ANKRD22在胰腺癌中的表達及對腫瘤的影響

【中圖分類號】R576；R735.9 【文獻標識碼】A

Expression of ANKRD22 and its effects on pancreatic cancer

SUN Zhijia， SONG Zhuo， LIU Xu， LI Xinji， WANG Yingjie DepartmentofTumorRadiotherapy，PLAAirForceMedicalCenter，Beijing10o142，China Corresponding author： WANG Yingjie， Email： wangyj9999@163.com

【Abstract】 Objective To explore the expression of ankyrin repeat domain 22 （ANKRD22） in pancreatic cancer （PC），to analyze its clinical prognosis， and investigate its impact on PC cell phenotypes. Methods The expresson levels of ANKRD22 and their impact on PC prognosis were analyzed using R and Perl languages in the TCGA-PC and GEO databases.ANKRD22-interfered PANC-1 and AsPC-1 celline models were constructed using siRNA. Cell proliferation and invasion capabilities were assessed using CCK-8 assays，colony formation，and Transwell experiments. The regulatory effect of ANKRD22 knockdown on cell apoptosis was evaluated by flow cytometry. Results Compared to normal pancreatic tissues，ANKRD22 expression was significantly elevated in PC tissues.Patients with high ANKRD22 expression had a significantly lower overall survival than those with low expresson， correlating with poor prognosis. Knockdown of ANKRD22 significantly attenuated the proliferation and invasion capabilities of PC cells but did not affect cell apoptosis. Conclusion ANKRD22 is highly expressed in PC and promotes the proliferation and invasion of PC cells. ANKRD22 may serve as a crucial therapeutic target for PC.

【Keywords】Pancreatic cancer; ANKRD22; Clinical prognosis; Cell proliferation; Cell invasion

胰腺癌（pancreaticcancer，PC）是常見的消化道腫瘤之一，隨著生活水平的提高，其發病率和死亡率呈逐年上升趨勢。手術切除是早期PC最佳的治療方式之一，然而由于疾病的隱匿性，絕大多數患者確診時已處于晚期。放化療是晚期和不可切除PC最主要的治療方式。以吉西他濱為主導的化療方案能夠一定程度上延長PC患者的總生存期（overallsurvival，OS），但效果有限[3]。本研究團隊前期通過分析SEER數據庫發現放療能夠顯著改善不可切除PC患者的OS，但仍缺乏大樣本前瞻性研究進一步證實[4。靶向治療和免疫治療可能為個體化PC患者帶來新的治療策略，但其研究進展緩慢[5-。早期篩查困難和缺乏靶向藥物是PC治療的難點，因此探索PC新的標志物和治療靶點具有重要意義。

錨蛋白重復序列（ankyrinrepeatdomain，ANKRD）蛋白在哺乳動物中廣泛存在，參與調節細胞生理功能，包括維持細胞骨架完整性、介導離子轉運及腫瘤發生等。ANKRD22是一種功能尚未明確的錨蛋白家族成員，包含4個ANKRD，由191種氨基酸組成。研究發現ANKRD22在部分腫瘤中高表達，并參與早期腫瘤的復發和轉移8。ANKRD22在PC中的表達和功能尚不明確。本研究通過挖掘TCGA數據庫并結合細胞表型實驗，探討ANKRD22在PC的表達、預后和對腫瘤細胞的調控作用。

1 材料與方法

1.1 數據來源

泛癌數據分析來源于TIMER2.0數據庫（http：//timer.comp-genomics.org/），人PC轉錄組和臨床數據來源于 TCGA-PC（http：//portal.gdc.cancer.gov）和GEO數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），使用R語言和Perl語言進行數據分析。免疫組化圖來源于HPA數據庫（http：//proteinatlas.org）。

1.2 材料

人PC細胞系PANC-1和AsPC-1來源于美國典型培養物保藏中心（AmericanTypeCultureCollection，ATCC），由空軍特色醫學中心實驗室保存。siRNA由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。DMEM完全培養基、RPMI-1640培養基、胎牛血清（FBS）、RNAiMAX、ANKRD22多克隆抗體（PA5-71839）、兔抗人IgG抗體（A18903）及 β? -actin多克隆抗體（PA1-183）購自美國ThermoFisher公司。 1% 青霉素-鏈霉素溶液（P/S）、 0.25% 胰酶購自北京陽光英銳生物科技有限公司。CCK8試劑盒購自日本DOJINDO公司。Transwell 小室購自美國Corning公司。AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海翌圣生物科技有限公司。

1.3 細胞培養和轉染

PANC-1細胞系生長于含有 10% FBS和 1% P/S的DMEM培養基中，AsPC-1細胞系生長于含有 10% FBS和 1% P/S的RPMI-1640 培養基中。細胞放置于 5% CO₂ 、 37^°C 恒溫培養箱中。當細胞生長至 90% 時使用 0.25% 的胰酶消化并傳代，選擇處于對數生長期的細胞進行實驗。

待 6cm 皿中的細胞生長至 70% 進行轉染，細胞用 0.25% 胰酶消化后處于懸浮狀態。配置轉染試劑（ 10μL RNAiMAX +490μL DMEM）和敲低試劑（ 10μL siRNA +490μL DMEM），將轉染試劑和敲低試劑混勻后靜置 20min ，隨后加入到細胞中， ^8h 后換液， ^72h 后取部分細胞驗證敲低效果，并進行后續的細胞功能試驗。

1.4 蛋白免疫印跡實驗

細胞消化離心后加人2倍體積的RIPA裂解液提取蛋白，加入RIPA等量的 2×SDS 后沸水煮15min 使蛋白充分變性，隨后進行蛋白電泳。蛋白轉至硝酸纖維素膜后用 5% 脫脂牛奶封閉 ^1h ，室溫下孵育一抗（ANKRD22多克隆抗體 1：1 000 稀釋、 β -actin多克隆抗體 1：2000 稀釋）和二抗（兔抗人IgG抗體 1：10000 稀釋），使用Bio-Rad顯影儀顯影（美國伯樂）。

1.5 CCK-8實驗

選取處于對數生長期的細胞進行實驗。細胞消化后呈懸浮液，計數后接種于96孔板，每孔約3000個細胞，設置三個復孔。細胞貼壁后每孔加入配制含 10% CCK-8試劑的培養基，細胞培養箱中孵育 ^2h ，隨后酶標儀測定 450nm 的吸光度值（0D），于第1、2、3、4天同一時間按上述步驟進行測量。

1.6 細胞克隆形成實驗

選取處于對數生長期的細胞進行實驗。細胞消化并計數，于 3.5cm 培養皿中接種500個細胞，繼續培養 14d ，多聚甲醛固定后結晶紫染色，拍照并計數。

1.7 細胞侵襲實驗

選取處于對數生長期的細胞進行實驗。細胞消化并用無FBS、無P/S的培養基懸浮，細胞計數后調整密度至 2.5×10⁵/mL ，在Transwell下室中加 500μL 含 10% FBS的培養基，上室中加入200μL 細胞懸液。細胞培養箱孵育 24h ，多聚甲醛固定后用結晶紫染色，顯微鏡下觀察并計數。

1.8 細胞凋亡實驗

按凋亡試劑盒說明書進行操作，細胞消化后用PBS洗滌。使用結合液重懸細胞，分別加入5μL AnnexinV-FITC和 10μL PI染色液，輕輕混勻。室溫避光孵育 10min ，流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。

1.9 統計學分析

使用SPSS23.0軟件進行數據分析，GraphPadPrism8.0 軟件進行圖形繪制。計量資料采用均數和標準差（ ）表示，使用t檢驗對兩組間數據進行統計學分析， Plt;0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1ANKRD22在泛癌中的表達情況

為探索ANKRD22在不同腫瘤及癌旁組織的表達情況，在泛癌數據庫TIMER2.0中提取了ANKRD22基因在泛癌中的表達差異柱狀圖。可見ANKRD22在多種腫瘤中表達增高，如乳腺癌、宮頸癌、膽管癌、結腸癌、膠質瘤、肺癌、PC、直腸癌、甲狀腺癌和子宮內膜癌等（圖1）。

2.2ANKRD22在PC中的表達和臨床預后分析

比較TCGA-PC數據庫中癌和癌旁組織的差異基因，ANKRD22在腫瘤組織中高表達（圖2-A）。將腫瘤患者按ANKRD22表達水平中位數分為高表達和低表達ANKRD22組后繪制生存曲線，結果顯示高表達ANKRD22的患者OS小于低表達組（圖2-B）。單因素分析顯示，ANKRD22的表達水平是影響PC預后的獨立因素[HR _.=1.392 ， 95%CI （1.121，1.729）， Plt;0.05] （圖2-C）。多因素分析同樣表明ANKRD22基因可作為PC獨立的預后因子 [HR=1.441 ， 95%CI （1.176，1.765）， Plt;0.05] （圖2-D）。

為了進一步驗證ANKRD22在PC中的表達和預后情況，從GEO數據庫中選擇了兩個PC生存數據集（GSE62452和GSE183795）。其中，GSE62452數據集包括69例PC和相鄰的非腫瘤組織的基因表達譜，GSE183795數據集包括139例PC患者的胰腺腫瘤組織、102例相鄰非腫瘤組織以及3例正常胰腺組織的微陣列基因表達譜。分別整理兩個數據集RNA表達數據和臨床數據，發現ANKRD22在腫瘤組織中均為高表達（圖3-A和圖3-B），且高表達ANKRD22的患者OS小于低表達ANKRD22的患者（ Plt;0.05 ，圖3-C和圖3-D）。

圖2ANKRD22在PC中的表達和臨床預后分析Figure2.Expressionand clinical prognosisanalysis of ANKRD22inpancreaticcancer注：A.TCGA數據庫中ANKRD22在PC和癌旁的表達；B.TCGA數據庫中ANKRD22的表達對PC預后的影響；C.ANKRD22的單因素獨立預后分析；D.ANKRD22的多因素獨立預后分析； ^*Plt;0.05， 。

圖3ANKRD22在GEO數據集的表達和臨床預后分析Figure 3. Expression and clinical prognostic analysis of ANKRD22 in the GEO datasets注：A、B.GES62452和GSE183795數據集中ANKRD22在PC和癌旁的表達；C、D.GES62452和GSE183795數據集中ANKRD22的表達對PC預后的影響； ^***Plt;0.001 。

2.3ANKRD22蛋白在正常組織和腫瘤組織的表達

從HPA數據庫提取正常胰腺組織和胰腺癌組織的免疫組化數據進行比較，結果顯示ANKRD22在PC組織中高表達，而在正常胰腺組織中幾乎不表達，ANKRD22主要定位于細胞質中（圖4）。

圖4ANKRD22在胰腺正常組織和PC組織中的免疫組化Figure4.ImmunohistochemistryofANKRD22innormalpancreatictissueandPCtissue

注：A.正常胰腺中ANKRD22的免疫組化代表圖；B.PC中ANKRD22的免疫組化代表圖；標尺： 50μm ；放大倍數： ×100

2.4敲低ANKRD22能抑制PC的增殖和侵襲能力

使用siNC和siANKRD22轉染PANC-1和AsPC-1細胞系 72h 后，通過Westernblot檢測轉染效果。兩種細胞系中siANKRD22-2和siANKRD22-3敲低效果更好，選擇敲低效果最好的siANKRD22-2用于后續功能實驗（圖5-A）。CCK-8和細胞克隆形成實驗表明，敲低ANKRD22后PC細胞的增殖能力顯著減弱（圖5-B和圖5-C）。Transwell實驗表明敲低ANKRD22后細胞侵襲能力明顯減弱（圖5-D）。

2.5 敲低ANKRD22不影響PC細胞的凋亡

兩種PC細胞中分別轉染siNC及siANKRD22-2后，使用流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。結果表明敲低ANKRD22并不影響PC細胞的凋亡（圖6-A和圖6-B）。

圖5敲低ANKRD22對PC細胞增殖和侵襲能力的影響

Figure 5.The impact of ANKRD22 knockdown on the proliferation and invasion capabities of PC cells注：A.Western blot驗證ANKRD22的干擾效果；B.CCK-8法檢測ANKRD22敲低對細胞增殖能力的影響；C.集落形成實驗檢測ANKRD22敲低對細胞增殖能力的影響及定量分析；D.Transwell實驗檢測ANKRD22敲低對細胞侵襲能力的影響（ S_P×200 ）及定量分析； ^*Plt;0.05 ， ^*Plt;0.01 。

圖6敲低ANKRD22對PC細胞凋亡的影響Figure6.The effect of ANKRD22 knockdown onapoptosis inPC cells注：A.流式細胞儀檢測ANKRD22敲低對PANC-1細胞凋亡的影響；B.流式細胞儀檢測ANKRD22敲低對AsPC-1細胞凋亡的影響；nc 0

3 討論

PC 相關死亡率近年來呈逐年攀升之勢，預計至2030年，PC將躍升為癌癥相關死亡的第二大主因[9-io]。對于無法手術切除的PC 患者，同步放化療成為其主要的治療手段，該方法在一定程度上能夠延長患者的 0S^[11] 。近年來，免疫治療與靶向治療在肺癌、淋巴瘤、頭頸部腫瘤等多種實體瘤中展現出較好的治療效果，然而在PC治療領域，其療效仍顯不足，且伴隨著患者不良反應的增加[12-13]。鑒于此，探尋有效的治療靶點，實現對PC細胞的精準殺傷，已成為當前研究亟待攻克的難題之一。

ANKRD22是一種核編碼的線粒體蛋白，隸屬于錨蛋白重復家族。最新研究揭示，ANKRD22在內質網膜上合成為N-豆蔻酰化的發夾樣單位膜蛋白，隨后定位于細胞質中的脂滴[4]。脂滴內的蛋白質在細胞的能量代謝、脂質運輸、蛋白降解以及隔離轉錄因子等關鍵細胞功能中扮演重要角色[15-16]，然而，ANKRD22的具體作用機制尚不明確。研究表明，ANKRD22在正常人類胃上皮細胞中顯著表達，而在激活的巨噬細胞中表達水平顯著升高。抑制ANKRD22已被證實是一種促進胃黏膜損傷修復的有效靶向治療策略。此外，ANKRD22在腫瘤進展過程中可能通過多種機制發揮重要作用。在非小細胞肺癌中，ANKRD22在腫瘤組織中高表達，通過參與E2F轉錄因子1（E2Ftranscriptionfactor1，E2F1）的轉錄調節，促進細胞增殖并加速細胞周期進程[18]。Cao等[19]的研究發現，ANKRD22可通過糖酵解途徑促進肺腺癌中巨噬細胞的M2極化，進而形成抑制性腫瘤免疫微環境。在神經膠質瘤中，ANKRD22同樣通過上調E2F1介導的MELK表達，促進膠質瘤細胞的增殖、遷移、侵襲及上皮-間質轉化[2]。在乳腺癌中，ANKRD22調節核仁和紡錘體相關蛋白1的表達，激活 Wnt/β -catenin信號通路，從而促進腫瘤細胞的增殖、侵襲及上皮-間質轉化[21]。腫瘤免疫微環境誘導的 ANKRD22還能促進結腸癌細胞的代謝重編程，靶向ANKRD22可能成為治療結腸癌的重要策略[22]。然而，在部分腫瘤中，ANKRD22似乎扮演著抑癌基因的角色。例如，ANKRD22的mRNA水平與前列腺癌分期呈負相關，高表達ANKRD22的患者在根治性前列腺切除術后表現出更長的無病生存期[23]。在卵巢癌中，髓源性抑制細胞是介導腫瘤免疫逃逸的主要免疫抑制細胞，而ANKRD22能夠逆轉其免疫抑制活性，成為治療卵巢癌的潛在靶標[24]。

ANKRD22在PC中的表達及其作用尚未見詳細報道。有研究基于TCGA公共數據庫中PC的臨床特征及相關數據，成功構建了包含ANKRD22在內的7個基因組成的預后預測模型[25]。隨后，其他研究進一步擴大了數據樣本量，結合TCGA數據集和7個GEO數據集，鑒定出包括ANKRD22在內的9個基因與PC的進展、侵襲性和預后密切相關[2。本研究發現，ANKRD22在PC組織中顯著高表達，且與患者較差的預后顯著相關。敲低ANKRD22的表達顯著抑制了腫瘤的生長、增殖和侵襲能力，但對PC細胞的凋亡無明顯影響。然而，ANKRD22影響PC細胞增殖和侵襲的具體分子機制尚未完全闡明，且本研究未深人探討ANKRD22的上下游信號通路及其與其他腫瘤相關基因的相互作用，需要進一步的實驗探索。綜上所述，ANKRD22有望成為PC治療的新靶點之一，其作用機制及相關靶向通路值得深入研究和探索。

倫理聲明：不適用

作者貢獻：研究設計：孫志佳、王穎杰；實驗操作、數據收集：孫志佳、宋卓、劉旭；統計分析、圖表繪制：宋卓、孫志佳、李新技；論文撰寫與審定：孫志佳、王穎杰

數據獲取：本研究中使用和（或）分析的數據可聯系通信作者獲取

利益沖突聲明：無

致謝：感謝空軍軍醫大學預防醫學系流行病學與統計學教研室劉昆教授對文章統計學方法的指導；感謝空軍特色醫學中心實驗室提供實驗場地和技術支持

參考文獻

1 CaiJ，ChenH，LuM，etal.Advancesin the epidemiologyofpancreatic cancer： trends，risk factors， screening，and prognosis[J]. Cancer Lett，2021，520： 1-11. DOI： 10.1016/j.canlet.2021.06.027.

2 Zhao Z，Liu W. Pancreatic cancer： a review of risk factors， diagnosis，and treatment[J]. Technol Cancer Res Treat， 2020，19： 1533033820962117. DOI： 10.1177/1533033820962117.

3 Okusaka T， Nakamura M， Yoshida M， et al. Clinical practice guidelines for pancreatic cancer 2O22 from the Japan pancreas society： a synopsis[J]. Int J Clin Oncol，2023，28（4）： 493-511. DOI： 10.1007/s10147-023-02317-x.

4 DiY，Song J， Sun Z， et al. Non-surgical pancreatic cancer： the role of radiotherapy in prolonging survival， a retrospective cohort study in the SEER database[J]. IntJ Surg，2024，111（1）： 818-827. DOI： 10.1097/JS9.0000000000001885.

5 LiE，Huang X， Zhang G，et al. Combinational blockade of MET and PD-L1 improves pancreatic cancer immunotherapeutic effcacy[J]. J Exp Clin Cancer Res，2021，40（1）： 279. DOI： 10.1186/s13046-021-02055-w.

6 涂東，于杰，蔡文科，等.胰腺癌CAR-T免疫治療研究進展[]. 解放軍醫學雜志，2022，47（4）：419-426.[Tu D，YuJ，Cai WK， et al. Research progress of chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy in the treatment of pancreatic cancer[J]. Medical Journal of Chinese People's Liberation Army，2022，47（4）： 419- 426.]DOI： 10.11855/j.issn.0577-7402.2022.04.0419.

7 Chakrabarty B，Parekh N.Sequence and structure-based analyses of human ankyrin repeats[J]. Molecules，2022，27（2）： 423.DOI： 10.3390/molecules27020423.

8 He DN，Wang N，Wen XL，et al.Multi-omics analysis reveals a molecular landscape of the early recurrence and early metastasis in pan-cancer[J].Front Genet，2023，14：1061364.DOI： 10.3389/ fgene.2023.1061364.

9 Rahib L， Smith BD，Aizenberg R， et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2O3O： the unexpected burden of thyroid， liver，and pancreas cancers in the United States[J]. Cancer Res， 2014，74（11）： 2913-2921. DOI： 10.1158/0008-5472.CAN-14- 0155.

10HeR， Jiang W， Wang C，et al. Global burden of pancreatic cancer atributable to metabolic risks from 1990 to 2019， with projections of mortality to 2030[J].BMC Public Health，2024，24（1）： 456. DOI：10.1186/s12889-024-17875-6.

11Sawicka E，Mirofczuk A，Wojtukiewicz MZ，et al. Chemoradiotherapy forlocallyadvanced pancreatic cancer patients：is it still anopen question？[J]. Contemp Oncol （Pozn）， 2016，20（2）： 102-108. D01： 10.5114/wo.2016.60066.

12Liu L，Huang X，Shi F，et al. Combination therapy for pancreatic cancer： anti-PD-（L）1-based strategy[J]. J Exp Clin Cancer Res， 2022，41（1）： 56. DOI： 10.1186/s13046-022-02273- ??W

13Wu J，Cai J. Dilemma and challenge of immunotherapy for pancreatic cancer[J]. Dig Dis Sci，2021， 66（2）：359-368.DOI： 10.1007/s10620-020-06183-9.

14Utsumi T，Hosokawa T， Shichita M ， et al. ANKRD22 is an N-myristoylated hairpin-like monotopic membrane protein specifically localized to lipid droplets[J]. Sci Rep，2021，11（1）： 19233.D0I： 10.1038/s41598-021-98486-8.

15 CruzALS，Carrossini N， Teixeira LK，etal.Cell cycle progression regulates biogenesis and cellular localization of lipid droplets[J]. Mol Cell Biol，2019，39（9）： e00374-e00418.DOI：10.1128/ MCB.00374-18.

16PetanT.Lipid dropletsin cancer[J].RevPhysiolBiochem Pharmacol，2023，185：53-86.D0I：10.1007/112_2020_51.

17 LiuJ，WuJ，WangR，etal.ANKRD22drivesrapidproliferation of Lgr5+cells and acts as a promising therapeutic target in gastric mucosal injury[J].Cell Mol Gastroenterol Hepatol，2O21，12（4）： 1433-1455. DOI： 10.1016/j.jcmgh.2021.06.020.

18 YinJ，Fu W，DaiL，et al.ANKRD22 promotesprogression of nonsmall cell lungcancer through transcriptional up-regulation of E2F1[J]. Sci Rep，2017，7（1）： 4430. DOI： 10.1038/s41598-017- 04818- y

19 CaoJ，ZhangH，WeiX，etal.ANKRD22 promotesM2 polarization inlungadenocarcinoma macrophages via the glycolytic pathway[J]. Chem Biol DrugDes，2024，103（1）：e14445.DOI：10.1111/ cbdd.14445.

20LiuX，ZhaoJ，WuQ，etal.ANKRD22promotesglioma proliferation，migration，invasion，and epithelial-mesenchymal transitionbyupregulatingE2F1-mediated MELK expression[J]. JNeuropathol Exp Neurol，2023，82（7）： 631-640. DOI： 10.1093/ jnen/nlad034.

21 WuY，LiuH，GongY，etal.ANKRD22enhancesbreast cancer cellmalignancybyactivatingtheWnt/β-cateninpathwayvia modulatingNuSAP1 expression[J].Bosn JBasic Med Sci， 2021， 21（3）：294-304.D0I：10.17305/bjbms.2020.4701.

22Pan T，LiuJ，XuS，et al.ANKRD22，a novel tumor microenvironment-induced mitochondrial protein promotes metabolic reprogrammingofcolorectal cancer cells[J]. Theranostics，2020，10（2）： 516-536.D0I： 10.7150/thno.37472.

23 QiuY，YangS，PanT，etal.ANKRD22isinvolvedinthe progression of prostate cancer[J]. Oncol Lett，2019， 18（4）： 4106- 4113. DOI： 10.3892/ol.2019.10738.

24 ChenH，YangK，PangL，etal.ANKRD22isapotential novel target for reversing the immunosuppressive effects of PMNMDSCs in ovarian cancer[J].J Immunother Cancer，2023，11（2）： e005527.DOI： 10.1136/jitc-2022-005527.

25 LuoL，Li Y，Huang C，et al.A new 7-gene survival score assay forpancreatic cancer patient prognosis prediction[J].AmJ CancerRes，2021，11（2）： 495-512. https：//pubmed.ncbi.nlm.nih. gov/33575083/

26 WuM，LiX，Zhang T，etal.Identificationof anine-gene signature and establishment of a prognostic nomogram predicting overall survival of pancreatic cancer[J].Front Oncol，2019，9： 996. DOI： 10.3389/fonc.2019.00996.

收稿日期：2024年10月12日修回日期：2025年02月05日本文編輯：桂裕亮 曹越