WTAP通過調控ACSL4mA甲基化促進脂多糖誘導人腎小管上皮細胞鐵死亡的研究

【中圖分類號】R631；R692.5 【文獻標識碼】A

WTAP promotes lipopolysaccharides-induced ferroptosis in human renal tubular epithelial cells by regulating ACSL4 m⁶A methylation

ZHANG Qin1，TANG Qing2， CHEN Bingyang1

1.Department of Intensive Care Medicine，Chengdu Seventh People's Hospital，Chengdu 61o213，China 2.Department ofRespiratory Medicine， Chengdu Seventh People's Hospital， Chengdu 610213，China Corresponding author： CHEN Bingyang， Email： bingyang_ch@163.com

【Abstract】 Objective To investigate the role of Wilms' tumor 1-associating protein （WTAP） in lipopolysaccharide （LPS） induced ferroptosis in human renal tubular epithelial cells （HK-2） and its molecular mechanism. Methods Expression differences of WTAP and long chain acyl-CoA synthetase 4 （ACSL4） between acute kidney injury tissues and healthy control tissues were analyzed based on the GEO database. HK-2 cells were treated with 10μg/mL LPS，and cell viability， cell apoptosis， reactive oxygen species （ROS）， glutathione （GSH） and Fe²⁺ contents were measured. The expression levels of GPX4，ACSL4，and WTAP were evaluated by Western bloting，and MeRIP-qPCR was used to examine the m⁶A methylation level of ACSL4.A cellular model of WTAP gene disruption with ACSL4 overexpression was constructed using si-RNA and plasmids to detect the binding of ACSL4 to WTAP and the effect of ACSL4 overexpression on cell injury and ferroptosis. Results Compared with the healthy control group，the expresson levels of WTAP and ACSL4 were significantly upregulated in acute Kkidney injury tissues. LPS treatment reduces HK-2cell viability，increasesapoptosis，reduces GSH content， increases the level of Fe²⁺ and ROS， reduces GPX4 expression， upregulates the protein expression of WTAP and ACSL4， and the m⁶A methylation level of ACSL4 ina time-dependent manner. After knocking down of WTAP，the protein expression and m⁶A methylation level of ACSL4 were decreased， the binding between ACSL4 and WTAP weakened，and the mRNA stability of ACSL4 was reduced. Compared with the LPS group， the LPS+si -WTAP group showed increased cellviability，decreased apoptosis，and reduced ferroptosis levels，and overexpresion ofACSL4 reversed the protective efects of si-WTAPon LPS-induced HK-2 cels. Conclusion WTAP upregulates the expresson of ACSL4 by promoting m⁶A methylation of ACSL4， thereby aggravating LPS-induced ferroptosis and cell injury in human renal tubular epithelial cells.

【Keywords】Wilms' tumor 1-associating protein; Long chain acyl-CoA synthetase 4; N6 methyladenosine; Ferroptosis; Sepsis

膿毒癥是一種由感染引起的全身炎癥反應綜合癥，常伴隨多器官功能障礙，發病率和死亡率極高]。其中，急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是膿毒癥的嚴重并發癥之一，與患者死亡風險增加密切相關[2]。膿毒癥AKI病理機制復雜，現有的治療方法難以有效降低患者病死率[。因此，深入闡明其病理生理機制并探索有效治療靶點，對于改善患者的預后具有重要的意義。

近年來，鐵死亡作為一種以鐵離子積累和脂質過氧化增高為特征的新型程序性細胞死亡途徑，在膿毒癥AKI等多種炎癥性疾病中的作用受到廣泛關注[4]。長鏈酯酰輔酶A合成酶4（longchainacyl-CoAsynthetase4，ACSL4）是脂質代謝的關鍵調節蛋白酶之一，通過促進膜磷脂的合成推動鐵死亡的發生[5。目前ACSL4調控的鐵死亡作用于膿毒癥AKI的具體機制尚不明確。

N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine， m⁶A ）甲基化修飾作為真核細胞內含量最豐富的RNA修飾形式，在基因表達調控中發揮重要作用Wilms 腫瘤1相關蛋白（Wilms'tumor1-associatingprotein，WTAP）是 m⁶A 甲基轉移酶復合物的核心組份]。有研究表明WTAP在AKI患者腎臟組織中顯著高表達，且與 ACSL4 的表達水平呈正相關，提示WTAP可能通過 m⁶A 修飾調控ACSL4的表達，進而影響AKI的鐵死亡進程[8。本研究旨在探討WTAP介導的 ACSL4m⁶A 甲基化對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導人腎小管上皮細胞HK-2鐵死亡和細胞損傷的影響，以期為膿毒癥AKI的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人腎小管上皮細胞（HK-2）購于美國模式培養物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC）；鏈霉素、青霉素、胎牛血清（FBS）和DMEM/F12培養基從美國Gibco公司購買；細胞增殖檢測試劑盒（CCK-8）由上海生工生物工程有限公司提供；細胞凋亡檢測試劑盒（AnnexinV-FITC）購于維百奧（北京）生物科技有限公司；谷胱甘肽（GSH）酶聯免疫吸附測定試劑盒和細胞亞鐵（ Fe²⁺ ）比色測定試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；DCFH-DA檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；氨基黑蛋白定量試劑盒由陜西健吉躍生物科技有限公司提供；ACSL4、WTAP、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）、 β. -actin、 m⁶A 蛋白一抗和HRP標記的山羊抗兔二抗購于美國Abcam公司；WTAPsiRNA以及ACSL4的過表達質粒購于上海吉瑪公司；X-tremeGENETM9DNA轉染試劑盒購于瑞士羅氏公司；Magna RIP^TM RNA結合蛋白免疫沉淀試劑盒購于默克生命科學有限公司。

1.2 數據的獲取與處理

從GEO 數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ ）下載GSE30718獲取AKI基因表達數據。分析WTAP和ACSL4在AKI和健康對照（Control）腎臟組織中的表達差異和相關性，其中AKI組26例，Control組11例。

1.3 細胞培養

HK-2采用DMEM/F12基礎培養基（含 10% FBS、 100U/mL 青霉素和 100μg/mL 鏈霉素），置于恒溫培養箱（ 37^°C ， 5%CO₂ ，飽和濕度）中培養。

1.4 CCK-8檢測細胞活性

將HK-2細胞以 4×10³ 細胞/孔的接種密度均勻鋪板于96孔細胞培養板中，加入 10μg/mL 的LPS培養4、8、 ^12h ，然后加入CCK-8試劑在 37^°C 下孵育 ^2h 。用酶標儀檢測 450nm 下的吸光度值（OD），細胞活性 （%）= （實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值） ×% 。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

將HK-2細胞以 4×10⁵/ 孔的密度接種于6孔板，LPS處理4、8、 ^12h 后，更換為無血清培養基繼續培養 24h 。收集細胞樣本，用PBS清洗后，加入預冷的 75% 乙醇溶液，于 4^°C 條件下固定 ^4h 。離心后加入 500μL 結合緩沖液重懸細胞。依次加入 5μL V-FITC 和 5μL 碘化丙啶染色液，室溫避光反應 5～15min 。流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6 GSH含量的測定

用預冷的PBS洗滌待測HK-2細胞兩次后，加入RIPA裂解液冰上裂解 30min ， 4^°C 、12 000×g 離心 10min 收集上清。GSH含量測定使用GSH酶聯免疫吸附測定試劑盒，按照說明書操作，在 450nm 波長下測定吸光值，通過標準曲線計算GSH濃度。

1.7 Fe²⁺ 含量的測定

Fe²⁺ 含量檢測采用細胞亞鐵（ Fe²⁺ ）比色測定試劑盒，將待測細胞裂解后加入顯色劑， 37^°C 避光孵育 30min ，在 593nm 波長下測定吸光值，根據標準曲線計算 Fe²⁺ 含量。

1.8 ROS測定

采用DCFH-DA熒光法測定HK-2細胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量。將HK-2細胞以 3×10³/ 孔的密度接種于96孔板中，加入 10μg/mL 的LPS培養4、8、 12h 。隨后在細胞中加入 的DCFH-DA，置于 37^°C 恒溫環境中孵育 20min 。熒光顯微鏡下觀察并記錄細胞的熒光表達情況。

1.9 蛋白質免疫印跡法（WesternBlot）

RIPA組織裂解液提取HK-2細胞總蛋白，采用氨基黑染色法測定蛋白含量。取 蛋白樣品，經 10% SDS-PAGE分離后，轉印至PVDF膜上， 5% 脫脂乳封閉 ^1h 。分別加入ACSL4（ 1：10000 ）、WTAP（ 1：1000 ）、GPX4（ 1：500 ）或 β. -actin（ 1：10 000 ）蛋白一抗在 4°C 下孵育過夜。三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（TBST）洗滌后與山羊抗兔IgG二抗（ 1：1 000 室溫孵育 2h_? 滴加ECL發光液顯影后凝膠成像，ImageJ軟件分析結果。

1.10 RNA甲基化免疫共沉淀后實時定量 PCR（MeRIP-qPCR）

收集待測細胞，加入Trizol裂解液進行RNA提取。隨后，分別將 m⁶A 特異性抗體和IgG對照抗體與蛋白A/G磁珠復合物在 4^°C 條件下共孵育 12～16h 。使用洗脫緩沖液回收RNA，通過苯酚-氯仿法純化RNA樣品。最后，采用qPCR進行定量分析。ACSL4上游引物5^′ -CCGACCTAAGGGAGTGATGA- ?3^′ ，下游引物5^′ -CCTGCAGCCATAGGTAAAGC- ?3^′ 。

1.11 細胞轉染

HK-2細胞以 2×10⁵/ 孔的密度接種于6孔板中，孵育 ^12h ，然后加入 2μL X-tremeGENETM9DNA轉染試劑分別將si-WTAP（5'-GGAACAGACUAAAGACAAACU-3'）、si-NC（ 5^′ -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'）或 0E-ACSL4 （pcDNA3.1-ACSL4過表達質粒）轉染細胞，培養 48h 后，加入 10μg/mL LPS進行誘導培養。

1.12 RNA免疫共沉淀（RIP）

使用MagnaRIPTMRNA結合蛋白免疫沉淀試劑盒，提取待測細胞RNA，加入 IgG 、WTAP或ACSL4抗體和蛋白A/G磁珠在 4^°C 下孵育過夜。洗滌后，在RNA-蛋白質復合物中加入蛋白酶K緩沖液。最后，使用苯酚－氯仿法提取RNA。qPCR檢測WTAP和ACSL4轉錄本之間的相互作用。

1.13 放線菌素D實驗

將HK-2細胞接種至96孔板中，分組處理后添加 5μg/mL 的放線菌素 D 。分別在培養的0、3、6h 收集細胞，qPCR檢測ACSL4的mRNA表達水平。

1.14 統計學分析

實驗數據采用SPSS26.0統計軟件進行處理和分析。計量數據以均數和標準差 表示，兩組間比較采用 t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步采用Bonferroni檢驗進行組間兩兩比較。 Plt;0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 WTAP和ACSL4在AKI患者組織中高表達

使用GEO數據庫對GSE30718表達譜數據進行分析，繪制AKI組與Control組腎臟組織樣本差異表達基因火山圖（圖1-A）。與control組相比，AKI組WTAP和ACSL4的表達水平顯著上調（ Plt;0.05 ，圖1-B）。此外，WTAP和ACSL4的表達水平呈顯著正相關（ Plt;0.01 ，圖1-C）。

2.2LPS對HK-2細胞活性和凋亡的影響

與control組相比，LPS處理以時間依賴性方式降低了HK-2細胞活性（圖2-A），促進細胞凋亡（圖2-B、2-C）。

2.3 LPS對HK-2細胞鐵死亡的影響

與control組相比，隨著LPS處理時間的延長，HK-2細胞中GSH的含量明顯下降（圖3-A），Fe²⁺ 和ROS水平逐漸提升（圖3-B、3-C）。同時，GPX4的表達隨著LPS處理時間增加而降低（ Plt;0.05 ，圖3-D）。

2.4LPS對HK-2細胞中ACSL4 m⁶A 甲基化 修飾的影響

與control組相比，LPS處理以時間依賴性方式提升HK-2細胞中ACSL4和WTAP蛋白表達（ Plt;0.05 ，圖4-A）。同時，與control組相比，ACSL4的 m⁶A 甲基化水平隨著LPS處理時間增加而升高（ Plt;0.05 ，圖4-B）。

2.5si-WTAP對LPS誘導的HK-2細胞中ACSL4m⁶A 甲基化修飾的影響

與LPS組相比，LPS + si-WTAP組細胞中WTAP和ACSL4的蛋白表達顯著降低（圖5-A），ACSL4的 m⁶A 甲基化水平顯著下降（ Plt;0.05 ，圖5-B）。此外，ACSL4和WTAP的結合在WTAP干擾組中被減弱（ Plt;0.05 ，圖5-C）。與control組相比，LPS組的ACSL4的mRNA穩定性顯著增強，在干擾WTAP后減弱（ Plt;0.05 ，圖5-D）。

圖1WTAP和ACSL4在AKI患者中的表達

Figure1. Expression of WTAP and ACSL4 in patientswithacute kidney injury注：A.AKI與健康對照組織樣本差異表達基因火山圖；B.WTAP和ACSL4在組織中的表達；C.WTAP和ACSL4在組織中表達的相關性； ^*Plt;0.05 。

圖2LPS對人腎小管上皮細胞HK-2活性和凋亡的影響 Figure2.Effect ofLPSoncell viabilityandapoptosis of humanrenal tubularepithelial cell HK-2

注：A.CCK-8檢測細胞活性；B、C.流式細胞術檢測細胞凋亡；*與對照組比較， Plt;0.05 ；#與4h組比較， Plt;0.05 258 h組比較，Plt;0.05 。

2.6 OE-ACSL4逆轉si-WTAP對ACSL4蛋白的影響

與LPS組相比， LPS+si. -WTAP組中WTAP和ACSL4的蛋白表達顯著降低（ Plt;0.05 ）。與LPS+si. -WTAP組相比，LPS+si-WTAP ^′+^′ OE-ACSL4組中WTAP的蛋白表達沒有明顯改變，而ACSL4的蛋白表達顯著升高（ Plt;0.05 ，圖6）。

2.7si-WTAP通過抑制ACSL4影響LPS誘導的HK-2細胞損傷

與LPS組相比，LPS+si-WTAP組的HK-2細胞活性明顯升高，在ACSL4過表達后下降（ Plt; 0.05，圖7-A）。干擾WTAP降低了LPS誘導的HK-2細胞凋亡，并在ACSL4過表達后提升（ Plt; 0.05，圖7-B）。

2.8WTAP敲低通過抑制ACSL4抑制LPS誘導的細胞鐵死亡

與LPS組相比，LPS+si-WTAP組細胞中GSH含量顯著升高， Fe²⁺ 和ROS水平明顯降低（ Plt; 0.05）；然而，在 LPS+si-WTAP+OE-ACSL4 組中，GSH含量下降， Fe²⁺ 和ROS水平提升（ Plt;0.05 ，圖8-A至圖8-C）。干擾WTAP上調GPX4的蛋白表達，并在加入OE-ACSL4后下降（ Plt;0.05 ，圖8-D）。

圖3LPS對人腎小管上皮細胞HK-2鐵死亡的影響

Figure 3.Effect of LPSon ferroptosis in human renal tubular epithelial cell HK

主：A.細胞中GSH的含量；B.DCFH-DA檢測ROS水平；C.細胞中Fe+含量；D.Western blot檢測GPX4蛋白表達； ^*Plt;0.05，

注：A.Westernblot檢測ACSL4和WTAP蛋白表達及定量分析；B.Me-RIP檢測ACSL4的 m⁶A 甲基化水平；C.RIP檢測ACSL4和WTAP的結合；D.RNA分解實驗檢測ACSL4mRNA的穩定性；*與對照組比較， Plt;0.05 ；#與LPS組比較， Plt;0.05 （204號

圖5WTAP敲低對LPS誘導的HK-2細胞中ACSL4 m⁶A 甲基化修飾的影響 =igure 5.Effect of WTAP knockdown on ACSL4 m⁶A modification in LPS induced HK-2 cells

圖6si-WTAP和OE-ACSL4對ACSL4和WTAP蛋白表達的影響

Figure 6.Effects of si-WTAPand OE-ACSL4 co-transfection on the protein expression of ACSL4 and WTAP 注：*與對照組比較， Plt;0.05 ；#與LPS組比較， Plt;0.05 ；amp;與LPS+si-WTAP組比較， Plt;0.05 。

Figure7.Effects of si-WTAP and OE-ACSL4co-transfectionon LPS-induced injuryin HK-2cells 注：A.CCK-8檢測細胞活性；B.流式細胞術檢測細胞凋亡；*與對照組比較， Plt;0.05 ；#與LPS組比較， Plt;0.05 ；amp;與 LPS+si -WTAP組比較， Plt;0.05， 0

圖7si-WTAP和OE-ACSL4對LPS誘導的HK-2細胞損傷的影響

圖8si-WTAP和OE-ACSL4對LPS誘導的HK-2細胞鐵死亡的影響Figure8.Effectof si-WTAPand OE-ACSL4 co-transfectionon LPS-induced ferroptosis in HK-2 cells主：A.DCFH-DA檢測ROS水平；B.細胞中GSH含量；C.細胞中Fe2含量；D.Westernblot檢測GPX4蛋白表達；*與對照組比較， Plt;0.05 ；與LPS組比較， Plt;0.05 ；amp;與LPS+si-WTAP組比較， Plt;0.05 。

3 討論

m⁶A 甲基化修飾廣泛存在于真核生物的RNA中，通過影響RNA的表觀遺傳修飾調節基因表達，參與到多種生物學過程的調控中[。研究表明 m⁶A 甲基化在膿毒癥AKI的疾病發展中發揮重要作用，有望成為潛在的治療靶點[]。

m⁶A 修飾由甲基化轉移酶和去甲基化酶共同調控[]。WTAP作為關鍵的甲基化轉移酶之一，通過促進RNA腺苷酸第六個氮原子的甲基化，影響RNA的出核、剪接、翻譯和穩定性等，進而參與氧化應激、炎癥和細胞死亡等過程的調控[2]。在LPS 誘導的AKI動物和細胞模型中，WTAP高表達加劇炎癥和線粒體損傷[3]。順珀誘導的AKI小鼠腎臟損傷組織中也觀察到整體 m⁶A 水平和WTAP表達的增高[14]。本研究通過GEO數據分析表明WTAP在AKI組織中的表達顯著上調，并且在LPS誘導的人腎小管上皮細胞中，隨著LPS刺激時間的加長，WTAP的蛋白表達逐漸提升，與Ni等研究結果一致，提示WTAP在膿毒癥AKI中可能發揮重要作用。

上皮細胞是腎結構和功能的基礎，膿毒癥AKI發生時腎上皮細胞發生鐵死亡，腎組織受到嚴重破壞，器官功能受損[15]。在膿毒癥AKI實驗模型中，抑制鐵死亡被證明可以有效減輕AKI損傷[。鐵死亡的發生和細胞中鐵離子的累積和ROS水平的升高緊密相關[7]。在生化特征上，鐵死亡表現為GSH 的耗竭和GXP4 的失活[8]。本研究發現，隨著LPS誘導時間的加長，HK-2細胞的活性降低，凋亡上升，ROS和鐵離子水平升高，同時伴隨GSH含量和GXP4蛋白表達降低，表明鐵死亡參與了LPS誘導的HK-2細胞損傷。

ACSL4是調控鐵死亡的關鍵分子，通過促進多不飽和脂肪酸的酯化作用，驅動脂質過氧化和鐵死亡的發生[]。ACSL4失調與多種疾病有關，包括癌癥、神經退行性疾病、心血管疾病、代謝性疾病和AKI等[20]。在AKI小鼠腎小管中特異性敲除ACSL4能夠明顯降低鐵死亡并抑制小鼠腎臟病理損傷[21]。 α_a2 腎上腺素受體激動劑右美托咪啶能夠通過抑制ACSL4減輕缺血/再灌注引起的鐵死亡和 AKI^[22] 。本研究證實，ACSL4在AKI患者組織和LPS誘導的HK-2細胞中均顯著高表達，提示ACSL4介導的鐵死亡在膿毒癥AKI中起關鍵作用。

近年來， m⁶A 修飾在鐵死亡調控中的作用逐漸被揭示[23-24]。例如，甲基化轉移酶 METTL3 能通過促進ACSL4的 m⁶A 修飾加重受損肝臟的鐵死亡[25]。敲低METTL14可以抑制ACSL4的表達，逆轉急性胰腺炎的炎癥和鐵死亡[2。老年肝臟中去甲基化酶FTO的缺乏會通過上調ACSL4加劇缺血/再灌注引起的鐵死亡[27]。但目前有關ACSL4在AKI中 m⁶A 修飾的調控還未有報道。本研究中觀察到在AKI患者的腎臟組織中甲基化轉移酶WTAP和ACSL4的表達呈顯著正相關，且抑制WTAP能夠通過降低ACSL4的 m⁶A 修飾水平，降低其mRNA穩定性和蛋白表達。此外，敲低WTAP可減輕LPS誘導的HK-2細胞損傷和鐵死亡，而ACSL4過表達可逆轉這一效應。以上結果提示，WTAP可通過增加ACSL4的 m⁶A 修飾促進其表達，進而調控鐵死亡的發生。

綜上所述，本研究揭示了WTAP通過 m⁶A 修飾提升ACSL4表達，促進LPS誘導的腎小管上皮細胞鐵死亡的分子機制。這一發現為闡明 m⁶A 修飾在膿毒癥AKI中的作用提供了新的理論依據，并為AKI的臨床治療提供了潛在靶點。然而，WTAP和ACSL4在膿毒癥中的作用仍需在動物模型中進一步驗證，以明確其臨床應用價值。未來的研究可進一步探索WTAP/ACSL4調控軸在膿毒癥AKI中的具體作用機制，為開發靶向 m⁶A 修飾的治療策略提供更多實驗依據。

倫理聲明：不適用

作者貢獻：研究設計：張琴、陳兵陽；實驗操作、數據分析：張琴、唐慶；論文撰寫：張琴；論文審定：陳兵陽

數據獲取：本研究中使用和（或）分析的數據可聯系通信作者獲取

利益沖突聲明：無

致謝：不適用

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收稿日期：2025年03月07日修回日期：2024年05月20日本文編輯：桂裕亮 曹越