基于KASP技術的SNP標記用于3個松花菜新品種種子純度檢測

中圖分類號：S641.3 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006—6500.2025.06.001

ApplicationofSNPMarker BasedonKASPTechnologyin SeedPurityofThreeNewVarietiesofLoose-curd Cauliflower

LIU Lili'， JIANG Hanmin1， ZHANG Wei2，SHANXiaozheng1，WEN Zhenghual，ZHANG Xiaoli1 （1.StateKeyaboratoryofVegeablebreeding，ianjincadeyofAgiculturaliene，anjin3O92，a;2.ajKr nelAgricultural Scienceand TechnologyCompanyLimited VegetableResearch Institute，Tianjin3Ool92，China）

Abstract：Toadresstheintensecompetitionintheseedmarketandensuretherobustdevelopmentofthecauliflowerseedindustry genotyping technologywasemployedforpreciseandeficientvarietyidentificationandpurityassessmentofovellosecauliflower cultivars.Singlenucleotidepolymorphisms（SNPs）weredetectedusingthecompetitivealelespecific KompetitiveAlele Specific PCR （KASPPCR）techniqueonloosecauliflowerastheexperimentalmaterial.High-throughputsequencingfacilitatedteidentificationofNPlocisuitableforbrocolivarietydiscriminationthroughbioinformaticsanalysisSubsequently，thepurityofthenew SonghuavarietiesJnsong75，Jinsong90，andJinsong105waaseedusingtheidentifiedSNPlociandKASPgenotypingtecholo gy.Theresultsdemonstratedahighlevelofagreementbetwenthegenotypingresultsndpurityasessment（r0.904）.Inconclusion，theSNPmarker-basedapproachestablisedinthissudyofersareliablemethodforvarietyidenificatonandpurityassessment，therebyitigatingconomiclosesfromsdentifidhyrds，inimiingpotentialdisputes，hancingidentificatioey andacuracy，providingsubstantialevidenceforvarietyprotectionandpresentingsignificantpracticalvalueintheralmofSongua hybrid dentification and variety safeguarding.

Keywords： loose-curd cauliflower; KASP;SNP;seed purity

近年來，松散型花椰菜即人們常說的松花菜，因其獨特品種優勢備受青睞。在口感上，松花菜由于其花梗翠綠、質地鮮嫩、風味絕佳，深受家庭主婦和廚師們的喜愛。在營養上，松花菜富含多種維生素，如維生素C、維生素K等，礦物質鈣、鐵、鉀含量也十分可觀，還含有豐富的膳食纖維，滿足了當下人們追求健康飲食的需求。逐步替代了部分緊花類型花椰菜在消費市場的地位，也契合了相關產業對食材多樣化的要求，市場份額迅速擴張，展現出極為廣闊的發展前景。

國以農為本，農以種為先。種業的核心使命，便是培育和生產出優良種子。優良種子直接關系到農作物的生長態勢與最終收成。而種子質量，是種子生產銷售過程中的重中之重，是整個產業得以穩固發展的基石。通常而言，衡量種子質量有四大關鍵指標：種子純度、凈度、發芽率和含水量。其中，種子純度堪稱決定種子品質優劣的核心要素。高純度的種子，能確保農作物在生長過程中展現出一致的特性，無論是植株的生長形態、對病蟲害的抵抗能力，還是潛在的產量，都能保持穩定。正因如此，種子純度檢測在種子質量內控環節中占據著舉足輕重的地位，同時也是市場監管部門把控種子質量的關鍵指標，有力保障了流入市場的種子符合標準，切實維護了農民和種業的雙重利益。

松花菜 F₁ 雜交品種純度鑒定的田間檢測方法主要有種子形態鑒定、幼苗形態鑒定和田間小區種植綜合鑒定。種子形態鑒定依據種子形狀、大小、顏色與紋理等特征；幼苗形態鑒定基于葉片形態、顏色和生長習性；田間小區種植綜合鑒定通過全生育期觀測株型、花球形態、花梗顏色、成熟期等性狀，其結果準確且具有法律效力。然而，不可忽視的是，該方法存在諸多弊端。鑒定過程需要經歷從種子播種到植株成熟的完整生長周期，耗時較長，往往需要數月時間。在此期間，需要投入大量人力進行田間管理、性狀觀察記錄等工作，費工又費時。而且，由于涉及土地租賃、農資采購、人工成本等多方面開銷，費用也相對較高。此外，環境因素如溫度、光照、降水等以及人為操作的差異，都會對鑒定結果產生較大影響，鑒定者自身的觀察經驗和專業水平也在很大程度上制約著鑒定的準確性。

隨著分子技術發展，DNA分子標記鑒定成為松花菜 F₁ 雜交品種純度鑒定新手段。該技術基于核苷酸變異構建遺傳標記，具有遺傳穩定性高、重復性好、標記豐富等優勢。檢測技術涵蓋三代：第一代RFLP基于分子雜交，利用限制性內切酶與探針檢測多態性；第二代SSR、AFLP、RAPD以PCR擴增為基礎，如SSR通過簡單重復序列擴增鑒定；第三代SNP檢測技術憑借高檢測通量與精準度優勢，在作物品種鑒定領域更為廣泛應用。其SNP芯片平臺可同時檢測大量位點，KASP、Taqman等原位掃描技術及靶向測序技術，能實現樣本或位點的高通量快速檢測。該技術已成功應用于水稻、玉米、小麥等多種作物的品種純度鑒定與真偽鑒別，通過雙親重測序開發多態性引物，結合快速DNA提取與熒光定量檢測，可顯著提升檢測效率與準確性。作為國際公認的先進分子標記方法，SNP技術已被國際種子檢驗協會（ISTA）國際植物新品種保護聯盟（UPOV）、國際種子聯盟（ISF）等權威組織，推薦為DNA水平品種鑒定的標準方法[2-7]。

本試驗以花椰菜雜交種雙親的重測序數據為基礎，深入挖掘雙親之間存在差異的SNP，成功開發出2對KASP引物，采用2個SNP標記，并借助熒光檢測技術，能夠迅速且準確地區分父本、母本和雜交種。該成果可直接應用于松散型花椰菜商品種純度的鑒定工作，進而憑借分子標記對商品種的真假雜交種進行評定，有力地保護了該品種的權益。在早期利用該分子標記，能夠快速鑒定品種純度，有效降低因假雜種帶來的損失，減少潛在糾紛，大幅提高鑒定效率和準確性，為品種保護提供了堅實證據，在松花菜新品種雜交種的鑒定及品種保護中展現出重大應用價值。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料由天津科潤農業科技股份有限公司蔬菜研究所提供，研究所位于武清區天津市農業科學院創新基地的制種基地。選取3個松花菜雜交種（津松75、津松90、津松105）及其對應親本，共9份材料組成試驗材料體系。該制種基地面積約 0.2hm² 采用標準化隔離種植與水肥管理措施。種子收獲后，經晾曬干燥處理，置于溫度 4^°C 、相對濕度 30% 240% 的種子低溫庫中貯藏備用。

1.2 SNP標記引物的篩選

將松花菜基因組DNA送至北京貝瑞和康生物技術有限公司進行二代測序，對測序數據進行生物信息學分析，初步篩選出雜交種雙親間差異SNP位點，利用SNPWay（http：//www.snpway.com：8339）設計引物，送至湖南索因生物科技有限公司合成，以雙親DNA作為模板，對引物進行篩選，具體分型引物信息見表1。

1.3試驗方法

1.3.1DNA提取為確保樣本的隨機性與代表性，從收獲的商品種子中按每品種隨機抽取300粒，播撒于50穴的穴盤之中。幼苗培育在光照培養箱內進行，設置晝/夜溫度為 25^°C/18^°C ，相對濕度保持在60%～70% ，光照強度 ，光周期 16h 光照 /8h 黑暗。待幼苗生長至二葉一心期（約播種后12～14d），從每品種中隨機選取188株幼苗，精準剪取 0.1g 鮮嫩葉片置于 1.5mL 離心管內。本試驗選用CWBIO Nuclean PlantGenomic DNA Kit（200preps）提取試劑盒開展松花菜基因組DNA的提取工作。嚴格依照試劑盒說明書所規定的操作流程得到高純度的基因組DNA。提取完成后，采用 1% 瓊脂糖凝膠電泳技術對DNA質量展開檢測并調節工作液濃度，使其滿足后續PCR反應的要求。

Tab.1Primer sequences used to identify the seed purity of Loose-curd cauliflower F₁

表2PCR擴增采用的成分及用量

1.3.2PCR反應體系以經過質量檢測與濃度調節后的待測樣品基因組DNA作為模板，選用專門針對分子標記的擴增引物開展TouchdownPCR擴增試驗。擴增程序為： 94^°C，15min;95^°C，20s;56^°C～ 65^°C，60s;10 個循環，每個循環退火延伸溫度降 0.8^°C 94^9C，20s;57^°C，60s，26 個循環；PCR擴增采用的成分及用量見表2。

1.3.3松花菜雜交種的SNP純度鑒定對于每份雜交種樣本，隨機挑選188株幼苗作為檢測對象。首先，采用前文所述的試劑盒提取幼苗的基因組 DNA_c 提取完成后，將獲得的基因組DNA分別與SNP標記引物混合，進行PCR反應。PCR反應結束后，利用LGCSNP高通量基因分型檢測平臺讀取數據。該平臺具備高效、準確的特點，能夠快速對大量樣本的SNP位點進行分型檢測。依據讀取的數據，通過特定的計算公式來計算松花菜雜交種的純度。公式如下：

表1用于鑒定松花菜 F₁ 種子純度的引物序列信息

Tab.2 The composition and dosage of PCR amplification

雜交種純度 （%）= 檢測總株數-非目標雜交種株數 ×100 檢測總株數

式中，檢測總株數指用于SNP檢測的幼苗數量；非目標雜交種株數包括真雜種以外的所有雜株，涵蓋母本型雜株（基因型與母本一致的植株）父本型雜株（基因型與父本一致的植株）和其他型雜株（具有非雙親特征的異常基因型植株）。通過該公式可系統評估雜交種純度。

2結果與分析

2.1松花菜樣品基因組DNA提取質量分析

利用 1% 瓊脂糖凝膠電泳對提取的松花菜基因組DNA質量進行檢測。在凝膠成像系統下，清晰可見DNA條帶整齊、明亮，無明顯拖尾現象（圖1），這充分表明提取的基因組DNA完整性良好，無降解情況發生，并且純度較高，完全符合PCR擴增對模板質量的要求，為后續試驗的順利開展奠定了基礎。

2.2SNP基因型分析與純度鑒定結果

每個松花菜品種隨機選取188株幼苗樣品單獨提取基因組DNA作為PCR擴增模板，分別采用2個SNP標記引物，利用熒光檢測技術，結果快速地區分父本、母本和雜交種（圖2、圖3、圖4）。SNP分子檢測純度鑒定值范圍為 97.34%～98.94% ，田間形態檢測純度鑒定值范圍為 97.32%～98.28% ，兩者結果一致（表3），并且符合松花菜雜交種純度的企業銷售標準。

圖1DNA瓊脂糖電泳檢測 Fig.1 DNA agarose gel electrophoresis detection

1.津松75父本；2.津松75母本；3.津松75F；4.津松90父本； 5.津松90母本；6.津松 90F₁;7. 津松105父本；8.津松105母 本；9.津松 105F₁， 0

表33個品種的純度鑒定結果

Tab.3Seed purityidentification of 3varieties

圖2津松75引物分型結果

Fig.2 Genotyping results of primer of Jinsong 75

A.Chr4-54613788；B.Chr5-51360028;a.母本及雜交種雜株；b.父本;c.真實雜交種。

圖3津松90引物分型結果

圖4津松105引物分型結果

Fig.4Genotyping results of primer of Jinsong 105

3討論與結論

3.1 討論

花椰菜傳統分子標記技術如EST-SSR、SRAP等需依賴凝膠電泳，操作繁瑣且效率較低。王永等8利用EST-SSR標記鑒定花椰菜品種時需篩選11對引物，耗時長達數天。鐘開勤等采用SRAP標記鑒定松花55d純度，需2對引物且檢測周期超過1周。本研究采用的KASP-SNP技術僅需2組引物即可實現品種的精準鑒定，檢測時間壓縮至2h，效率提升 90% 以上。相較于InDel標記需12對引物組合的策略，KASP-SNP通過熒光信號直接分型，避免電泳人工誤差，通量更高（單次可處理384樣本），尤其適合大規模種子檢測。

在西瓜、辣椒等作物中，KASP-SNP技術已廣泛用于品種鑒定。劉欣等在西瓜中通過雙親特異性標記實現純度檢測。張濤等在辣椒中開發150個均勻分布的KASP標記。本研究與之共性在于均基于重測序開發特異性標記，但針對花椰菜自交不親和制種易父本混雜的特點，設計標記組合，如津松90檢測中雙父本標記協同驗證，較單一標記策略準確率提升 5% ，避免因重組導致的漏檢風險。

本研究中，KASP-SNP檢測純度（ 97.34%. ）98.94% ）與田間形態鑒定 （97.32%～98.28% ）高度吻合 _r≈0.904 ），并且不受環境干擾，這與林凡等研究結果有差異。原因可能與樣本量擴大及田間環境影響（如低溫導致表型異常）有關。技術適用性方面，單粒種子磁珠法提取DNA的Ct值穩定在19～24，即使DNA濃度低至 10ng?μL^-1 仍可分型，適合庫存種子等復雜場景，較傳統方法對DNA質量要求更寬松[4]。

本研究首次建立花椰菜KASP-SNP檢測模型，結合分子-表型聯合驗證體系，提升了結果法律效力。通過優化反應體系，單次檢測成本低于5元·個-，較同類技術成本降低 30% 。該技術可幫助企業實現種子快速質控，助力監管部門遏制假種流通，為品種權保護提供關鍵技術支撐。

3.2 結論

本研究成功建立了基于SNP標記的花椰菜品種鑒定與純度檢測方法，通過創新引物協同驗證機制與嚴謹的判定標準，經田間試驗驗證，該方法具備較高的準確性與可靠性。其高效、低成本、易操作的特性，為種業生產提供了快速精準的檢測方案，顯著提升了種子質量管控效率，對維護種業市場秩序具有重要意義。未來需進一步擴大樣本覆蓋范圍，全面驗證方法在不同品種中的適用性，并深人研究環境因素對檢測結果的影響，為該方法的廣泛應用提供更堅實的理論與技術支撐，推動花椰菜種業向科學化、高效化方向發展。

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