粉葛莖腐病病原鑒定及其根際細菌群落分析

摘要

近年來粉葛莖腐病發生日趨增多，嚴重影響粉葛的產量及質量。本研究從粉葛莖腐病病樣中分離病原菌，根據其生理生化特征及分子生物學鑒定結果將其鑒定為

須芒草羅布斯氏菌Robbsia andropogonis，革蘭氏陰性。基于細菌16S rRNA，應用高通量測序技術，從健康粉葛和發病粉葛的根際土壤樣品共獲得613 254 條16S rRNA基因有效序列，1 374個OTU，分屬于27門、53綱、100目、144科、213屬、73種。發病粉葛和健康粉葛根際土壤之間細菌群落Alpha多樣性差異顯著，但Beta多樣性無顯著差異。與健康粉葛根際土壤（FgJK）相比，發病粉葛根際土壤（FgbJ）中藍細菌門Cyanobacteriota和放線菌門Actinomycetota細菌的相對豐度顯著降低，假單胞菌門Pseudomonadota細菌的相對豐度顯著提高;在屬水平上，副伯克霍爾德氏菌屬Paraburkholderia、泛菌屬Pantoea、假單胞菌屬Pseudomonas和根瘤菌屬Rhizobium細菌的相對豐度顯著提高;鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas細菌的相對豐度顯著降低。

關鍵詞

粉葛; 莖腐病; 病原鑒定; 高通量測序; 根際; 細菌群落

中圖分類號：

S 432.1

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024438

Identification of the stem rot pathogen and rhizosphere bacterial community analysis in Pueraria montana var. thomsonii

SHE Xiaoman1#*， LI Zhifang2#， MA Zijun1， LAN Guobing1， DING Shanwen1， HE Zifu1*

（1. Institute of Plant Protection， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Key Laboratory of Green Prevention

and Control on Fruits and Vegetables in South China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Guangdong

Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection， Guangzhou 510640， China;

2. Foshan Institute of Agricultural Sciences， Foshan 528143， China）

Abstract

Stem rot has become increasingly prevalent in Pueraria montana var. thomsonii， severely affecting its yield and quality. This study aimed to identify the causal pathogen and evaluate its effects on the rhizosphere bacterial community to support effective disease management strategies. The pathogen isolated from diseased stems was identified as the Gramnegative bacterium Robbsia andropogonis based on physiological， biochemical and molecular analyses. Using highthroughput 16S rRNA gene sequencing， a total of 613 254 highquality sequences and 1 374 OTUs were obtained from the rhizosphere soils of healthy and diseased plants， encompassing 27 phyla， 53 classes， 100 orders， 144 families， 213 genera and 73 species. Alpha diversity showed significant differences between the two groups， while Beta diversity did not. Compared to healthy rhizosphere soils （FgJK）， the diseased soils （FgbJ） exhibited significantly lower relative abundances of Cyanobacteriota and Actinomycetota， and a significantly higher abundance of Pseudomonadota. At the genus level， the relative abundances of Paraburkholderia， Pantoea， Pseudomonas， and Rhizobium were significantly higher in diseased soils， whereas Sphingomonas was significantly decreased.

Key words

Pueraria montana var." thomsonii; stem rot disease; pathogen identification; highthroughput sequencing; rhizosphere; bacterial community

粉葛Pueraria montana var. thomsonii （Benth.） Wiersema ex D. B. Ward屬豆科葛屬多年生藤本植物，其塊莖營養豐富且有解痙止痛、降低血壓等功效，是一種藥食兼用作物。近年來，粉葛莖腐病（又稱之為“黑心病”）發生日趨增多，尤其是在廣東佛山地理標志產品合水粉葛品種上，已嚴重影響粉葛的產量及質量。

粉葛上常見病害主要有葉斑病、炭疽病和銹病等。Cui等首次報道須芒草羅布斯氏菌Robbsia andropogonis引起粉葛細菌性斑點病［1］。2021年－2023年，本團隊田間調查結果顯示，粉葛莖腐病發生嚴重，主要為害粉葛的莖基部、塊根、莖部及葉片，嚴重時粉葛塊根黑褐色、腐爛，甚至引起粉葛塊根空心，田間發病率為25%～45%，粉葛植株死亡率15%～32%。作物根系與土壤接觸界面是微生物棲息的主要區域，被認為是地球上最活躍的界面之一［2］。根際土壤微生物群落結構是植物免受病原菌侵染的第一道防線［34］，植物如果感染病害，植物原本的根際微生物群落的生態平衡將被打破［5］，而研究健康植株和發病植株根際微生物群落組成差異，可為植物病害微生態調控提供指導。前人已有較多的報道，劉洪等［6］認為，病害脅迫對番茄根際微生物群落的多樣性、組成、結構和群落構建過程產生了顯著影響;楊學瑾等［7］的研究結果表明，根結線蟲危害黃瓜后顯著改變黃瓜根際土壤中細菌和真菌的群落結構;吳壽明等［8］認為根際土壤微生物群落結構的改變與病害發生的輕重相關，與健康的煙草相比，發生煙草黑脛病的煙草根際土壤細菌、真菌群落結構多樣性較低，且隨著發病程度增加，多樣性逐步下降。

引起粉葛莖腐病的病原未明，且該病對粉葛根際土壤微生物群落特征影響未見研究報道。本研究擬通過生理生化、分子生物學等方法，明確引起粉葛莖腐病的病原菌;通過高通量測序技術對健康和感病的粉葛植株根際土壤細菌的生物群落組成結構進行分析，旨在明確病原菌危害對粉葛根際微生物結構和豐度的影響，為改善粉葛根際土壤微生物群落以及研發粉葛莖腐病防控技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

植株病樣：粉葛莖腐病病樣采自廣東省佛山市高明區合水鎮的粉葛種植基地（112°29′E， 22°45′N），剪取含發病部位和健康部位10～15 cm的枝條帶回實驗室，4℃保存備用。

土壤樣品：在發病田塊，分別采集健康粉葛和發病粉葛的根際土壤。按五點取樣法，挖起粉葛植株塊根及根系，輕輕抖落附著土壤，然后用毛刷輕掃收集塊莖和根際周圍的土壤，5株粉葛塊莖和根際土樣混合為1個樣品。健康粉葛和發病粉葛各采集3個樣品。

供試菌株：對照菌株須芒草羅布斯氏菌Robbsia andropogonis DSM9884購自寧波明舟生物科技有限公司。

1.2 病原菌的分離培養

取粉葛枝條病樣的病健交界處0.5 cm的組織，在70%乙醇和1%次氯酸鈉溶液中各表面消毒45 s，用無菌水清洗5次，再用滅菌吸水紙吸干水分。消毒后的組織放在無菌的9 cm培養皿中，加入500 μL滅菌水，將組織搗碎，靜置5 min。用滅菌接種環蘸取懸浮液在營養瓊脂（NA）平板上劃線，28℃黑暗培養24 h。挑取單菌落劃線純化2次，選取單菌落，保存于-80℃冰箱備用。

1.3 病原菌致病性測定

取分離并保存的代表菌株GMfg20，在NA平板上劃線，28℃培養72 h;挑取單菌落接種到NA液體培養基中，180 r/min振蕩培養48 h，5 000 r/min離心10 min收集菌體，用滅菌水配成3×108 cfu/mL的細菌懸浮液。采用浸根法和噴霧法接種。浸根法：將粉葛組培苗移栽至直徑為10 cm的營養缽中，移植4周后，拔出粉葛植株將根洗凈后將根部浸入細菌懸浮接種液中浸泡30 min。接種后植株置于溫室中觀察植株病情發展，溫度為25～30℃。噴霧法：將粉葛植株保濕3 d，濕度在95%以上，隨后用噴壺將細菌懸浮液均勻噴施在粉葛葉片上，每株粉葛接種10 mL。接種后置于溫室中（溫度為25～30℃，保濕5 d，濕度95%以上）

觀察植株病情發展。植株發病后，再隨機采集3株發病枝條分離病原，與接種菌株進行比較。

1.4 多基因序列分析

用細菌基因組提取試劑盒提取純化病原菌DNA。利用引物對fD1（5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′）/rD1（5′AAGGAGGTGATCCAGC

CGCA3′）、LJ23f（5′GGGGGTGTCTTGCGTAAAC3′）/LJ24r（5′ACACCAGCTTGTCCTTCGTCT3′）、lepAF（5′TGGTTCGACAACTACGTCGG3′）/LepAR（5′ATCAGCATGTCGACCTTCAC3′）分別進行PCR擴增獲得16S rDNA、gyrB和lepA基因的部分序列［911］。PCR擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將獲得的序列提交到GenBank數據庫，應用MEGA11 軟件［12］對獲得的 16S rDNA、gyrB和lepA基因序列及從GenBank數據庫下載的相關菌株序列采用鄰接法（neighborjoining）構建系統發育樹（bootstrap值設置為1 000，其余參數默認），確定病原菌的種類。

1.5 病原菌生理生化鑒定

參照《植物病原細菌鑒定試驗指導》（第3版）［13］進行病原菌的氧化酶、明膠液化、硝酸鹽還原、精氨酸雙水解酶等試驗以及碳水化合物利用情況。試驗重復3次。

1.6 粉葛根際土壤微生物高通量測序

使用Hipure Soil DNA試劑盒（廣州美基生物科技有限公司）提取純化粉葛根際土壤微生物總DNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。使用16S rDNA V3/V4區引物341F（5′CCTAYGGGRBGCASCAG3′）/806R（5′GGACTACNNGGGTATC

TAAT3′）［14］進行PCR擴增，鑒定細菌多樣性。PCR 反應條件為：95℃ 3 min;95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，28 個循環;72℃ 延伸10 min。PCR產物經檢測、純化、酶標定量后，使用NEB NextUltraTM Ⅱ FS DNA PCRfree Library Prep Kit （New England Biolabs）進行文庫構建，使用NovaSeq 6000進行PE 250測序。

1.7 序列處理與統計分析

使用FLASH （Version 1.2. 11， http：∥ccb.jhu.edu/software/FLASH/），對每個樣本的reads進行拼接，得到原始數據。使用fastp軟件（Version 0.23.1）對原始數據進行過濾處理得到高質量的Tags數據［15］。使用QIIME2 （Version QIIME2202202） 軟件中的DaDa2模塊進行降噪，默認以測序所有序列數的0.005%作為閾值過濾獲得最終的擴增子序列變體（amplicon sequence variants，ASVs）以及特征表［16］。基于UCHIME 算法，識別并去除嵌合體序列。去除嵌合體后，輸出去噪、無嵌合體的ASV序列及其豐度。將ASVs序列與物種注釋數據庫 （https：∥www.arbsilva.de/for 16S）進行比對［17］，使用RDP注釋軟件（Version2.2）的樸素貝葉斯模型進行物種分類注釋，置信閾值設置為0.8～1。使用Krona（版本2.6）統計每個物種分類的豐度，使用R語言ggplot2包（版本2.2.1）繪制物種豐度疊圖。使用QIIME2 軟件進行Alpha多樣性指數分析，組間Alpha指數比較使用R語言Vegan包（版本2.5.3）進行Welch’s t檢驗。Beta多樣性分析使用R語言Vegan包（版本2.5.3）計算BrayCurtis距離結合主坐標分析

（principal coordinates analysis，PCoA）進行評估，并使用R語言ggplot2包（版本2.2.1）繪圖。

2 結果與分析

2.1 粉葛莖腐病田間癥狀

莖腐病在粉葛苗期發生為害，發病初期，粉葛的莖基部表皮變褐、有裂紋，莖節溢縮（圖1a），隨著病情的發展，發病部位向莖部上下擴展，莖基部為黑色壞死狀，葉片焦枯，直至植株死亡（圖1b，c）;粉葛葉片莖稈和葉脈呈褐色，葉脈周圍呈黃色（圖1d），葉背葉脈處伴有放射性水漬狀（圖1e），空氣濕度大時葉片背面和正面有粉色至紅色的菌濃溢出（圖1e～g）。

2.2 病原菌菌落形態

共分離獲得5株形態一致的分離物（CMfg16～CMfg20），在28℃培養箱培養72 h后，分離物在NA平板上呈不規則圓形、具有流動性、中間隆起的白色的菌落，革蘭氏染色陰性（圖2）。選用GMfg20進行后續試驗。

2.3 病原菌致病性

菌株GMfg20室內回接粉葛結果顯示，浸根接種30 d后，粉葛莖基部變褐、裂紋，葉片葉脈呈褐色狀，葉脈周圍呈黃色（圖3a），隨著時間的推移（接種60 d后），莖部壞死沿著莖部向上發展，發病葉片焦枯凋落，與田間粉葛病株癥狀相似。噴霧接種11 d后，粉葛葉片葉脈變褐，葉脈周圍呈黃色，葉背葉脈處伴有水漬狀（圖3b），與田間粉葛病株癥狀相似。

從發病的葉片及莖部病健交界處均可分離到與接種用病原菌相同的菌株。表明，分離獲得的細菌為粉葛莖腐病的病原菌。

2.4 病原菌鑒定結果

生理生化測定結果表明，5株菌株均不能水解明膠，硝酸鹽還原、氧化酶反應和精氨酸雙水解酶試驗為陰性，能利用山梨醇、檸檬酸鹽、半乳糖、醋酸、果糖、甘露醇、甘露糖等碳水化合物，不能利用麥芽糖、纖維二糖、水楊酸、蔗糖、阿拉伯糖、乳糖、赤蘚糖醇、琥珀酸、丙二酸鹽和甜菜堿。5株菌株的生理生化特征與對照菌株Robbsia andropogonis DSM9884的生理生化特征結果基本一致（表1）。

PCR產物測序結果顯示，5株病原菌的16S rDNA近全長序列均為1 410 bp（GenBank登錄號：OR717460～OR717464），gyrB基因部分序列長為599 bp（GenBank登錄號：PP963974～PP963978），lepA基因部分序列長為733 bp（GenBank登錄號：PP963979～PP963983），相同基因序列間一致性均為100%。利用MEGA11軟件，構建了5株菌株與10株Robbsia spp.菌株的多位點序列進化樹（圖4），供試菌株與已發表的R.andropogonis菌株聚集形成一個類群，且與R.andropogonis FG9菌株一致性最高，形成一個小分支。

2.5 根際土壤樣本測序統計結果

Illumina MiSeq 測序數據經剔除低質量序列后，得到613 254 條高質量細菌16S rRNA 基因序列，通過序列比對和OTU劃分，得到1 374個細菌OTU。1 374個細菌OTU分別注釋到27門、53綱、100目、144科、213屬、73種細菌。

2.6 根際土壤細菌群落多樣性分析

由表2結果可知，健康粉葛根際土壤（FgJK）和發病粉葛根際土壤（FgbJ）細菌的覆蓋率均為1.00 （gt;0.97），表明測序結果可代表樣本中細菌的真實情況。Alpha多樣性分析結果顯示，發病粉葛根際土壤（FgbJ）細菌的Chao1指數、Pieloue指數、Shannon指數和Simpson指數均顯著高于健康粉葛根際土壤（FgJK）（表2），表明發病粉葛根際土壤（FgbJ）中細菌的群落豐富度及物種多樣性高于健康粉葛根際土壤（FgJK）細菌的群落豐度及物種多樣性。

采用基于BrayCurtis距離矩陣的主坐標分析（PCoA）方法，分析健康和發病粉葛根際土壤細菌群落結構結果表明，2個主坐標解釋了56.93%的細菌群落變異，健康粉葛根際土壤（FgJK）和發病粉葛根際土壤（FgbJ）的距離較遠（圖5）。這些結果說明，健康粉葛根際土壤和發病粉葛根際土壤間的細菌結構有差異。

2.7 莖腐病原對粉葛根際土壤細菌群落的影響

粉葛根際土壤細菌群落比較分析結果顯示，在門、屬和種水平上，健康粉葛根際土壤（FgJK）和發病粉葛根際土壤（FgbJ）的細菌均存在差異，說明粉葛莖腐病病原菌影響粉葛根際細菌群落的組成和結構。

在門水平上，FgJK和FgbJ的優勢細菌門分類排名前五的為藍細菌門Cyanobacteriota、假單胞菌門Pseudomonadota、放線菌門Actinomycetota、擬桿菌門Bacteroidota和浮霉狀菌門Planctomycetota（圖6）。與FgJK相比，FgbJ藍細菌門的相對豐度值由61.63%降至37.55%，假單胞菌門的相對豐度值由34.3%顯著的提高至58.29%，放線菌門的相對豐度值由2.23%降至0.86%，擬桿菌門的相對豐度值由0.36%顯著提高至1.77%，浮霉菌門的相對豐度值由0.45%顯著提高至1.1%。

在屬水平上，FgJK和FgbJ的優勢細菌屬分類排名前五的為副伯克霍爾德氏菌屬Paraburkholderia、泛菌屬Pantoea、假單胞菌屬Pseudomonas、根瘤菌屬Rhizobium和鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas（圖7）。與FgJK相比，FgbJ的Paraburkholderia的相對豐度值由0.28%顯著提高至6.23%，泛菌屬的相對豐度值由0.11%顯著提高至3.42%，假單胞菌屬的相對豐度值由0.15%顯著提高至3.26%，根瘤菌屬的相對豐度值由0.23%顯著提高至2.60%，而鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度值由1.59%顯著降低至0.72%。

3 結論和討論

本文對粉葛莖腐病的病原菌進行了鑒定。從粉葛病樣中分離到疑似病原的細菌，科赫氏法則驗證了該細菌即為粉葛莖腐病的病原菌。通過對病原菌菌落形態特征、生理生化特征和多基因序比較分析，明確了引起粉葛莖腐病的病原菌為Robbsia andropogonis。

本研究分離獲得的R.andropogonis菌株除了不能利用丙二酸鹽、乳糖和琥珀酸之外，其余的生理生化特征與模式菌株R.andropogonis DSM9884的生理生化特征一致［18］，推測可能是R.andropogonis不同來源菌株間存在差異所致。

16S rDNA序列分析是常用的細菌分類鑒定方法，但由于16S rRNA分子較小、包含的信息量少，單獨利用16S rRNA基因對病原菌進行系統進化分析存在局限性［19］，本研究通過16S rRNA基因進化分析，只能將分離的菌株鑒定為Rubbsia sp.。管家基因含有豐富的遺傳信息，利用管家基因序列分析可更好地解決菌株的起源問題［20］。本研究進一步測定分離菌株的管家基因gyrB和 lepA序列，通過多基因序列進化分析發現，5株分離的菌株與R.andropogonis菌株聚類在同一分支，據此將粉葛莖腐病的病原菌鑒定為Robbsia andropogonis。

Robbsia andropogonis屬于β變形菌綱βproteobacteria伯克霍爾德氏菌目Burkholderiales伯克霍爾德氏菌科Burkholderiaceae的羅布斯氏菌屬Robbsia。Robbsia為2017年新建立的屬［18］，該屬僅包含樺樹花粉羅布斯氏菌R.betulipollinis和R.andropogonis。R.betulipollinis是從樺樹花粉中分離的新種［21］。R.andropogonis最早被Smith命名為Bacterium andropogoni［22］，隨后該菌分類地位發生幾次變遷，先后被歸入假單胞菌屬Pseudomonas［23］、伯克霍爾德氏菌屬Burkholderia［24］以及副伯克霍爾德氏菌屬Paraburkholderia屬［25］，2017年LopesSants等建議成立新屬，將Paraburkholderia andropogonis歸入Robbsia屬［18］。R.andropogonis 主要侵染葉片引起細菌性葉斑病或者細菌性條紋病，其寄主范圍廣，至少可侵染15個科52種植物，包括玉米［26］、高粱［22］、柑橘［10］、咖啡［27］、檳榔［28］等經濟作物，以及三角梅［20］、鶴望蘭［29］等觀賞植物。Cui等2022年報道R.andropogonis侵染粉葛引起細菌性葉斑病［1］，本研究通過噴霧接種的方法，分離的菌株能引起粉葛細菌性葉斑病，不引起莖腐癥狀，癥狀與Cui等報道的一致。利用浸根接種法分離的菌株能引起粉葛莖腐病，同時發病植株的葉片還出現葉斑癥狀，與田間癥狀一致。本研究首次證明了R.andropogonis除了侵染植物葉片引起細菌性葉斑病，還能侵染根部引起莖腐病及系統性病害。

作為粉葛與土壤交流的中介，土壤根際微生態是對粉葛根部病害優先做出響應的區域，有必要深入了解粉葛莖腐病粉葛根際土壤微生態。有關病原菌侵染對細菌群落的影響，前人已有較多研究，普遍認為病原菌侵染會導致細菌群落的多樣性下降［3031］。本研究通過比較健康粉葛和發病粉葛的根際土壤發現，發病植株根際的Chao1、Shannon、Simpson和Pieloue指數均顯著高于健康植株土壤，與陳海生等認為甘薯莖基部腐爛病提高了根際土壤細菌多樣性指數的研究結果一致［32］，推測可能是病原菌侵染后大量繁殖破壞了根際土壤中原有微生物細菌群落的平衡。

本研究中，在屬水平上，發病粉葛土壤樣品細菌中Paraburkholderia屬相對豐度顯著高于健康粉葛土壤樣品，而粉葛莖腐病是由R.andropogonis引起的細菌性病害，提示了該區域土壤細菌群落中存在粉葛莖腐病病原菌，這是粉葛莖腐病發生的傳染源之一。指示物種在一定區域范圍內能指示生長環境或某些環境條件的物種或群落，本研究發現發病粉葛土壤樣品細菌中泛菌屬相對豐度顯著高于健康粉葛土壤樣品，推測其原因可能是粉葛塊根富含膳食纖維［33］，而泛菌屬某些菌株具有產纖維素酶能力［3435］。本研究中從粉葛根際土壤中分離獲得成團泛菌和分散泛菌兩種泛菌屬細菌，其纖維素酶產生試驗為陽性（試驗結果未展示），推測由R.andropogonis先侵染粉葛破壞其結構平衡后，粉葛中含有的膳食纖維吸引成團泛菌和分散泛菌在粉葛根際聚集，從而改變粉葛根際土壤中細菌群落。

本研究將粉葛莖腐病病原菌鑒定為R.andropogonis，并驗證了該菌既能侵染植物葉片引起細菌性葉斑病，又能從根部侵染引起莖腐病，說明該病菌可引起粉葛系統性病害;同時探究了R.andropogonis侵染粉葛后改變了根際細菌群落結構特征，提高了根際細菌群落多樣性，研究結果為研發粉葛莖腐病微生態調控技術和復合菌劑提供理論依據。

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（責任編輯：楊明麗）