油莎豆內生真菌分離鑒定及其代謝物活性與促生性能研究

中圖分類號：S182 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）11-0247-08

油莎豆（Cyperus esculentus L.var.sativusBaeck）是一年生的莎草科植物，有較強的抗逆性、產量高、易栽種、耐貧瘠等特點，具有降糖、抗氧化、保肝等多種藥理作用[1-5]。2010 年前，全國油莎豆種植面積不足 667hm² ，2018年形成規模種植，增加至 ，目前，我國油莎豆種植面積已超6 867hm^2[6] 。植物內生真菌是指在植物體內正常生活且對宿主植物不引起病癥的微生物，研究表明，具有促生能力的內生真菌可通過產生具有促生活性的代謝物或參與宿主植物的生長調節來提高宿主植物對營養的吸收和利用，從而促進植物生長。自前，促生內生真菌作為生物肥料在農業生產等領域中已有許多研究，相較于傳統的化學肥料，生物肥料具有改善作物品質、提高作物產量、不污染環境等諸多優點，部分內生真菌代謝產物還具有藥用價值，是研究和開發生物肥料和藥用植物的重要綠色資源，對我國農業生產具有非常重要的意義。已有許多研究早已發現，從植物中分離出的內生真菌不僅對宿主有較好的促生效果，且對非宿主植物的生長也有較好的促生效果，如對溫郁金、美人蕉、馬尾松、水稻、黃瓜和蘿卜等經濟作物有促生長作用[7]。李岷澤等研究發現，球孢白僵菌芽生孢子對番茄生長具有促進作用，可促進番茄根系的生長[8]。同樣，彭靚等從米槁根部篩選得到4株具有較強溶磷、解鉀能力及產吲哚乙酸（IAA）特性的內生真菌，研究結果表明它們對米稿幼苗皆有促進作用[9]。植物與其內生真菌的復雜關系造成了內生真菌代謝產物的多樣性，許多內生真菌的代謝產物能產生降糖、抗氧化和抗腫瘤等活性物質，包括萜類、醌類和黃酮類等[10-12]。肖澤恩等研究發現，木欖內生真菌的次級代謝產物中具有抑制 α- 葡萄糖苷酶的活性物質[13];石逸冰等從內生真菌布雷青霉菌的發酵液中分離出2個具有降血糖活性的化合物和2個具有抗氧化活性的化合物[14]。 Wu 等研究發現，多枝黃花根內生真菌的發酵液粗提物具有抗氧化活性[15]。這些內生真菌可能產生對制藥工業具有重要價值的天然化合物。油莎豆內生真菌鮮見報道[16]。本研究以分離油莎豆內生真菌的研究為切入點，分別篩選具有促生功能、能分泌 α- 葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化活性代謝產物的內生真菌。以分離的油莎豆（中油莎I）內生真菌為研究對象，篩選具有多種促生功能的促生內生真菌和代謝物具有生物活性的活性菌株，以期挖掘油莎豆的內生真菌資源，豐富生物肥料的菌種資源，為天然藥物的開發利用提供理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

油莎豆（中油莎I）于2023年9月采自廣東省韶關市瀕江區試驗田。取出整株植株裝于無菌袋中，在無菌袋上注明樣品采樣時間、采樣地點等信息，于韶關學院食品學院進行試驗。

培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、金氏培養基、蒙金娜無機磷固體培養基、蒙金娜無機磷液體培養基、蒙金娜有機磷固體培養基、蒙金娜有機磷液體培養基、解鉀培養基、解鉀液體培養基、Ashby無氮培養基、CAS培養基。

1.2方法

1.2.1 油莎豆內生真菌的分離純化 參照劉玉嬌等的方法[17]并稍作改動，將采集的油莎豆用自來水將表面的泥土沖洗干凈、濾紙吸干水分，按常規無菌操作對油莎豆進行表面消毒處理： 75% 乙醇浸泡2min ，無菌水沖洗5次， 2% 次氯酸鈉溶液浸泡1min ，無菌水沖洗5次，采用無菌濾紙吸干水分，在無菌操作條件下將油莎豆剪切成1/2大小。將上述處理過的組織塊分別放置于含有抗生素（ 20mg/L 卡那霉素和 20mg/L 氨芐青霉素）的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基和CAS瓊脂培養基上，每個平板放置3塊組織， 28^°C 恒溫培養2～7d，待切口邊緣長出菌絲，挑取不同形態的菌絲或菌落轉接至相應的新鮮培養基中，采用菌絲頂端純化法進行純化。消毒可靠性檢驗，采用漂洗液檢查法[18] C

1.2.2油莎豆內生真菌的鑒定參照Whitelaw等的方法并稍作改動[19]。生物學鑒定：分離純化后的菌株用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（生工生物）提取DNA，PCR擴增采用引物ITS1-F（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4-R（TCCTCCGCTTATTGATATGC）擴增菌株核糖體DNA內部轉錄間隔序列（internaltranscribedspacer，ITS）。將PCR擴增純化后的產物委托上海生工測序部測序，將測序得到的堿基序列在NCBI上進行BLAST比對，將所比對的相似度結果結合形態學觀察進行鑒定。

1.2.3油莎豆內生真菌促生真菌的篩選產IAA能力篩選：采用Salkowski比色法，觀察其顏色變化，采用標準曲線 （y=0. 016 4x-0. 007 3） 計算出該株菌分泌IAA的量[20-22] 。

溶磷能力篩選：將待測菌株分別接種到有機磷和無機磷培養基中，觀察有無透明圈來確定有無溶磷能力和初步判斷其能力大小[23]

解鉀能力測定：將待測菌株接種到解鉀培養基中，觀察有無透明圈來確定有無溶磷能力和初步判斷其能力大小，以有無透明圈來判斷是否具有解鉀活性[24-25] 。

產鐵載體能力測定：采用MAS-CAS檢測法，以能否在CAS培養基上產生橙黃色變化，篩選具有產鐵載體能力菌株[22]

固氮能力測定：將待測菌株接種到Ashby培養基中，以能否3代均能正常生長判斷是否具有固氮活性[24]1.2.4油莎豆內生真菌代謝物降糖活性和抗氧化性分析樣品制備：將分離得到的內生真菌在固體培養基中長滿后，接種到液體培養基中 搖床培養 ^7d 。經粗濾后 10 000r/min 離心 10min ，得到發酵液，用乙酸乙酯萃取3次，于 40°C 減壓濃縮至干，得到發酵液乙酸乙酯提取物。

（1）降糖活性研究：分別取樣品溶液（DMSO溶解的發酵液乙酸乙酯提取物， 1g/L 與 α- 葡萄糖苷酶溶液和PBS混合， 37^°C 孵育 10min ，然后加人PNPG，37^°C 反應 15min ，加人 Na₂CO₃ 終止反應，405nm 處測定吸光度值。每個樣品設3個重復，以1.0g/L 阿卡波糖為陽性對照，同時設對照組，反應液組成見表1。

用以下公式計算樣品對 α- 葡萄糖苷酶的抑制率：

式中： D_### 為加樣品溶液反應體系的吸光度；D_{#HH^#H#^#H#^#H} 為加樣品溶液不反應體系的吸光度; 為不加樣品溶液反應體系的吸光度； D_∵□ed÷x+? 為PBS緩沖液反應體系的吸光度。

（2）抗氧化活性研究：分別取樣品溶液（DMSO溶解的發酵液乙酸乙酯提取物， 1g/L ）、DPPH ? 溶液及無水乙醇，混勻， 25°C 室溫反應 30min 后，以1g/L 維生素C為陽性對照置全波長酶標儀中517nm 處測量其吸光度，反應液組成見表2。

每個樣品做3個重復孔，并做3次重復試驗，取其平均值。樣品對DPPH ? 的清除率根據以下公式計算：

清除率 。

式中： D_### 為加樣品溶液反應體系的吸光度；D_#H#H## 為加樣品溶液不反應體系的吸光度; D_BH?H?X?HH 為不加樣品溶液反應體系的吸光度; D_∵□ed? 為無水乙醇的吸光度。

2 結果與分析

2.1油莎豆內生真菌的分離

由圖1可知，從油莎豆中共分離出16株內生真菌，分離數量較少。油莎豆表面殺菌采用的是毒性較弱的次氯酸鈉溶液，殺菌時間較長可能會殺死部分內生真菌，其次采用普通培養基分離，目前的技術很難模擬出植物體本身，不能完全分離出油莎豆中所有內生真菌。

2.2油莎豆內生真菌的鑒定

由表3可知，通過對分離得到的16株油莎豆內生真菌測序，將測序得到的堿基序列在NCBI上進行BLAST比對。10株分別鑒定為鐮刀菌屬、鐮刀菌屬、鐮刀菌屬、鐮刀菌屬、鐮刀菌屬、鐮刀菌屬、曲霉屬、曲霉屬、曲霉屬和籃狀菌屬；6株分別鑒定為腐皮鐮孢、尖孢鐮刀菌、云芝栓孔菌（變色栓菌）、奧朗蒂亞庫斯塔拉諾菌、尖孢鐮刀菌和新月彎孢霉。利用MEGA6.1序列分析軟件繪制系統發育進化樹（圖2）。

2.3油莎豆內生促生真菌篩選

2.3.1產IAA能力菌株篩選Salkowski比色法是通過氧化反應顯色定性分析和比色反應定量分析菌株產IAA的能力。由圖3可知，定性結果為粉色的深淺代表其產IAA能力的強弱，篩選出3株內生真菌具有產IAA功能，分別為菌株YSD-C5、YSD-P2、YSD-P5，結果表明其具有不同強度的產IAA能力。由表4可知，菌株YSD-P5產IAA能力最強，達39.10mg/L ，菌株YSD-P2產IAA 能力其次，達7.09mg/L ，菌株YSD－C5產IAA 能力最差，為5.83mg/L ，與定性結果一致。

2.3.2溶磷能力菌株篩選由圖4可知，篩選出6株內生真菌具有溶解有機磷功能，其具有明顯的溶磷透明圈，分別為YSD-P10（1.48）、YSD-P9、YSD-P8、YSD-P5、YSD-P4、YSD-C5。由圖5可

知，篩選出3株內生真菌具有溶解無機磷功能，有明顯的溶磷透明圈，分別為YSD-P8、YSD-P10、YSD-P9。通過比較溶磷圈的大小初步判斷其溶磷能力強弱（表5）可知，菌株YSD-P8溶解有機磷的能力最強，菌株YSD-C5溶解有機磷的能力最弱；菌株YSD-P8溶解無機磷的能力最強，溶解有機磷的能力也最強。結果表明，菌株YSD-P8是較強的溶磷內生真菌。

2.3.3解鉀能力菌株篩選由圖6可知，菌株YSD-P9和YSD-P10在解鉀培養基上能產生透明圈，表明其具有解鉀能力。通過比較透明圈的大小，初步判斷其解鉀效能，結果表明菌株YSD-P9解鉀能力（ r=25.0mm ） gt; 菌株YSD-P1O 解鉀能力 r=20.5mm ）。

2.3.4產鐵載體能力菌株篩選由圖7可知，菌株YSD-P4、YSD-P5、YSD-P8、YSD-P9 和YSD-P10在CAS培養基上產生了橙黃色圈，表明其具有產鐵載體功能。

2.3.5 固氮能力菌株篩選由圖8可知，菌株YSD-P4、YSD-P5、YSD-P8、YSD -P9、YSD-P10、YSD-C5、YSD-C6在無氮培養基上連續繼代培養3次均能生長，表明這7株內生真菌具有固氮功能，但其生長狀況較差，說明固氮能力較弱。

2.4油莎豆內生真菌代謝物的降糖活性和抗氧化性

2.4.1油莎豆內生真菌代謝物的降糖活性16 株油莎豆內生真菌發酵液乙酸乙酯提取物的 α- 葡萄糖昔酶抑制活性初篩結果（圖9）表明，它們均具有不同程度的 α- 葡萄糖苷酶抑制活性。菌株YSD-P3和YSD-P4的發酵液乙酸乙酯提取物對 α- 葡萄糖苷酶活性抑制率達到 80% 以上。進一步測定其半數抑制率（ IC₅₀ ），結果表明，菌株YSD-P3和YSD-P4半數抑制率分別為 862.4，745.8mg/L ，活性弱于陽性對照阿卡波糖（ IC₅₀=458.1mg/L 。

2.4.2油莎豆內生真菌代謝物的抗氧化性16株油莎豆內生真菌發酵液乙酸乙酯提取物的抗氧化活性初篩結果（圖10）表明，它們均具有不同程度的抗氧化活性。菌株 YSD-P3、YSD-P6、YSD-C1 YSD-C2對DPPH ? 的清除率超過 80% ，顯示了較強的抗氧化活性。進一步測定其半數清除率（ IC₅₀ ），結果表明，菌株 YSD-P3，YSD-P6，YSD- C1和YSD-C2的半數清除率分別為 737.8、770.7 、665.8，642.7mg/L ，活性弱于陽性對照維生素C1 IC₅₀=152.2mg/L? 。

3討論

本研究分離出16株油莎豆內生真菌，Oyedara等從油莎豆中分離得到釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）和熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）[16]本研究結果與之不同。這是因為研究的品種不同，存在較大的地域差距，且其殺菌條件強度較高，所以內生真菌的分離數量和種類會存在較大差異。

IAA是通過促進植物細胞的生長和分裂，以起到促進植物生長發育的植物激素。北柴胡色氨酸途徑產IAA的量最高為 76.16mg/L ，杜仲內生真菌產IAA的量最高為 38mg/L ，刺葉高山櫟內生真菌色氨酸途徑產IAA 的量最高為12.67 mg/L[26-28]本研究篩選的內生真菌色氨酸途徑產IAA的量最高達 39.10mg/L ，處于相對較高的水平。

溶磷菌株通過溶解土壤中的難溶性或不溶性磷，從而改善土壤中的磷營養，促進植物生長發育。彭靚等從米槁根部內生真菌中篩選出16株溶解無機磷菌株[9]，朱靜等從千年桐內生真菌中篩選出4株溶解無機磷菌株[29]，本研究篩選出6株能較好溶解有機磷的菌株和3株溶解無機磷的菌株。

解鉀菌株研究較多的為硅酸鹽細菌，通過將土壤中硅酸鹽類轉化為速效鉀后直接利用。本研究分離的解鉀內生真菌較少，且其能力較弱，可以通過誘變等技術手段獲得正向突變菌株，以得到具有較強解鉀能力的菌株。

鐵載體是可以螯合土壤中游離鐵的低分子量化合物，鐵元素對植物葉綠素的合成和有氧呼吸非常重要，對植物的生長發育起促進作用。劉娟娟等分離出10株具有產鐵載體的內生真菌24，劉軍等從檀香中分離得到4株可產鐵載體的內生真菌[30]，本研究從油莎豆中分離得到5株可產鐵載體的內生真菌，分離數量相對較多。

內生真菌的固氮作用可為宿主植物提供氮元素，促進植物對氮的吸收利用。本研究分離得到7株固氮能力較弱的油莎豆內生真菌，劉娟娟等從蘋果中分離出26株可在無氮培養基上正常生長的內生真菌[24]，表明植物內生真菌是固氮真菌研究開發的重要微生物資源。

阿卡波糖作為從微生物中獲得的降糖藥，對α- 葡萄糖苷酶的抑制效果非常好，能夠延緩餐后身體吸收血糖，對糖尿病具有很好的調節作用。肖澤恩等研究發現，木欖內生真菌的次級代謝產物中具有抑制 α- 葡萄糖苷酶的活性物質，進一步研究發現分離的11個化合物中，化合物1被首次發現具有抑制 α -葡萄糖苷酶的作用[13」；周培鳳等從臭常山內生真菌G-（JK）-2的發酵液中分離出13個化合物，其中，有2個化合物具有中等程度的 α- 葡萄糖苷酶抑制作用[31]。本研究從油莎豆中分離得到2株發酵液乙酸乙酯提取物具有較強 α- 葡萄糖昔酶抑制作用的內生真菌，有待進一步分離出單體化合物，明確其抑制機理

抗氧化是指抑制自由基產生或減少存在的過程，自由基具有強氧化性，對身體具有破壞作用，損害身體健康。抗氧化作用可降低自由基對身體的危害，從而達到預防炎癥和抗衰老的效果，可以通過食用具有清除自由基的抗氧化藥物調節機體中的自由基。本研究從油莎豆中分離得到4株發酵液乙酸乙酯提取物具有較強DPPH·清除率的內生真菌。程庭峰等從麻花芃的內生真菌中發現，其內生真菌Gs-6發酵液具有3種黃酮成分，進一步研究表明該菌株具有較強的抗氧化作用[32]；Monika等從天門冬根中分離得到35株內生真菌，進一步研究發現其發酵液中存在抗氧化活性，表明內生真菌的次級代謝產物是抗氧化藥物研究的重要方向[33]。

本研究首次從油莎豆篩選出具有促生活性的內生真菌，分析了發酵液粗提物的降糖活性和抗氧化活性，豐富了油莎豆內生真菌的研究。以上菌株可作為生物肥料開發的材料，有待進一步分離具有藥用活性菌株的次級代謝產物、多樣性研究及生物防治探索等，在農業生產發展中具有廣闊的前景。

4結論

從油莎豆中分離出16株內生真菌，鑒定為4屬5種。對促生能力篩選發現，3株具有不同程度的產IAA能力，6株具有溶解有機磷能力，3株具有溶解無機磷能力，2株具有解鉀能力，5株具有產鐵載體能力，4株具有固氮能力，其中3株具有4種促生能力，分別為菌株YSD-P5、YSD-P9、YSD-P10，表明內生促生真菌是研究微生物菌劑的微生物資源。活性研究結果表明，有2株內生真菌的 α- 葡萄糖苷酶抑制率大于 80% ，有4株內生真菌的DPPH·清除率大于 80% ，表明油莎豆內生真菌代謝產物具有抗氧化和降糖等豐富的生物活性，可進一步研究其他活性，并對活性跟蹤下的代謝產物分離，為尋找新穎的活性化合物提供理論基礎和科學依據。

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