鄭州市草莓炭疽病病原菌的分離鑒定及防治藥劑篩選

Isolation，Identificationand ScreeningofControlAgents for StrawberryAnthraxPathogen in Zhengzhot

Abstract：ToidentifythepathogenspeciescausingstrawberyanthracnoseinZhengzouandscreenefectivefungicidesfordisease controlplantsinfectedwithstrawberryanthracnosewerecolectedfrommajorstrawberrygrowingareasinZhongmucounty， Zhengzhoucityhathogensereiated，culured，dentifid，oughmorphologicalcaracterizationndmolecularalyis，followedbypathogenicitytests.Eightcommonlyusedfungicideswereselectedtodeterminetheirvitrosensitivityagainsttheisolated Coletotrichumstrains，andteircontrolficacyasfurtherevaluatedbypotexperiments.Thersultsdemonstratedthatthecusalagentofstrawberranthracnosein ZhengzhouwasColltotrichumsiamensewitintheColltotrichumgloeosporioidesspciescomplex. Sensitivity tests revealed that the isolated C.siamense strain exhibited the highest susceptibility to 450 g?L^-1 prochloraz，with a mean EC ¹⁵⁰ value of 0.311 4 μ_o?mL^-1 ，followed by difenoconazole （EC5o=14.75 μ_c?mL^-1 ） and trifloxystrobin-tebuconazole （EC5o=50.408 1 μg?mL^-1） .Pot experiments showed that 40% difenoconazole provided the optimal control efficacy，followed by 450 g?L^-1 prochloraz and 75% trifloxystrobin-tebuconazole.In conclusion， 450g?L^-1 prochloraz， 40% difenoconazole，and 75% trifloxystrobin-tebuconazole could serve as effective agents for managing strawberry anthracnose in Zhengzhou.

Keywords：strawberyanthracnose；pathogenidentification;fungicidesensitivitytesting;controleficacyinpotexperiment

草莓炭疽病可為害草莓整個生長期，以育苗期和移栽定植期最重，可侵害草莓各個部位，造成局部病斑或整株枯死，給農民帶來嚴重的經濟損失。據報道，草莓炭疽病的病原菌分類復雜，為炭疽菌屬的多種真菌，常見的有膠孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）尖孢炭疽菌（Colletotrichumacutatum）草莓炭疽菌（Colletotrichumfragariae）和黑線炭疽菌（Cdematium）2-5]。國內外研究表明，不同地區草莓炭疽病病菌的優勢種不同，北京、杭州、上海等地草莓炭疽病的優勢病原菌為膠孢炭疽菌，膠孢炭疽菌是包含多個隱存種的復合種，湖北草莓炭疽病的主要致病菌為膠胞炭疽菌復合種中的暹羅炭疽菌（Colletotrichumsiamense），四川草莓炭疽病的主要病原菌為膠胞炭疽菌復合種中的C.fructicola[]。不同氣候條件的地區，炭疽病的致病菌存在差異，不同菌種的炭疽病菌對殺菌劑的敏感度可能不同，因此明確鄭州地區炭疽病的種類對鄭州市草莓炭疽病病害防治具有一定的指導意義。本研究選取鄭州市中牟縣主要草莓種植區草莓炭疽病的植株，開展病原菌的分離、培養及鑒定工作，明確了鄭州市草莓炭疽病的主要病原菌為膠胞炭疽菌復合種中的暹羅炭疽菌，同時選擇8種生產上常用的殺菌劑，對其進行了室內敏感性測定和盆栽防效分析，為生產中高效防治鄭州市草莓炭疽病提供實踐參考，篩選出適用于鄭州地區的草莓炭疽病的殺菌劑，提高殺菌劑的針對性。

1材料與方法

1.1試驗材料

病樣采自鄭州市中牟縣主要草莓種植區，供試 草莓品種為隋株供試培養基：馬鈴薯培養基（PDA）[，用于草莓炭疽病病原菌的分離、保存、鑒定和敏感性測定。

供試殺菌劑見表1。

表1供試殺菌劑終質量濃度梯度設置

Tab.1Settingthe final mass concentration gradient of the tested fungicide

1.2試驗方法

1.2.1病原菌分離炭疽病株采自鄭州市中牟縣主要草莓種植區。采用常規組織分離法對草莓病株不同發病部位的組織進行取樣。將葉片樣剪成 4～ 5mm 的小塊，根部洗凈去皮剖開，取近褐變的組織，切成 4～5mm 的小段。在無菌臺對組織表面進行消毒，將組織塊放不同的離心管中，先用滅菌水沖洗2遍，然后用 75% 酒精浸泡 30s ，再用滅菌水沖洗1遍，用 0.1% 升汞處理 3～5min ，用滅菌水將組織塊沖洗干凈。隨后，把清洗后的組織塊防入PDA平板中部， 28^°C 暗部環境下培養4～5d，待菌落形成，從邊緣挑取少量菌絲，接種至新的PDA平板， 28^°C 暗環境下培養，重復3次，最終獲得純菌種。

1.2.2病原菌形態觀察將純化過的菌種接種到50mL 無菌水中，加 1mL 馬鈴薯葡萄糖液體培養基，置于搖床 28^°C 搖10d，將部分液體進行單胞分離培養，將單個分生孢子長出的菌落接種到于PDA平板上，置于培養箱中，溫度設置 28^°C 進行暗處理，觀察培養皿中菌落的特征。另外，取 0.06mL 于載玻片，借助顯微鏡觀察分生孢子形態。

1.2.3病原菌基因序列分析對純化后的菌株進行DNA提取，提取過程參考CATB法。隨后，利用通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAAC-CTGCGG-3'）和ITS4（ ?5^′ -TCCTCCGCTTATTGATA-TGC-3'）擴增rDNA-ITS序列[3]。PCR產物經 1% 瓊脂糖凝膠電泳后，送往華大基因鄭州分公司測序。將測序結果與NCBI網站BLAST進行比對，運用MEGA10.2.6軟件最大似然法進行進化樹分析[4。

1.2.4草莓暹羅炭疽菌葉片致病性檢測將隋株草莓葉片洗凈，用 75% 酒精對葉片表面擦拭消毒，準備濃度為 1×10⁶ 個 ?_mL^-1 的暹羅炭疽菌分生孢子懸浮液，用滅菌槍頭吸取 100μL 懸浮液接種在草莓葉片上，并在對照組各接種 100μL 無菌水，隨后將葉片放進培養血中，培養血提前打孔，放入濾紙后加1mL 滅菌水，用封口膜將培養血封住，置于培養箱中培養，溫度設置 28^°C ，光處理 14h ，暗處理 10h 。每個處理3次重復。接種后，每隔1天進行觀察，并記錄葉片發病情況。對發病的葉片組織進行分離，確定接種病菌是否為致病菌。

1.2.5殺菌劑敏感性測定采用菌絲生長速率法進行殺菌劑室內毒力測定。在超凈工作臺上，用無菌水將8種殺菌劑原液稀釋成5個濃度梯度，取 1mL 各濃度藥液，加入到 49mL 冷卻至 50～60^circC 的PDA培養基中[5]，充分混合均勻后等量倒入3個滅菌培養血中。此時，培養血中藥劑濃度即為含藥培養基的終質量濃度，其濃度梯度設置見表1。其中，以供試殺菌劑田間推薦的最高使用濃度為5個濃度梯度的最高濃度，以加無菌水的培養基作空白對照（CK），每個濃度3次重復。隨后，使用直徑 7mm 的打孔器，從活化好的草莓暹羅刺盤孢菌落邊緣獲取菌餅，接種至上述含藥培養基中，以加無菌水的處理作為對照。接種好的培養基置于培養箱中，溫度設置28^°C ，進行暗培養，待CK的菌落長到培養血 80% 時，用十字交叉法量取菌落直徑，計算菌絲生長抑制率和各藥劑的 EC₅₀ 值，以毒力最高的殺菌劑的 EC₅₀ 值為基準值，計算其他藥劑的相對毒力指數。菌絲生長抑制率公式如下：

菌絲生長抑制率 （% ）= 對照菌落直徑-藥劑處理菌落直徑×100 對照菌落直徑-菌餅直徑

1.2.6盆栽防效試驗（1）試驗設計。供試草莓品種為隋株，選用長勢一致、三葉一心的隋株幼苗，定植于直徑 13.7cm 的方口萬象盆中，基質提前滅菌，草炭、珍珠巖、蛭石配比為3：1：1，設置9個處理（表3），各處理3次重復，按隨機區組劃分，共27個小區，每個小區10盆草莓苗。

（2）施藥時間及方法。2024年7月3日，準備濃度為 1×10⁶ 個 ?_mL^-1 暹羅炭疽分生孢子懸浮液，用噴霧器對所有處理的草莓幼苗進行噴霧接種。2024年

7月10日，根據藥劑使用推薦濃度，使用噴霧器對8個處理的草莓苗進行第1次噴霧施藥，CK噴等量清水；2024年7月17日，8個處理進行第2次噴霧施藥，CK噴等量清水。施藥時，藥液要充分潤濕草莓莖和正反葉片，并且不滴落。

（3）調查方法。每個小區隨機定點選6株草莓苗，分別在7月10日（第1次施藥7d后）7月17日（第2次施藥7d后）定點調查草莓葉片的感染情況，記錄每個小區草莓苗的葉片總數、各級感病葉片數，計算病情指數和防治效果。發病葉片分級標準、病情指數及防治效果計算參考吳丹的方法。

2 結果與分析

2.1草莓暹羅炭疽菌的形態觀察

PDA培養基上，草莓暹羅炭疽菌以均等半徑向四周生長。開始時，其菌落為表現為白色、圓形，邊緣整齊且呈絨毛狀平鋪。培養3～4d后，菌落中心逐漸轉變為灰黑色，而邊緣新生菌絲仍為白色絨毛狀，培養5d時，菌落形態如圖1-A、圖1-B所示。此外，該菌的分生孢子橢圓形且呈現圓筒狀，無色、單胞，兩頭橢圓，內含1～2個油球，直徑范圍為（12.2～18.5）μm×（4.5～8.0）μm ，分生孢子萌會發產生球形或不規則形的附著胞，具體形態見圖1。

A.暹羅炭疽菌正面形態；B.暹羅炭疽菌背面形態；C.暹羅炭疽菌分生孢子；D.暹羅炭疽菌菌絲形態。

圖1草莓暹羅炭疽菌的形態特征

Fig.1MorphologictraitsofstrawberryColletotrichumsiamense

2.2分子生物學鑒定結果

以分離到的菌株ZN20210201-11菌絲DNA為模板，采用真菌通用引物ITS1/ITS4進行擴增，凝膠電泳顯示目的DNA片段長度范圍為 500～600bp 。通過BLAST比對分析發現，該菌株ZN20210201-11與Colletotrichumsiamense的相似度為 99.65% 。隨后，以Ramulariacoleospori作為外類群菌株對照，進一步構建系統發生樹，顯示菌株ZN20210201-11與Colletotrichumsiamense聚為一支，支持率為 91% 。因此，將菌株ZN20210201-11鑒定為Colletotrichumsiamense（圖2）。

2.3草莓暹羅炭疽菌葉片致病性

接種 24h ，暹羅刺盤孢的葉片開始形成附著孢。接種2d后，葉片開始發病，出現病斑，病斑為水漬狀。接種7d，病斑面積超過 50% ，葉片組織細胞腐爛，葉片呈現枯萎狀，病斑中心呈深褐色，病斑周圍葉片變黃褐色。CK的葉片顏色鮮綠、無病斑、無萎蔫，葉片組織細胞健康，無明顯變化。對發病部位進行組織分離，得到暹羅炭疽菌，確定暹羅炭疽菌為致病菌。

圖2基于ITS序列以最大似然法構建草莓暹羅炭疽菌與相關菌株的系統發生樹 Fig.2Constructingaphylogenetictreeof strawberrysiameseanthraxandrelatedstrainsusing maximum likelihood method based on ITS sequence

2.4草莓暹羅炭疽菌對8種殺菌劑的敏感性

由表2可知，供試8種殺菌劑對草莓暹羅炭疽菌絲生長抑制作用由高到低分別為 450g?L^-1 咪鮮胺、 10% 苯醚甲環唑、 75% 肟菌·戊唑醇、 50% 咯菌睛、 25% 溴菌腈、 10% 多抗霉素 ，20% 吡唑醚菌酯和80% 福美雙。其中，咪鮮胺對草莓暹羅炭疽菌的室內毒力最高，有效中質量濃度 EC₅₀ 值為0.3114μg?mL^-1 ，苯醚甲環唑和肟菌戊唑醇對草莓暹羅炭疽菌的室內毒力次之，有效中質量濃度 EC₅₀ 值分別為14.75?50.4081μg?mL^-1 ，相對毒力指數分別為47.37、50.41。福美雙對草莓暹羅炭疽菌的室內毒力最低， EC₅₀ 值為 4871.92μg?mL^-1 ，吡唑嘧菌酯和多抗霉素對草莓暹羅炭疽菌的室內毒力也較低， EC₅₀ 值分別為 889.10，550.68μg?mL^-1 ，相對毒力指數為2854.84，1768.40 0

表2暹羅炭疽菌對8種殺菌劑的敏感性測定

Tab.2Sensitivitydetermination of siameseanthrax bacteriato8fungicides

2.5草莓暹羅炭疽菌的盆栽防效試驗

由表3可知，第1次用藥7d后和第2次用藥7d后，CK的病情指數均為最高。第1次用藥7d后，所有處理的病情指數比藥前病情指數有所提高，CK處理的病情指數增長最快，增幅為364.74% ，其次是T7和T1，分別為 225.39% 、200.23% 。第2次用藥7d后，各藥劑處理的病情指數均顯著低于CK，其中T5處理的病情指數最低，為13.56；其次為T8、T4處理，病情指數分別為15.29和16.35。

各藥劑處理對草莓炭疽病防治均有明顯效果。

第1次用藥7d后和第2次用藥7d后，均為T5處理的防效最高，分別為 73.92%.68.9% ，顯著高于其他處理，其次為T4、T8處理，T4處理的防效為65.60% 、 62.49% ，T8的防效為 65.48%，64.92% ，T7處理的防效最低，為 43.46%，34.16% 。

表3不同藥劑對草莓暹羅炭疽菌盆栽防治效果

Tab.3 Control effect of different pharmaceutical on potted strawberry anthracnose fungus in Siam

3討論與結論

3.1 討論

3.1.1草莓炭疽病的病原鑒定草莓炭疽病是草莓栽培中極具威脅的病害之一，防控難度較大。受不同地理位置與氣候條件影響，病原菌進化呈現出豐富的多樣性。目前已發現23個炭疽菌致病種可引發草莓炭疽病。其中，膠孢炭疽菌引起草莓炭疽病的報道有很多，但是膠胞炭疽菌是隱含多個菌種的復合種，暹羅炭疽菌（Colletotrichumsiamense）為膠孢炭疽菌復合種之一。不同隱存種的膠胞炭疽菌對殺菌劑的敏感性存在差異，能對草莓炭疽病的病原進行準確鑒定，對草莓炭疽病的藥劑使用具有指導作用。本研究通過在鄭州中牟縣草莓種植區草莓炭疽病株進行采樣并進行病原菌鑒定，最終確定引起鄭州草莓炭疽病的病原菌為暹羅炭疽菌（Colletotrichumsiamense）。

3.1.2防治草莓炭疽病殺菌劑的篩選目前草莓炭疽病的防治手段主要包括農業防治、生物防治和化學防治[5。農業防治以選育抗病品種、加強栽培管理和及時清園為主8，是基礎防控措施，但生產中多作為輔助手段，難以單獨應對病害爆發。生物防治采用“以菌防菌”策略（貝萊斯芽孢桿菌[、木霉菌[20]），具有綠色安全的優勢，但目前多數技術仍處于研究階段，尚未大規模應用于田間。化學防治是當前最主要的防控手段，然而生產中存在盲目用藥、長期單一施藥等問題，導致部分病原菌對一些化學藥劑（如多菌靈、甲基托布津、乙霉威等藥劑靶標菌株）已產生明顯抗藥性，防治效果逐年下降。因此，需結合炭疽病病原菌鑒定結果和防效試驗結果，針對性使用化學藥劑，并強化農業防治與生物防治的協同應用，以構建科學高效的綜合防控體系。

通過室內敏感性測定試驗發現，在推薦濃度下，大部分藥劑對暹羅炭疽菌的菌絲生長均能起到較明顯的抑制效果，相對抑制率與藥劑濃度成正比。從EC₅₀ 值比較結果來看，對暹羅炭疽菌的菌絲生長毒力最強的3種藥劑依次為 450g?L^-1 咪鮮胺 .40% 苯醚甲環唑、 75% 肟菌·戊唑醇，這與姜莉莉等[15和唐冬蘭等研究結果一致。通過盆栽防效試驗發現，在推薦濃度下，大部分藥劑都能對草莓暹羅炭疽菌產生防治效果，但是不同藥劑防治效果有明顯差異。40% 苯醚甲環唑的防治效果最好，其次為 450g?L^-1 咪鮮胺和 75% 肟菌·戊唑醇。值得注意的是，在室內敏感性測定試驗中， 450g?L^-1 咪鮮胺對暹羅炭疽菌菌絲生長的抑制作用最強，但在盆栽防效試驗中的表現卻不如 40% 苯醚甲環唑，這可能與病原菌的狀態不同有關，室內敏感性測定時病原菌處于營養生長階段（菌絲體），盆栽試驗中病原菌可能需經歷侵染階段（如孢子萌發、穿透寄主表皮），此時可能分泌降解酶或形成附著胞等結構，對藥劑的抵御能力會產生變化。曾向萍等對海南辣椒炭疽病的研究發現，該病原菌的菌絲對嘧菌酯的敏感性高于分生孢子。

3.2 結論

病原鑒定的結果表明，鄭州市草莓炭疽病的病原菌為暹羅炭疽菌Colletotrichumsiamense。室內敏感性測定試驗結果表明，對暹羅炭疽菌的菌絲生長抑制作用最明顯的藥劑分別為 450g?L^-1 咪鮮胺、10% 苯醚甲環唑、 75% 肟菌·戊唑醇。盆栽防效試驗結果表明，在盆栽條件下防治炭疽病效果最好的藥劑為 40% 苯醚甲環唑，其次為 450g?L^-1 咪鮮胺和75% 肟菌·戊唑醇。綜合病原鑒定、室內敏感性測定和盆栽防效試驗結果，筆者建議 450g?L^-1 咪鮮胺、10% 苯醚甲環唑和 75% 肟菌·戊唑醇用于防治鄭州市草莓炭疽病，可交替使用。為提高防治效果，最好在發病初期進行藥劑防治，間隔7～10d施藥。本研究僅開展了藥劑對病原菌離體菌絲的室內毒力測定試驗與盆栽防效試驗，暫未開展田間實地防效驗證。生態環境與土壤條件等因素對藥劑作用效果可能會產生影響，這些篩選所得藥劑在大田實際應用中的防治效果有待進一步探究。

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