西南地區主栽雜交稻對‘宜香優2115’致病性稻瘟菌的抗性

摘要

由Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病是威脅西南乃至全國水稻生產最重要的病害之一，選育和利用抗性品種是控制稻瘟病最經濟有效且對環境友好的措施，但抗性品種因病菌群體毒性發生變化而喪失抗性，已成為抗性品種選育和利用中的瓶頸問題。為篩選西南地區當前大面積推廣品種‘宜香優2115’感染稻瘟病后的接班品種，本研究于2022年-2023年利用其致病菌在病圃對24個抗病基因供體和西南地區100個雜交稻品種進行了抗性篩選。結果表明在兩年間24個抗瘟單基因系均不能穩定表現抗性，57個雜交稻品種和含有Pigm基因的‘谷梅4號’穩定表現抗病。對42個抗性表現不一的雜交稻所含抗性基因進行了檢測，結果表明，抗性基因的數目越多，品種抗性程度和穩定性越好，含有Pigm或Pi9的基因組合的雜交稻能夠穩定抗病，含有Pikh/Pita/Pib的‘華浙優261’‘國泰香優2號’和‘成優4001’也穩定表現抗病。

關鍵詞

水稻; 西南地區; 抗稻瘟病基因; 分子標記

中圖分類號：

S 435.111.41

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024514

Resistance of major hybrid rice cultivars in Southwest China to the rice blast pathogen isolated from‘Yixiangyou 2115’

CAO Yue1，2， WU Hanlin1， HUANG Yanyan3， ZHANG Mei4， PENG Yunliang1，5，JI Hongli1， LEI Shufan2*， CAO Buwei1*

（1. Key Laboratory of Integrated Management of Pests on Crops in Southwest China， Ministry of Agriculture and

Rural Affairs， Institute of Plant Protection， Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu 610066， China;

2. Chongqing Three Gorges College， Chongqing Three Gorges Academy of Agricultural Sciences， Chongqing 404020，

China; 3. State Key Laboratory of Crop Gene Exploration and Utilization in Southwest China， Sichuan Agricultural

University， Chengdu 611130， China; 4. Plant Protection Station， Sichuan Provincial Department of Agriculture and

Rural Affairs， Chengdu 610041， China; 5. China National Rice Research Institute， Hangzhou 311401， China）

Abstract

Rice blast， caused by Magnaporthe oryzae， is one of the most destructive diseases threatening rice production in both Southwest China and the entire country. Breeding and deploying resistant cultivars are the most costeffective and environmentally friendly strategies for controlling rice blast. However， the loss of resistance due to evolving virulence in pathogen populations has become a major bottleneck in resistance breeding and utilization. To identify suitable replacement cultivars for ‘Yixiangyou 2115’， which has recently become susceptible to blast disease in the field， 100 hybrid rice cultivars from Southwest China， the resistant variety ‘Gumei 4’ carrying Pigm and 24 IRBLs containing single blast resistance genes were evaluated in disease nurseries during 2022-2023 using a pathogen strain isolated from ‘Yixiangyou 2115’. The results showed that 57 hybrid rice cultivars and ‘Gumei 4’ consistently exhibited resistance over two years， whereas none of the 24 IRBLs showed stable resistance. PCR analysis of 42 cultivars with varying resistance levels revealed that cultivars with multiple resistance genes generally demonstrated stronger and more stable resistance. Hybrids carrying gene combinations such as Pigm or Pi9 maintained consistent resistance， while cultivars carrying Pikh/Pita/Pib combination， such as ‘Huazheyou 261’ ‘Guotaixiangyou 2’ and ‘Chengyou 4001’， also exhibited stable resistance.

Key words

rice; Southwest China; rice blast resistance gene; molecular marker

水稻是我國和世界最重要的糧食作物，全球有近一半人口食用水稻。由Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病在世界范圍內廣泛發生，一般流行程度造成年產量損失10%～30%，嚴重時甚至會導致絕收。據統計，稻瘟病每年在南亞和東南亞造成的經濟損失高達6 000萬美元［12］。2012年-2021年，我國每年受稻瘟病危害的水稻面積約為381.5萬hm2，每年水稻產量損失約為36.8萬t［3］。選育和利用抗性品種，是控制稻瘟病最經濟、有效和對環境友好的手段。但由于病菌毒性變異頻繁，新毒性類型在群體中出現和頻率上升導致新品種大面積推廣3～5年后在田間喪失抗性，已成為稻瘟病防控中的瓶頸問題。在四川，自雜交稻推廣以來分別在1984年-1985年、1993年-1994年、2003年-2005年出現3次稻瘟病流行高峰，高峰期最大發生面積分別超過72.9萬、49.2萬hm2和35.5萬hm2，年損失糧食5萬t以上［45］。在2006年以后，盡管稻瘟病菌毒性仍然在發生變化［56］，四川省卻再未發生新的大流行，‘宜香優2115’‘川優6023’等主栽品種使用壽命均在10年以上。作為西南地區當年推廣面積最大的雜交稻品種，‘宜香優2115’在推廣之初曾在貴州興義市嚴重感病，2021年又在四川省崇州市開始出現連片發病，為了解該品種發病后西南地區水稻主栽品種的抗性表現，本研究利用對‘宜香優2115’具有效病性的稻瘟病菌，在病圃內對西南地區市售水稻品種進行了抗性篩選，并對代表性品種所含的抗性基因進行了檢測和分析，以期為病害流行預測和新抗性品種選育提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

24份稻瘟病抗性單基因系水稻材料及感病品種‘麗江新團黑谷’（‘LTH’）由廣東省農業科學院朱小源研究員提供，在四川省農業科學院植物保護研究所保存并繁殖;100份雜交水稻主栽品種均為市售樣品，于2022年春季收集自四川省成都、南充、綿陽以及貴州省興義等地種子市場并于4℃冷庫保存，‘谷梅4號’由四川省農業科學院植物保護研究所選育并保存繁殖。‘成優4001’和‘川優6203’F2代種子為2023年采集自病圃中表現為抗病的1個單株分穗保存。

1.2 病圃設置與田間管理

稻瘟病圃設立于稻瘟病常發區的四川省邛崍市老林口（103°08′E，30°13′N），海拔635 m，平均年降水量約1 400 mm，年平均相對濕度86.8%。每年4月上旬整地，整地前每667 m2施15 kg復合肥（NP2O5K2O 151515）、5 kg尿素做底肥，翻耕后起1.5 m寬秧廂，廂間留0.5 m寬廂溝。播種前將秧廂縱分為兩幅，中間間隔10 cm。將各品種直接或催芽后播種50～100粒于事先劃好的直線上，行長50 cm，間距25 cm，距秧廂邊緣20 cm。試驗設置3個重復。秧廂兩端以及每隔10份參試材料播一行誘發行，誘發行為‘宜香優2115’和‘LTH’按9∶1比例混合種子。播種后將種子抹壓入泥漿，架拱覆蓋薄膜，薄膜中央每2 m劃20 cm長透氣孔以防高溫燒苗，出苗前秧廂保持廂面濕潤但無積水，出苗3～4 d后撤去薄膜灌淺水，二葉一心期每667 m2撒施5 kg尿素，并將溫室內發病秧苗移栽至誘發行內。溫室誘發苗播種同誘發行，播種期較田間早30 d，2022年接種菌源為2021年貴州興義市、四川崇州市‘宜香優2115’自然發病田采集的穗頸瘟標本各200根，為保證病圃病菌群體致病性的連續性，還混入了2021年邛崍病圃隨機采集的穗頸瘟標本400根，2023年接種菌源為2022年邛崍病圃中隨機收集的穗頸瘟標本400根。穗頸瘟標本干燥保存后在溫室秧苗三葉期按吳晗霖等［6］的方法進行產孢、接種于溫室內誘發苗，待誘發苗均勻發病后將帶病斑的病苗移栽至田間誘發行內，各誘發行移栽2～3株苗。病圃第2、3次追肥分別在分蘗盛期和劍葉抽出后進行，每667 m2施7.5 kg尿素。按常規管理進行除草和蟲害防治，整個生育期不施用任何殺菌劑。

1.3 病害調查

參照中華人民共和國農業行業標準NY/T 26462014《水稻品種試驗稻瘟病抗性鑒定與評價技術規程》［7］中0～9級水稻葉瘟調查分級和穗頸瘟鑒定標準，于分蘗末期對田間試驗材料進行葉瘟抗性鑒定：抗性類型0級為高抗（HR）、1～2級為抗（R）、3級為中抗（MR）、4～5級為中感（MS）、6～7級為感（S）、8～9級為高感（HS）;黃熟初期調查穗瘟發病情況，穗頸瘟病穗率≤10%為抗性（R）。

1.4 水稻抗稻瘟病基因分子檢測

將2022年-2023年24個連續表現抗病、6個連續表現感病及12個抗性表現不穩定的品種的葉片樣品磨碎后采用CTAB法提取DNA［8］，并將濃度調整為約100 ng/μL，保存于-20℃。利用抗瘟基因Pita、Pi9、Pi2、Pizt、Pigm、Pib、Pik、Pikm、Pikp、Pikps、Pikh和Pil的特異性引物（表1）進行PCR擴增。PCR反應體系為：2×Rapid Taq Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）10 μL，水稻基因組DNA 2 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各1 μL，6 μL ddH2O。PCR反應程序：95℃預變性5 min;95℃變性15 s，退火溫度見表1，72℃延伸15～30 s（由擴增產物的長度決定），30個循環;72℃ 延伸10 min。所有擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并測序比對序列。引物合成、序列測定均由北京擎科生物科技股份有限公司完成。‘谷梅4號’為Pigm陽性對照，其他抗瘟基因陽性對照為相應的IRBL單基因系，陰性對照為‘LTH’。

1.5 雜交稻F2代單株抗性評價和抗性基因檢測

2024年春，將雜交稻‘成優4001’和‘川優6203’單株采集的F1代種子按單穗在邛崍病圃進行播種，每個品種分別播種3穗，對照為‘宜香優2115’。出苗后于三葉一心期參考吳晗霖等［6］的方法接種上年病圃隨機采集的穗頸瘟標本，并在2個雜交組合的F2群體中隨機挑選30株編號;待‘宜香優2115’單株發病率達到100%后，調查各群體編號的30株F2的葉瘟級別，采集葉片檢測其F2代所含的抗性基因。病圃管理、病害調查和基因檢測方法同上。

2 結果與分析

2.1 水稻抗瘟單基因系在病圃中的葉瘟級別

2022年和2023年24個單基因系、‘谷梅4號’及感病對照‘LTH’在邛崍病圃中的葉瘟級別如表2所示。2022、2023年試驗中分別有36、35行誘發行，其中‘LTH’在葉瘟調查時均已死苗，兩年間各誘發行中‘宜香優2115’的葉瘟級別均在7和9之間，表明田間發病充分。2年中‘LTH’葉瘟級別均為9級，24個抗瘟單基因系中除含Pi9的‘IRBL9W’在2022年葉瘟為5級、2023年為0級外，其余23個抗瘟單基因系連續兩年葉瘟最高級別均在4級以上，表現感病，‘谷梅4號’連續兩年葉瘟均為0級，表現抗病。

2.2 水稻主栽品種抗瘟性表現

將西南地區各地種子市場收集的100個生產品種，于2022年-2023年在邛崍病圃進行種植并調查其最高葉瘟級別和平均穗頸瘟率（表3），發現‘川優6023’等57個品種連續2年最高葉瘟級別均在3級以下，平均穗頸瘟率均≤10.0%而穩定表現抗病，占參試品種的57%;‘宜香優2115’等12個品種連續2年或最高葉瘟在4級以上或平均穗頸瘟率超過10%而穩定表現感病，占參試品種12%;‘內香8156’等31個品種在2年間抗性表現不穩定，占參試品種的31%。

2.3 水稻主栽品種抗稻瘟病基因檢測

將2022年-2023年間24個連續表現抗病、6個連續表現感病及12個抗性表現不穩定的品種采集劍葉進行抗瘟基因檢測，各品種中均未檢出Pikp和Pik基因，其余Pi2、Pik、Pita和Pib 4個位點10個等位基因的檢測結果見表4。在所有參試品種中，除感病對照品種‘LTH’外，均至少檢測出1個已知抗性基因，Pita和Pib在供試品種中的分布頻率分別高達76.19%和69.05%，而Pi2、Pizt、Pigm、Pikm、Pikps、Pi1、Pikh和Pi9的檢出頻率依次為23.81%、16.67%、11.90%、9.52%、9.52%、9.52%、7.14%和4.76%。

在42個品種中，含有Pigm基因的5個品種（‘千鄉優604’‘龍香優123’‘千鄉優956’‘川優542’和‘中9優591’）、含Pi9的基因組合（Pi9/Pita/Pib和Pi9/Pi1）的2個品種（‘宜香107’和‘揚優香占’）和含有Pikh/Pita/Pib的3個品種（‘華浙優261’‘國泰香優2號’和‘成優4001’）于2022年-2023年葉瘟和穗頸瘟連續表現抗病;僅含有Pib的3個品種（‘宜香4245’‘宜香2084’和‘渝香813A/R4553’）以及感病對照‘LTH’均連續表現感病。其余在一個以上品種中重復出現的抗瘟基因組合，包括Pikm/Pita/Pib（‘川優6203’和‘宜香優45’）、

Pi2/Pita/Pib（‘徽兩優280’‘晶兩優1212’‘晶兩優絲苗’‘品香優五山絲苗’‘宜香優4118’‘華航新選10’和‘花香7號’）、Pita/Pib（‘宜香2239’‘又香優龍絲苗’‘雅7優2117’‘宜香707’‘廣8優165’‘更香優703’和‘昌兩優絲苗’）、Pikps（‘旌優348’和‘桃湘優莉晶’）、Pita（‘兩優2186’‘清兩優183’和‘悅香優銀占’）的抗性表現則不一致。在僅出現一個代表品種的抗瘟基因組合中，2年間穩定表現抗病的有Pi2/Pikps/Pib（‘旌1優華珍’）、Pikps/Pita/Pib（‘泰優2608’）和Pi2/Pita（‘深兩優332’）;2年間穩定表現感病的有Pizt/Pikm（‘川作優8178’）、Pizt/Pib（‘文富7號’）和Pi2/Pib（‘宜優1787’），2年間抗性不穩定的抗瘟基因組合有Pi1/Pita（‘內香8156’）、Pikm/Pita（‘品香優9205’）。

從參試的42個西南地區水稻品種中可以看出，隨著所攜帶的抗性基因數量增加，穩定表現抗性的品種比例也有所上升（表5）。檢測出1個抗病基因的水稻品種有8個，其中穩定表現抗病的品種僅占25.00%，攜帶2、3、4個抗病基因的品種分別有14、16個和4個，在2年間穩定表現抗病的比例分別為50.00%、68.75%和100%。

2.4 雜交組合F2代單株抗性表現和抗性基因檢測

將雜交稻‘成優4001’和‘川優6203’進行收種，收獲的雜交稻F1代種子于2024年播種在邛崍病圃，各雜交組合均隨機選擇30個F2單株進行了葉瘟鑒定和抗性基因檢測，發現在‘成優4001’（F1）的3個單穗的30個F2單株中，有4株攜帶與F1相同的基因（Pita/Pib/Pikh），其田間葉瘟抗性表現全部為抗，與F1代田間抗性表現一致（表6），但不同時含有Pita/Pib/Pikh 3個基因的F2單株也有部分表現抗病。在來自‘川優6203’（F1）的3個單穗的30個F2單株中，有16株攜帶與F1相同的基因（Pikm/Pita/Pib），田間葉瘟抗性表現全部為高抗或者抗，也與其F1代田間葉瘟抗性表現一致（表7），但不同時含有Pikm/Pita/Pib 3個基因的F2單株也有部分表現抗病。

3 結論與討論

選育和利用抗性品種，是控制稻瘟病最經濟、有效且對環境友好的手段。但由于稻瘟病菌群體結構組成復雜且易變，在新的抗病品種投入使用后，病菌群體中產生對其具有致病能力的新毒性類型；在品種選擇壓力下，這類新毒性類型的頻率會逐漸上升并超過臨界閾值，往往導致抗性品種在大面積推廣3～5年后即喪失抗性［14］，這已成為抗稻瘟病品種利用中的瓶頸問題。‘宜香優2115’自2013年起在四川等西南地區大面積推廣，是目前西南地區種植面積最大的雜交稻品種。該品種在貴州省興義市、四川省崇州市分別出現了連續10年和3年多田塊連片發病的現象。本研究在四川邛崍病圃中加入興義、崇州市‘宜香優2115’發病田的病穗頸作為菌源，從100個西南地區水稻主栽品種中篩選出57個對葉瘟、穗頸瘟連續2年均表現抗性的雜交稻品種，并且在24個抗性穩定品種中共檢出12種抗性基因組合。這說明即使‘宜香優2115’ 在西南地區大面積喪失抗性，但接班品種較多且基因型多樣，稻瘟病持續大面積流行的風險較小。

另一方面，本研究參試的24個單基因系在邛崍病圃均不能穩定表現抗病，已知廣譜抗稻瘟病基因僅Pigm（供體為‘谷梅4號’）連續穩定表現抗病，而筆者已在福建、浙江等地病圃和大田獲得能使‘谷梅4號’表現感病的稻瘟病菌株（未發表資料），可見抗稻瘟病育種開始面臨無新廣譜抗病基因可用的局面。抗性基因聚合被認為是培育持久抗病品種的有效途徑之一［1519］。在本研究中，盡管還有其他未檢測的抗瘟基因可能發揮作用，但含有Pikh/Pita/Pib的‘華浙優261’‘國泰香優2號’‘成優4001’以及‘成優4001’的4個F２單株均表現抗病，表明即使單個基因喪失抗性，特定的基因聚合在抗稻瘟病育種中仍有利用價值。而本研究中攜帶另外一個多基因聚合組合“Pikm/Pita/Pib”的雜交稻品種抗性不穩定，除了可能因表現穩定抗性的品種中含有其他未檢測抗瘟基因起作用外，也可能與‘川優6203’連續大面積推廣造成的選擇壓力有關。通過研究雜交稻F1、F2代以及單基因系復合雜交后不同抗性基因聚合組合的抗性穩定性，將有助于推進抗稻瘟病基因聚合育種。

目前尚無Pigm在四川及西南地區喪失抗性的報道，本研究中凡帶有Pigm的雜交稻組合均穩定表現抗病，如果在育種過程中將Pigm與其他穩定抗病的基因或基因組合加以聚合培育更廣譜抗病的品種，同時配合大面積種植抗性品種、田園清潔、種子處理等壓低乃至鏟除稻瘟病菌菌源的措施，將有利于西南地區稻瘟病的持續控制。

參考文獻

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［2］ ROYCHOWDHURY M， JIA Yulin， CARTWRIGHT R D. Structure， function， and coevolution of rice blast resistance genes ［J］. 作物學報， 2012， 38（3）： 381393.