640， China

Abstract： The axillary buds， which are embedded in the stem of Phalaenopsis and lurked at the base of leaves， can germinate and elongate to form pedicels under suitable conditions. The microscopic observation of the differentiation process is one of the important research contents to understand the flower development process and influencing factors of Phalaenopsis. In order to establish a paraffin section method for two different tissues with soft and hard connection， the stem segment with axillary bud was used as the test material. The preparation steps， such as fixed time， softening liquid concentration and softening time， dehydration， etc.， which mainly affect the paraffin section effect， were optimized. The results showed that vacuuming the fixative and extending the fixative time to 48 h or more were conducive to the full penetration of the fixative， and the fixative effect was the best. Using 10%， 12% hydrofluoric acid solution to soften for 12， 15 days and vacuuming for 30 min during softening could greatly reduce the brittleness and hardness of stem tissues with high lignification degree， meet the soft and hard requirements of sections， and effectively solve the problem of tissue separation and fragmentation caused by uneven softening. Dehydration treatment was set up with 7 step by step dehydration gradients from 30% to 100% ethanol， and the gradual replacement steps of anhydrous ethanol to xylene were added， which could avoid the shrinkage and deformation of tissue materials of Phalaenopsis and ensure the integrity of tissue morphology. The optimized preparation method avoids the problems such as incomplete softening， separation of tissues from paraffin wax， crumpling and crushing of wax bands， and cavity of sections caused by conventional preparation of the stem segment of the axillary bud of Phalaenopsis girdle， etc. The overall structure of the obtained sections tends to be complete， the staining is uniform and bright， and the tissue cells in each part are obviously colored. Young bud tissue and lignified stem tissue can be clearly distinguished. In this study， a set of paraffin section preparation method was developed which could be applied to the stem segment of Phalaenopsis axillary bud， a soft and hard tissue material， and would provide a technical basis for further study on the differentiation process of latent axillary bud germination of Phalaenopsis.

Keywords： Phalaenopsis; axillary bud; stem; paraffin section

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.07.009

蝴蝶蘭為蘭科（Orchidaeeae）蝴蝶蘭屬（Phalaenopsis Blume）多年生草本植物，因花姿如蝴蝶飛舞而得名，素有“洋蘭皇后”之美譽。蝴蝶蘭因其花型奇特、花色艷麗、花期長久，深受消費者的喜愛，是目前蘭科植物中商品化程度最高的種類，產業規模不斷擴大，產量逐年遞增，繁殖栽培更加專業化、工廠化^[1]。同時，消費者對蝴蝶蘭的觀賞性與品質要求也不斷提升。蝴蝶蘭的花序（花梗）由莖基部的潛伏芽萌發并伸長形成，每一片葉基部的莖段上都有一大一小2個潛伏芽，一般只有大的潛伏芽在適宜的環境下會萌發形成花序。研究并掌握潛伏芽的生長發育規律，對蝴蝶蘭商業化生產中采取恰當的管理措施進行催花有重要的指導意義。

石蠟切片是細胞組織學和發育生物學研究中常用的一種用于觀察植物顯微結構的試驗手段，通常步驟包括取材、固定、脫水、透明、透蠟、包埋、切片、貼片、染色、透明、封片等。由于石蠟切片具有成本低、易操作、可連續切片及能永久保存等優點，被廣泛應用于發育生物學、植物解剖學及分子生物學等研究領域^[2-6]。傳統的石蠟制片方法對具有不同組織結構的樣品并不完全適用，因而需要根據組織結構特點摸索適用的制片方法^[7]。蝴蝶蘭極端縮短的莖段與腋芽緊密相連，觀察發現莖段木質化嚴重但花芽組織非常幼嫩，2種不同的組織結構軟硬度差異極大，因此在進行石蠟切片制作時，采用常規的軟化方法無法獲得完整的蠟帶，后續切片過程中也常伴有脫片、疊片的情況，導致最終無法進行微觀形態觀察。石蠟切片現有技術中尚無針對2種不同軟硬度組織緊密連接的樣品進行優化的制片方法。近年來多花梗型蝴蝶蘭越來越受市場青睞，因此腋芽發育形成花梗的過程是現今蘭花產業研究的熱點和重點之一，但石蠟切片制作方法的不完善嚴重影響對腋芽萌發成花梗的微觀形態觀察研究。

鑒于所需，本研究以蝴蝶蘭金蝶的莖段及其腋芽為試驗材料，在傳統石蠟切片的基礎上，根據蝴蝶蘭莖段和潛伏芽的生長特點及組織軟硬度的差異，對石蠟切片的固定、脫水、透明等制備步驟進行優化，既能夠保證不傷害幼嫩腋芽又能使較硬莖段很好的達到軟化效果，形成一套能夠應用于不同軟硬度相接的植物組織材料石蠟切片的制備方法，以期為深入研究蝴蝶蘭潛伏腋芽萌發的機制和微觀形態結構提供技術基礎。

1 "材料與方法

1.1" 材料

供試蝴蝶蘭品種為具5～6片葉片且無病蟲害、株高約為10 cm的蝴蝶蘭金蝶二年生苗。種植在廣東省農業科學院環境園藝研究所溫室大棚。

試劑：FAA固定液（由5%甲醛、5%乙酸、90%的50%質量分數的乙醇組成）、無水乙醇、二甲苯、固體石蠟、氫氟酸、番紅染液、固綠染液、中性樹脂。

儀器：石蠟切片機、生物顯微鏡、鼓風干燥箱、恒溫箱、染色缸、載玻片、蓋玻片、燒杯、量筒等。

1.2 "方法

1.2.1" 取材與固定" 將新鮮的蝴蝶蘭植株剝去葉片并切掉不定根等部位，保留莖及其腋芽，切取的組織長度為10～12"mm，直徑為3～10"mm，將組織迅速投入到30 mL 50% FAA固定液中進行固定。對固定液抽氣3次以排除材料中細胞間隙的空氣，分別固定48 h備用。植物組織與固定液的質量體積比為1∶20。

1.2.2" 軟化 "軟化過程中設置不同的軟化液濃度和軟化時間進行技術優化（表1）：將固定后的組織材料放入塑料染色缸中，分別采用30"mL的10%、12%、15%不同梯度濃度的氫氟酸軟化液中抽真空30 min，密封，放入55"℃鼓風干燥箱中進行軟化，各濃度氫氟酸溶液分別軟化12、15"d。當用拇指和食指輕輕按壓組織時，組織按壓得動且有彈性時，即軟化完成。軟化后的組織放入到流水中過夜洗至中性，以便于后期染色。以傳統甘油乙醇軟化處理的材料為對照。

1.2.3" 脫水" 將軟化后的材料用流水沖洗，去除材料表面的軟化劑后放入脫水盒中。將脫水盒放進吊籃里置于脫水機內采用不同濃度梯度的乙醇進行脫水。在常規脫水方法^[8-9]的基礎上優化脫水方案（表1），具體步驟為：30%乙醇中保持2 h；50%乙醇中保持2 h；70%乙醇中保持2 h；80%乙醇中保持1 h；90%乙醇中保持1 h；無水乙醇中保持2 h；二甲苯-無水乙醇混合液（體積比1∶1）中保持1 h；后在二甲苯中保持2 h。

1.2.4" 浸蠟" 在65"℃恒溫箱中將脫水完成后的材料浸入融化的石蠟中1 h，然后更換融化的石蠟浸蠟1 d，再次更換融化的石蠟浸蠟1 d。

1.2.5" 包埋" 將浸好蠟的組織置于包埋機內進行包埋。先將融化的蠟放入包埋框，待蠟凝固之前將組織從脫水盒內取出，按照包埋面的要求放入包埋框并貼上對應的標簽。于?20"℃凍臺上冷卻，蠟凝固后將蠟塊從包埋框中取出并修整蠟塊。

1.2.6" 切片與展片" 將修整好的蠟塊置于石蠟切片機中進行切片，厚度選擇4"μm。切片漂浮于攤片機40"℃溫水上將組織展平，利用載玻片將組織撈起，除去多余的蒸餾水，并在40"℃烘箱內烤片。水烤干、蠟烤化后取出常溫保存，備用。

1.2.7" 脫蠟及復水 "晾干后的切片必須經脫蠟和復水才能在水溶性染液中完成染色^[10-11]。將切片放入二甲苯中保持8 min，在純二甲苯與無水乙醇混合液（體積比1∶1）中保持3"min；在無水乙醇中保持3"s；在90%乙醇中保持3 s；在80%乙醇中保持3 s；在70%乙醇中保持3 s；在50%乙醇中保持3 s；在30%乙醇中保持3 s；在純水中保持3 s。

1.2.8" 染色" 染色采用番紅－固綠雙重染色法。組織切片放入番紅染液中1～2"min后水洗；在50%乙醇中保持3 s；在70%乙醇中保持3 s；乙醇晾干后，切片放入固綠染液1 min；隨后切片經過3次無水乙醇快速脫水，每次3 s。

1.2.9" 透明封片" 將染色完成的切片放入二甲苯透明5"min，后用中性樹膠封片。從側面慢慢移動蓋上蓋玻片，在恒溫箱中40"℃烘干或置于室內自然晾干并貼標簽。隨后進行顯微觀察并拍照。

2" 結果與分析

2.1 "固定方法的優化

為了探究最優固定時間，采用50% FAA為固定液，以傳統固定時長24 h為對照。通過后期切片鏡檢對比2種固定時間（24 h和48 h）的石蠟切片效果，發現24 h固定處理下的切片結構受損較嚴重，效果較差，中間樣本組織出現明顯破損，可能是由于固定時間不夠，切片時組織無法與蠟塊緊密貼合致使蠟帶粉碎，最終導致鏡檢的組織

結構破損變形；48 h固定處理后的切片中，大部分蠟帶連續，組織結構基本完整（圖1）。結果說明延長固定時間至48 h有利于固定液充分滲透，其效果優于傳統制作方法，有效解決了細胞結構變形、固定不夠徹底造成組織破碎的問題。

2.2 "軟化方法的優化

采用3種不同濃度的氫氟酸軟化液和2種軟化時間進行改良試驗，以傳統甘油－乙醇混合液分別軟化12 d和15 d為對照。優化后的固定方法為50% FAA固定液固定48 h。有研究表明，軟化期間的真空處理有助于軟化劑快速滲入到樣本中，從而有效提高軟化效率，未經真空處理獲得的組織材料軟化效果較差，后續浸蠟不完全，切片時蠟片不易連成蠟帶，攤片時皺折多，影響制片效果。因此，本研究均進行抽真空30 min處理。不同軟化處理對切片效果的影響見圖2。通過對比不同軟化方法的石蠟切片，發現使用10%和12%氫氟酸溶液分別浸泡12 d和15 d，均能有效降低蝴蝶蘭莖段組織硬度，從而達到切片的軟硬度要求，切片呈蠟帶狀，組織結構均較為完整，但存在組織皺縮現象（圖2A）；然而，當氫氟酸溶液濃度提升至15%時，即使只浸泡12"d，材料仍出現了過度軟化的現象，組織松散易解離導致浸蠟不徹底，所得切片材料中間出現了較多的空洞，組織結構皺縮變形（圖2B）；使用的傳統甘油-乙醇軟化液即使浸泡15 d，蝴蝶蘭組織材料形狀的改變不明顯，材料相對較硬，組織材料結構破損嚴重，耗時久且效果差（圖2C）。因此，濃度為10%、12%的氫氟酸軟化劑均能有效軟化高木質化的莖段組織至硬度適中的程度，對于以上軟化方法中存在的切片組織材料皺縮現象，需要進一步優化其脫水處理。

由以上結果可知，經過10%、12%氫氟酸溶液浸泡12、15 d后并在軟化期間真空30 min的蝴蝶蘭組織能夠與石蠟融合成不可分離的狀態，能夠得到連續的蠟帶，有效降低后續浸蠟處理的難度。基于高效節儉的原則，最終選擇10%氫氟酸，真空30 min，軟化12 d為最優軟化處理。

2.3 "脫水方式的優化

參照李和平^[12]的乙醇梯度脫水法制定脫水優化方案，以傳統脫水處理為對照，探究不同的脫水過程對蝴蝶蘭莖段組織石蠟切片制作效果的影響。發現傳統方法從較高濃度起始進行脫水，樣品組織迅速失水干癟，影響后續的浸蠟及包埋，切片皺縮嚴重，無法展平（圖3A）。結合蝴蝶蘭主莖木質化程度高、硬度較大等特征，在傳統方法的基礎上依次增加了30%乙醇、50%乙醇、1∶1苯醇和二甲苯梯度溶液，脫水過程逐級細分，由低濃度到高濃度逐級進行脫水，材料無變形破碎現象，所得蠟片切片效果好，切出的蠟片呈現完整蠟帶，且蠟帶平整無缺損（圖3B）。因此，蝴蝶蘭組織脫水的最優處理為30%乙醇保持2 h，50%乙醇保持2"h，70%乙醇保持2"h，80%乙醇保持1"h，90%乙醇保持1"h，無水乙醇保持1"h，無水乙醇保持1"h，1∶1苯醇保持1"h，二甲苯保持2 h。

2.4" 優化方法效果驗證

石蠟切片中植物組織形態和結構是否完整，細胞是否清晰是判斷切片質量的主要指標^[13]。為驗證優化后的石蠟切片方法的效果，選取長勢一致，長度為10～12 mm、直徑為3～10 mm的帶腋芽莖段樣品30個，傳統石蠟切片方法處理與優化石蠟切片方法處理各15個。結果表明：選用傳統處理方法所獲切片效果較差，切片時蠟帶粉碎，無法形成完整的蠟帶，中間組織皺縮變形嚴重，芽組織出現明顯破損，切片分色效果不明顯，難以清晰鑒別蝴蝶蘭腋芽的生長狀況（圖4A），說明該方法可能無法較大程度地軟化樣本木質部的硬度。優化后的制片方法能夠得到連續的蠟帶，其效果優于傳統制作方法，處理后2種軟硬度相連接的組織材料細胞均較完好，能有效保持組織原有形態并解決細胞結構變形、固定不夠透徹造成組織破碎的問題，所獲切片的整體結構趨于完整；后續染色效果好，各部分組織細胞著色明顯，并能清晰區分開柔軟的芽組織和木質化的莖組織（圖4B），說明優化后的石蠟切片方法適用于軟硬相接的蝴蝶蘭的帶腋芽莖段的微觀形態觀察。

3" 討論

本研究針對硬組織和軟組織相連接的2個部位進行綜合考慮，優化了適合2種材質相連接的組織的石蠟切片制作方法，對固定時間、軟化液、

軟化時間、軟化步驟、脫水等制備步驟進行了優化，探索得到適合2種軟硬度相連接的蝴蝶蘭組織材料的最佳石蠟切片制作方法。改良后的石蠟

切片制備方法保證了對幼嫩腋芽組織破壞性較小的同時又能達到木質化主莖部位的軟化要求。

3.1 "不同固定時間和處理對固定效果的影響

固定是石蠟切片標本制作的關鍵環節，其作用在于使蛋白質變性、凝固、沉淀，保持細胞、組織的原有形態^[14-15]。固定時間受材料性質、固定液、環境條件等因素影響，差別較大^[16]，固定時間對于獲得高質量的切片至關重要，固定時間不對均會對組織的物理特性（如硬度、彈性等）產生不同的影響。固定時間過短，會導致組織錯位破碎，切片時無法與蠟塊緊密貼合導致蠟帶粉碎，無法達到固定目的；固定時間過長，則影響組織材料的染色性能，導致染色不均勻。因此，適宜的固定時間更易獲得硬度適中，結構完整的切片。康云艷等^[8]在黃瓜幼苗莖段石蠟切片制作的固定流程中將FAA固定時間由24"h延長至1周，確保固定液充分滲透組織，獲得了蠟帶連續、切片組織完整的高質量切片。為了防止后期包埋蠟塊過程中材料受熱釋放空氣，表面出現氣泡影響切片質量，固定時需要對固定液抽氣3次以排除材料中細胞間隙的空氣，直到液體中不再有氣泡產生。抽氣還可使固定液快速滲透到組織內部，從而起到良好的固定效果，確保后續操作中蠟塊的質量和切片的清晰度。抽氣的次數和時間可根據材料的類型和具體要求進行調整。權金娥等^[13]將四倍體刺槐的插穗基部組織放入改良的FAA固定液中，對固定液抽真空至莖段組織下沉后保

存至少48"h，并以不進行抽真空為對照，結果表明，在固定處理中添加抽真空步驟所制得的四倍體刺槐莖段組織切片表皮完整，細胞無萎縮變形，切片效果更好。本研究中，為了讓固定液充分滲透，保持組織原有形態，將固定時間由24 h延長至48"h，并采用抽氣機抽氣排除固定液中氣泡的干擾，得到的切片成蠟帶狀、平整且無缺損。由此可見，在蝴蝶蘭軟硬相接組織的石蠟切片制樣過程中，對固定液進行抽真空和采用適宜的固定時間更易獲得硬度適中，結構完整的切片。這與張寶華^[17]的研究結論一致。

3.2" 不同氫氟酸濃度和處理時長對石蠟切片軟化的影響

對于蝴蝶蘭這類存在莖段與腋芽的軟硬度差異極大的材料，其各部分組織在硬度和密度上的不均勻是影響石蠟切片制樣效果的重要原因。非均質化組織很難按照傳統石蠟切片制樣方法得到完整、高質量切片^[6]。因此，適宜的軟化過程為石蠟切片制作的首要條件^[18]，如果對纖維化程度強、硬度較大的材料未進行相應的軟化處理，會導致后續制片過程中的脫水劑與石蠟等物質無法徹底滲入材料組織而影響浸蠟效果，切片時會出現蠟帶分離破碎現象。

石蠟切片中常用的軟化處理方法是甘油乙醇軟化法^[19]，甘油使組織材料柔軟易切，乙醇穿透組織能力強，可加快軟化速度，增加組織韌性。但因蝴蝶蘭莖段與腋芽的軟硬度差異極大，常規的甘油乙醇軟化方法無法平衡二者的軟化程度獲得完整的蠟帶，導致后續切片過程中也常伴有脫片、疊片的情況。氫氟酸軟化法常用于中藥材等的軟化處理，可很好地軟化木質化程度高的脆硬材料^[20]，也可通過低濃度長時間的浸泡方式軟化草本或質地較軟的木本植物組織^[21]，但由于氫氟酸具有強腐蝕性，會破壞材料的組織結構，需針對不同材料優化濃度和浸泡時間等^[22-24]。安菊紅等^[18]根據8種不同入藥部位藥材不同纖維強度分別進行相應的軟化處理，對于木質化程度強的桂枝，含有纖維及石細胞的厚樸、黑根藥等采用氫氟酸水溶液在加熱環境下進行軟化，能有效達到軟化目的。程茂高等^[25]發現，僅用煮沸、浸泡的方法處理質地堅硬的骨碎補無法達到理想的軟化效果，還需用15%氫氟酸進一步軟化。李葉等^[26]針對桑樹花芽表層木質化程度較高的特性，采用15%氫氟酸溶液軟化處理10"d，有效解決了軟化不均勻造成的材料卷曲、材料破裂及部分組織分離和折疊問題。本研究選用氫氟酸溶液作為軟化劑，發現使用濃度為10%、12%的氫氟酸溶液軟化12、15"d并在軟化期間真空30"min，可以使蝴蝶蘭莖段的脆度和硬度大大降低，切片時組織不易碎，切片組織結構完整。軟化過程的真空處理有助于去除材料中的空氣，促進軟化劑迅速滲入組織內部，提高軟化效率^[27]。優化后的制備方法保證了對幼嫩腋芽細胞組織破壞性較小的同時又能達到木質化主莖部位的軟化要求。

3.3 "不同脫水方式對石蠟切片效果的影響

脫水的主要目的是去除組織切片中的水分，使得材料與石蠟更好地結合，從而保持組織材料原有結構和形態，供后續的染色和觀察。脫水時間和乙醇梯度濃度是影響浸蠟與染色的關鍵因素。石蠟切片中的脫水時間與植物材料的性質和狀態密切相關^[27]。過快的脫水可能導致組織發生收縮和形態改變，影響切片的平整性和后續制片操作，因此脫水過程要逐步且溫和地進行，確保組織既能夠有效去除水分，又不至于過度收縮而損傷。但是脫水時間過長會使材料變硬，加大石蠟切片制樣難度，所以需要準確把握各步驟的脫水時間，避免脫水過度造成材料硬度增加。常規的脫水流程是由70%乙醇至無水乙醇逐級進行的，每級保持1～3 h，其中無水乙醇處理重復1～2次^[28]。材料為柔嫩組織時，使用高濃度乙醇對材料進行脫水容易造成組織硬化變脆，在后續切片時導致切片易碎^[7-8]，所以在選擇乙醇脫水濃度時，最佳的方式是以較低濃度作為起始脫水濃度，再使用梯度法完全脫水。高東菊等^[29]針對黃瓜果實果瘤性狀和含水量較多的結構特點，增加7個乙醇濃度梯度：50%乙醇（30"min，2次），60%乙醇（30"min），70%乙醇（30"min），80%乙醇（30"min），90%乙醇（30"min），95%乙醇（30"min），無水乙醇（30 min，2次），處理后的材料脫水徹底且不易皺縮，獲得石蠟切片制樣的最佳脫水方式和時間。左丹丹等^[30]對杉木種鱗脫水和透明時間優化處理：50%乙醇（2 h），70%乙醇（過夜），85%乙醇（2 h），90%乙醇（2 h），95%乙醇（2 h），無水乙醇（1 h，2次），可將材料徹底脫水。為了避免高濃度乙醇對蝴蝶蘭幼嫩腋芽的直接傷害，本研究根據蝴蝶蘭莖段和潛伏芽的生長特點，設置從30%至無水乙醇的逐級脫水梯度，并增加無水乙醇到二甲苯逐漸置換的步驟，避免了蝴蝶蘭組織材料收縮變形，得到了蝴蝶蘭組織石蠟切片最適脫水方法：30%乙醇（2"h），50%乙醇（2 h），70%乙醇（2 h），80%乙醇（1 h），90%乙醇（1 h），無水乙醇（1 h，2次），1：1苯醇（1 h），二甲苯（2 h）。雖然增加了總的脫水時間，但減少了后續切片中組織被切碎的風險，為后期的透明和浸蠟創造條件。因此，不同的材料脫水方式需要根據植物材料的特征進行相應的調整和優化，只有達到適當的脫水程度，才能保證組織形態的完整性、切片的穩定性和染色效果。

4" 結論

本研究以蝴蝶蘭金蝶帶腋芽的莖段為試驗材料，針對這種軟硬相接的組織材料進行綜合考慮，優化得到一套適宜的石蠟切片制作方法：固定時對固定液抽真空并延長固定時間至48 h及以上，固定效果最佳；使用濃度為10%、12%的氫氟酸溶液軟化12、15 d并在軟化期間真空30"min，可以使木質化程度較高的莖段組織脆度和硬度大大降低，有效解決了軟化不均勻造成的組織分離破碎問題；脫水處理設置從30%至無水乙醇的7個逐級脫水梯度，并增加無水乙醇到二甲苯逐漸置換的步驟，避免了蝴蝶蘭組織材料收縮變形，保證其組織形態的完整性。優化方法所制備的石蠟切片的出片質量較好，完整度較高，處理后2種軟硬度相連接的組織材料細胞均較完好，說明優化后的石蠟切片制作方法能更好地保持切片中材料組織整體細胞的完整性，并能清晰區分柔軟組織和木質化的較硬組織，能夠同時對緊密相連的2種差異組織材料開展很好的微觀形態觀察。

參考文獻

[1]"""""" 呂秉韜， 吳靜雪， 馬關喜， 金蓉， 孫德利， 胡衛珍， 陳利萍， 齊振宇. 6-BA對不同品種蝴蝶蘭開花性狀的影響[J]. 浙江農業科學， 2020， 61（6）： 1115-1118.LYU B T， WU J X， MA G X， JIN R， SUN D L， HU W Z， CHEN L P， QI Z Y. Effects of 6-BA on flowering traits of different Phalaenopsis cultivars[J]. Zhejiang Agricultural Sciences， 2020， 61（6）： 1115-1118. （in Chinese）

[2]"""""" COATES P J. Paraffin section molecular biology： review of current techniques[J]. Journal of Histotechnology， 1991， 14（4）： 263-269.

1. DAY R C. Laser microdissection of paraffin-embedded plant tissues for transcript profiling[J]. Plant Developmental Biology， 2010， 655： 321-346.
2. 閆紹鵬. 歐美山楊雜種扦插生根的理化與分子機理研究[D]. 哈爾濱： 東北林業大學， 2011.YAN S P. Study on physiological， biochemical and molecular mechanism of rooting to Populus tremula ×P.tremu-loi-des[D]. Harbin： Northeast Forestry University， 2011. （in Chinese）
3. 吳清韓， 趙慶芳， 朱慧， 馬瑞君. 植物高度木質化葉片表皮細胞制備方法[J]. 植物學報， 2012， 47（4）： 422-426.WU Q H， ZHAO Q F， ZHU H， MA R J. A method to improve sample preparation for observing epidermis of highly lignified leaf[J]. Chinese Bulletin of Botany， 2012， 47（4）： 422-426. （in Chinese）
4. 周乃富， 張俊佩， 劉昊， 查巍巍， 裴東. 木本植物非均質化組織石蠟切片制作方法[J]. 植物學報， 2018， 53（5）： 653-660.ZHOU N F， ZHANG J P， LIU H， ZHA W W， PEI D. New protocols for paraffin sections of heterogeneous tissues of woody plants[J]. Chinese Bulletin of Botany， 2018， 53（5）： 653-660. （in Chinese）

[7]"""""" 陳利娜， 薛輝， 李好先， 牛娟， 張杰， 劉貝貝， 張富紅， 趙弟廣， 曹尚銀. 石榴花芽石蠟切片制作方法的改良[J]. 安徽農業科學， 2017， 45（2）： 1-3， 16.CHEN L N， XUE H， LI H X， NIU J， ZHANG J， LIU B B， ZHANG F H， ZHAO D G， CAO S Y. Improvements of traditional paraffin section for pomegranate floral bud[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences， 2017， 45（2）： 1-3， 16. （in Chinese）

[8]"""""" 康云艷， 宋愛婷， 柴喜榮， 楊暹. 黃瓜幼苗莖段石蠟切片制作和番紅染色實驗方法改進[J]. 實驗技術與管理， 2022， 39（1）： 182-184， 190.KANG Y Y， SONG A T， CHAI X R， YANG X. New protocols for paraffin sections and safranine staining of cucumber stems[J]. Experimental Technology and Management， 2022， 39（1）： 182-184， 190. （in Chinese）

[9]"""""" 陳林， 王清隆， 王祝年. 海南龍血樹莖干石蠟切片技術的研究[J]. 安徽農業科學， 2017， 45（10）： 5-7， 21.CHEN L， WANG Q L， WANG Z N. Study on the paraffin section technology of Dracaena cambodiana stems[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences， 2017， 45（10）： 5-7， 21. （in Chinese）

[10]""" 張馨文， 劉麗萍. 蒲公英石蠟切片技術研究[J]. 特種經濟動植物， 2022， 25（10）： 18-20.ZHANG X W， LIU L P. Study on paraffin section technology of Taraxacum mongolicum[J]. Special Economic Animals and Plants， 2022， 25（10）： 18-20. （in Chinese）

[11]""" 張志誠， 程海濤. 常規植物石蠟切片方法的改進[C]//第十五屆全國中藥標本館學術研討會暨第十二屆中國中藥鑒定學教學研討會論文集， 2017： 167-168.ZHANG Z C， CHENG H T. Improvement of conventional plant paraffin section method[C]//Proceedings of the 15^th National Herbarium of Chinese Materia Medica Academic Seminar and the 12^th Chinese Materia Medica Identification Teaching Seminar， 2017： 167-168. （in Chinese）

[12]""" 李和平."植物顯微技術[M]. 北京： 高等教育出版社， 2009.LI H P. Plant microscopy[M]. Beijing： Higher Education Press， 2009. （in Chinese）

[13]""" 權金娥， 朱海蘭， 張春霞， 張勝， 趙忠. 四倍體刺槐莖段組織石蠟切片的制作方法[J]. 西北林學院學報， 2014， 29（3）： 140-144.QUAN J E， ZHU H L， ZHANG C X， ZHANG S， ZHAO Z. Preparation of paraffin section of tetraploid Robinia pseudoacacia stem segment tissue[J]. Journal of Northwest Forestry University， 2014， 29（3）： 140-144. （in Chinese）

[14]""" 張新梅， 董曉英， 沈仁芳. 水稻幼嫩根尖常規石蠟切片制作技術改良[J]. 江蘇農業科學， 2013， 41（12）： 71-73.ZHANG X M， DONG X Y， SHEN R F. Improvement of conventional paraffin cutting technique for young root tips of rice[J]. Jiangsu Agricultural Sciences， 2013， 41（12）： 71-73. （in Chinese）

[15]""" 龔志錦， 詹镕洲. 病理組織制片和染色技術[M]. 上海： 上海科學技術出版社， 1994.GONG Z J， ZHAN R Z. Pathological tissue preparation and staining techniques[M]. Shanghai： Shanghai Science and Technology Press， 1994. （in Chinese）

[16]""" 侯春春， 徐水. 淺析影響石蠟切片質量的關鍵因素[J]. 中國農學通報， 2009， 25（23）： 94-98.HOU C C， XU S. Analysis on the key influence factors of paraffin section’s quality[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2009， 25（23）： 94-98. （in Chinese）

[17]""" 張寶華. 聚焦植物石蠟切片制作[J]. 吉林省教育學院學報（下旬）， 2013， 29（4）： 153-154.ZHANG B H. Focus on plant paraffin section production[J]. Journal of Educational Institute of Jilin Province： Late， 2013， 29（4）： 153-154. （in Chinese）

[18]""" 安菊紅， 朱婷婷， 邱偉珊， 楊月， 鐘世紅. 不同入藥部位干藥材石蠟制片方法的改良研究[J]. 西南民族大學學報（自然科學版）， 2024， 50（4）： 408-417.AN J H， ZHU T T， QIU W S， YANG Y， ZHONG S H. A study on the improvement of the method for paraffin sectioning of dried herbs from different parts of the medicinal plant[J]. Journal of Southwest Minzu University （Natural Science Edition）， 2024， 50（4）： 408-417. （in Chinese）

[19]""" 胡玉熹， 林金星. 高度木質化材料軟化的簡便方法[J]. 生命世界， 2000（3）： 31.HU Y X， LIN J X. A simple method for softening highly lignified materials[J]. 2000（3）： 31. （in Chinese）

[20]""" TOMASI V H， ROVASIO R A. Softening of plant specimens （Equisetaceae） to improve the preparation of paraffin sections[J]. Biotechnic amp; Histochemistry 1997， 72（4）： 209-212.

[21]""" 河南牧業經濟學院. 文冠果扦插枝條及其愈傷組織的石蠟制片方法： CN201810977753.6[P]. 2021-06-25.Henan University of Animal Husbandry and Economy. Para-f-fin paraffin preparation of cuttings and callus of Xanthoceras sorbifolium Bunge： CN201810977753.6[P]. 2021-06- 25. （in Chinese）

[22]nbsp;"" 程蓮銀. 干、硬中藥材作石蠟切片的技術處理方法[J]. 中國藥師， 2000（6）： 374.CHENG L Y. Technical treatment method for paraffin sections of dry and hard Chinese herbal materials[J]. China Pharmacist， 2000（6）： 374. （in Chinese）

[23]""" 徐彥， 陳佳正， 吳春蕾， 張志鋒. 11種常用中藥材在石蠟切片中的軟化處理方法[J]. 西南民族大學學報（自然科學版）， 2010， 36（4）： 603-605.XU Y， CHEN J Z， WU C L， ZHANG Z F. Study on the softening method of 11 kinds of Chinese material medica for preparing paraffin sections[J]. Journal of Southwest Minzu University （Natural Science Edition）， 2010， 36（4）， 603-605. （in Chinese）

[24]""" 尤華明， 劉銀春， 劉寶， 陳峰. 竹桿、馬尾松莖木質材料超薄切片技術[J]. 福建林學院學報， 2007， 27（4）： 376-379.YOU H M， LIU Y C， LIU B， CHEN F. Technique of ultrat-hin slicing of bamboo and Pinus massoniana stems[J]. Journal of Fujian College of Forestry， 2007， 27（4）： 376-379. （in Chinese）

[25]""" 程茂高， 喬卿梅， 魏志華， 韋小敏， 楊瑾， 李苗青. 不同軟化方法對干燥骨碎補石蠟切片的影響[J]. 中獸醫醫藥雜志， 2015， 34（3）： 29-30.CHENG M G， QIAO Q M， WEI Z H， WEI X M， YANG J， LI M Q. Effect of different softening methods on paraffin section quality of dried Rhizoma Drynarias [J]. Journal of Traditional Chinese Veterinary Medicine， 2015， 34（3）： 29-30. （in Chinese）

[26]""" 李葉， 劉家糧， 武華周， 林培群， 皇晶晶， 王樹昌. 一種優化的桑樹花芽石蠟切片制作方法[J]. 熱帶農業科學， 2024， 44（4）： 58-64.LI Y， LIU J L， WU H Z， LIN P Q， HUANG J J， WANG S C. An improved method for paraffin sections of mulberry flower bud[J]. Chinese Journal of Tropical Agriculture， 2024， 44（4）： 58-64. （in Chinese）

[27]""" 吳華， 陳娉婷， 袁玲， 徐永榮， 陳龍清. 蕨類植物石蠟切片制作技術探討[J]. 湖北農業科學， 2011， 50（18）： 3767- 3769， 3774.WU H， CHEN P T， YUAN L， XU Y R， CHEN L Q. Study on the technique of making paraffin sections of fern[J]. Hubei Agricultural Sciences， 2011， 50（18）： 3767-3769， 3774. （in Chinese）

[28]""" 王灶安. 植物顯微技術[M]. 北京： 農業出版社， 1992.WANG Z A. Plant microscopy[M]. Beijing： Agriculture Press， 1992. （in Chinese）

[29]""" 高東菊， 鮑文敏， 陳岳， 潘俊松， 張微微. 黃瓜果瘤石蠟切片制片技術[J]. 分子植物育種， 2020， 18（21）： 7143-7148.GAO D J， BAO W M， CHEN Y， PAN J S， ZHANG W W. Paraffin section technology of fruit tumor tissues in cucumber （Cucumis sativus L.）[J]. Molecular Plant Breeding， 2020， 18（21）： 7143-7148. （in Chinese）

[30]""" 左丹丹， 熊升， 李佳， 饒麗莎， 林思祖， 陳宇. 杉木種鱗石蠟切片工藝優化研究[J]. 西南林業大學學報（自然科學）， 2018， 38（1）： 59-65.ZUO D D， XIONG S， LI J， RAO L S， LIN S Z， CHEN Y. Process optimization of paraffin section method for scale of Cunninghamia lanceolata[J]. Journal of Southwest Forestry University （Natural Sciences）， 2018， 38（1）： 59-65. （in Chinese）