茶樹(shù)生物鐘CsLUX基因的鑒定及其對(duì)光合特性的影響

Identification of Circadian Clock CsLUX Gene and Its Effects on Photosynthetic Characteristics in Tea Plants

SUN Mengzhen'， HU Zhihang1，YANG Kaixin1， ZHANG Jiaqi1， ZHANG Nan2 XIONG Aisheng2， LIU Hui2， ZHUANG Jingl

1.MinistryofAgricultureandRuralAfairKeyLaboratoryofBologyandGermplasmEnhancementofHorticulturalCropsinEastChina TeaReseachioofiuregualeitygna;2ateKyb CropGeneticsamp;Germplasm EnhancementandUtilization，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing21oo95，China

Abstract：Tea is a cash crop with large cultivated area in China，and its growth and development mechanism are strictly regulated by genes related to biological clock. In this study， the CsLUX gene was cloned using cDNA from tea cultivar‘Longjing ₄₃， as template and sequence alignment and phylogenetic analysis were performed. Within two photoperiodic periods （ （48h） ，the relative expression of CsLUX gene was detected by RT-qPCR， and photosynthetic parameters，stomatal opening and chlorophyll contents in tea leaves were also determined.The total length of CsLUX gene is 951bp ， encoding a hydrophilic protein composed of 316 amino acids. The secondary structure is mainly composed of a -helix and random curling. CsLUX is closely related to CCA1，ELF3 and other key components of the biological clock. The variation trend of photosynthetic parameters in tea leaves at diferent time points was basically consistent with stomatal opening，and the value of chlorophyll SPAD was basically stable.The relative expression of CsLUX reached its peak under dark conditions and maintained a low expression level during the day in response to changes in circadian rhythm.The expression of CsLUX gene Was correlated with the rhythmic changes of photosynthetic parameters in two photoperiodic periods （48 h） in tea plants.

Keywords： tea plant， circadian clock， CsLUX， photosynthetic characteristics，expression analysis

茶樹(shù)[Camellia sinensis（L.）O.Kuntze]作為一種栽培范圍廣泛的葉用經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)光照條件具有獨(dú)特而顯著的適應(yīng)性特征[1]。在植物生物學(xué)領(lǐng)域，光合作用被普遍認(rèn)為是驅(qū)動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育不可或缺的核心生理機(jī)制。茶作為葉用植物，其 90%～95% 的生物產(chǎn)量來(lái)源于葉片的光合作用[2]。茶樹(shù)的光合效率不僅受其自身品種特性的影響，同時(shí)也受到外界環(huán)境條件的制約。通過(guò)測(cè)定茶樹(shù)的光合參數(shù)以及葉片氣孔開(kāi)度，可對(duì)茶樹(shù)的生產(chǎn)力和適應(yīng)性進(jìn)行評(píng)估[3]。

生物鐘和光分別作為重要的植物內(nèi)源信號(hào)和環(huán)境信號(hào)，協(xié)作調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育。生物鐘，亦被稱為晝夜節(jié)律，指的是生物體依據(jù)其所處環(huán)境的周期性變化，在生理節(jié)律、行為模式以及形態(tài)結(jié)構(gòu)上進(jìn)行周期性調(diào)整與變化，從而適應(yīng)日常或季節(jié)性的變化。生物鐘通常以24h 為1個(gè)光周期，這些晝夜節(jié)律與光周期變化同步[4]。植物在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)受到不斷變化的自然環(huán)境影響，如植物的葉片運(yùn)動(dòng)、氣孔的開(kāi)閉、光合作用、呼吸作用及開(kāi)花結(jié)實(shí)等重要生理過(guò)程都受到了生物鐘嚴(yán)格的調(diào)控[5]。生物鐘復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)植物正常生長(zhǎng)發(fā)育起到了關(guān)鍵作用。生物鐘的核心振蕩器由3個(gè)相互關(guān)聯(lián)的反饋循環(huán)組成，其中包括1個(gè)核心循環(huán)（Coreloop）和2個(gè)密切相關(guān)的循環(huán)：晨間循環(huán)（Morning loop）和晚間循環(huán)（Evening loop）[]。晚間循環(huán)主要由PRR5、PRR3、TOC1、LUX、ELF3、ELF4等蛋白調(diào)控[7]。LUX、ELF3和ELF4組成的晚間復(fù)合體（Eveningcomplex，EC）是維持晚間反饋回路中節(jié)律性振蕩的重要組成部分。LUX基因在植物光合作用中具有關(guān)鍵作用，通過(guò)調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律系統(tǒng)、控制光合相關(guān)基因的活動(dòng)以及促進(jìn)葉綠體發(fā)育，進(jìn)而優(yōu)化光能利用效率，提升植物對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)力。研究表明，該基因通過(guò)影響生物鐘機(jī)制，能夠上調(diào)CAB2等基因的表達(dá)水平，最終實(shí)現(xiàn)光合效能的顯著提升[8]。氣孔開(kāi)度受生物鐘的嚴(yán)格控制，LUX基因通過(guò)調(diào)控氣孔開(kāi)閉相關(guān)基因的表達(dá)，確保氣孔開(kāi)閉的晝夜節(jié)律性，進(jìn)而平衡CO₂ 的吸收和水分蒸騰的速率[9]。在葉綠體正常發(fā)育階段，LUX基因突變體會(huì)導(dǎo)致葉綠體發(fā)育異常，進(jìn)而降低光合效率[10]。LUX基因作為生物鐘晚間復(fù)合體的核心組分，通過(guò)夜間特異性調(diào)控PIF4的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，介導(dǎo)擬南芥下胚軸伸長(zhǎng)的光周期響應(yīng)，從而揭示生物鐘振蕩器與光信號(hào)通路協(xié)同控制植物生長(zhǎng)的分子模式[11]。

本研究針對(duì)茶樹(shù)生物鐘基因CsLUX開(kāi)展克隆和生物信息學(xué)分析，包括預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性和疏水性特性，并構(gòu)建了其進(jìn)化樹(shù)。測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)茶樹(shù)葉片的光合參數(shù)和氣孔開(kāi)度，通過(guò)RT-qPCR技術(shù)，對(duì)CsLUX基因在茶樹(shù)中的晝夜節(jié)律表達(dá)模式進(jìn)行了定量分析，為深入探討CsLUX基因在茶樹(shù)晝夜節(jié)律調(diào)控中的生物學(xué)功能提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取生長(zhǎng)一致且發(fā)育狀況良好的兩年生扦插幼苗茶樹(shù)‘龍井 43^′ 作為試驗(yàn)材料，于的植物生長(zhǎng)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度 25°C 、光照強(qiáng)度 240μmol?m^-2?s^-1 、相對(duì)濕度 （70±5）% ，光周期為 L：D=12h：12h| 光照起始時(shí)間為8：00（ZT0）、黑暗期為20：00至次日8：00]。從ZT0開(kāi)始，每隔 ^4h 取樣1次，持續(xù) 48h （各取樣時(shí)間點(diǎn)設(shè)為ZT0、ZT4、ZT8…ZT48，覆蓋2個(gè)完整光周期），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2總RNA的提取及cDNA的合成

利用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（浦迪，上海）進(jìn)行茶樹(shù)葉片中總RNA的提取，借助超微量紫外分光光度計(jì)（賽默飛，美國(guó)）和瓊脂糖凝膠電泳儀來(lái)檢測(cè)RNA濃度與質(zhì)量；使用諾唯贊公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將檢測(cè)合格的總RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。

1.3CsLUX基因的克隆

以‘龍井43’的cDNA為模板，在PrimerPremier6.0軟件中設(shè)計(jì)克隆引物CsLUX-F和CsLUX-R（表1），RT-PCR擴(kuò)增體系和程序依照TAKARA高保真聚合酶說(shuō)明書(shū)對(duì)CsLUX進(jìn)行擴(kuò)增。以諾唯贊公司瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收產(chǎn)物送至南京有康生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1克隆引物設(shè)計(jì)Table1Primerinformation

1.4生物信息學(xué)分析

借助NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）對(duì)CsLUX編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，并預(yù)測(cè)其潛在的保守結(jié)構(gòu)域；利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；通過(guò)DNAMAN7.0軟件完成氨基酸序列的多序列比對(duì)分析，以及氨基酸殘基的親水性/疏水性的綜合評(píng)估；蛋白亞細(xì)胞定位利用SoftBerryProtComp 9.0 （http：//linuxl.softberry.com/berry.phtml）網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測(cè)；依托SOPMA網(wǎng)站（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)和分析CsLUX蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在Swiss-Model網(wǎng)站（http：//www.swissmodel.expasy.org）構(gòu)建蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型；通過(guò)STRING網(wǎng)站（https：//cn.string-db.org）構(gòu)建CsLUX蛋白的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)[12]。

1.5CsLUX基因的表達(dá)分析

用SYBRPremixExTaq試劑盒（諾唯贊，南京）在CFX96TM熒光定量PCR儀上進(jìn)行CsLUX基因的表達(dá)分析。該過(guò)程以‘龍井 ₄₃? 的cDNA為模板，內(nèi)參基因?yàn)镃sGAPDH基因[13]，擴(kuò)增引物以及目標(biāo)基因 CsLUX 檢測(cè)引物見(jiàn)表1。擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，采用 法進(jìn)行相對(duì)定量結(jié)果分析[14]。使用Excel2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，借助SPSS25.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，在GraphPadPrism8.0軟件中作圖。

1.6葉片氣孔切片分析

每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取3株生長(zhǎng)狀況一致的茶苗，摘取第2片葉制作氣孔切片，氣孔切片制作過(guò)程參照指甲油印跡法；使用光學(xué)顯微鏡（Olympus，Japan）觀察氣孔切片，利用ImageJ軟件測(cè)量其長(zhǎng)度與寬度，計(jì)算氣孔開(kāi)度[15]。

1.7光合參數(shù)及葉綠素含量測(cè)定

葉片光合氣體交換參數(shù)包括凈光合速率0 P_n ）、胞間 CO₂ 濃度（ ?C_i ）、蒸騰速率（ T_r ）和氣孔導(dǎo)度（ G_s ）等，利用Li-6400便攜式光合儀（Li-COR，美國(guó)）對(duì)茶苗進(jìn)行上述指標(biāo)的測(cè)定[16]。隨機(jī)挑選3株生長(zhǎng)狀況一致的健康植株，測(cè)定其葉片光合參數(shù)。從ZT0開(kāi)始，每隔4h取樣一次，持續(xù) 48h （覆蓋兩個(gè)完整光周期），每株進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定。

在每株茶苗的中上部選取3片形態(tài)顏色正常的成熟健康葉片，擦拭干凈后，避開(kāi)葉脈，利用SPAD-502手持葉綠素儀（柯尼卡美能達(dá)，日本）進(jìn)行測(cè)定，選取的SPAD平均值作為每次測(cè)定值。重復(fù)3次取均值作為1次測(cè)定值。

2結(jié)果與分析

2.1CsLUX基因的克隆

測(cè)序結(jié)果顯示：CsLUX基因開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)為951bp，共編碼316個(gè)氨基酸，與基因組參考序列一致。該基因序列已上傳提交至GenBank，登錄號(hào)為XP_028121610.1。

2.2CsLUX進(jìn)化樹(shù)分析

為了研究CsLUX蛋白與其他物種中同源蛋白之間的進(jìn)化關(guān)聯(lián)性，分別選取擬南芥（Arabidopsisthaliana）、薪蓂（Thlaspiarvense）、君遷子（Diospyroslotus）、中華獼猴桃（Actinidiachinensisvar.chinensis）、大花四照花（Cornusflorida）、巴拉圭冬青（Ilexparaguariensis）、藍(lán)果樹(shù)（Nyssa sinensis）、圓葉葡萄（Vitisrotundifolia）、美蓮木（Malaniaoleifera）共9個(gè)物種的LUX蛋白與CsLUX蛋白共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖1）。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，CsLUX蛋白與巴拉圭冬青、薪蓂等物種的LUX蛋白聚為一類，親緣關(guān)系相近。

2.3CsLUX的氨基酸序列比對(duì)

CsLUX保守域預(yù)測(cè)分析（圖2A）顯示，在第153～206個(gè)氨基酸位點(diǎn)存在1個(gè)mybDNA-binding保守結(jié)構(gòu)域。將CsLUX氨基酸序列與擬南芥、薪蓂、君遷子、中華弼猴桃、大花四照花、巴拉圭冬青等9個(gè)物種的LUX氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果顯示，氨基酸序列的一致性高達(dá) 74.77% （圖2B）。

2.4CsLUX的理化性質(zhì)分析

CsLUX的分子質(zhì)量為 34731.80Da ，理論等電點(diǎn)為5.90，總平均疏水性為-0.654（表2）。數(shù)據(jù)分析顯示，不同物種中等電點(diǎn)、氨基酸數(shù)量、分子質(zhì)量以及各氨基酸比例均差異不大，且LUX蛋白的總平均疏水性（Grandaverageofhydropathicity）均為負(fù)值。這一結(jié)果表明，盡管來(lái)源于不同物種，LUX蛋白的理化性質(zhì)卻較為接近，且均屬于親水性蛋白質(zhì)類別。

2.5CsLUX亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)和氨基酸親/疏水 性分析

由表3可知，CsLUX蛋白主要定位在細(xì)胞核中。借助SoftBerryProtComp9.0網(wǎng)站對(duì)CsLUX蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)和分析，結(jié)果表明，CsLUX主要在細(xì)胞核內(nèi)完成其生物學(xué)功能。氨基酸親/疏水性的分析結(jié)果顯示，位于第142位的天冬酰胺（Asn）殘基是該蛋白中具有最高親水性的關(guān)鍵位點(diǎn)；同時(shí)，CsLUX蛋白中疏水性最為顯著的位點(diǎn)則是位于第171位的組氨酸（His）殘基。從整體上看，該蛋白的總平均疏水性值呈現(xiàn)為負(fù)，這一特征表明其歸類于親水性蛋白。

2.6CsLUX的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

依托SOPMA網(wǎng)站對(duì)CsLUX蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，研究結(jié)果顯示，CsLUX主要由無(wú)規(guī)則卷曲和 α -螺旋（ a -Helix）組成，其中包括60.76% 的無(wú)規(guī)則卷曲（Randomcoil）、 26.27% 的 α -Helix、 8.23% 的延伸鏈（Extendingchain）和 4.75% 的 β 轉(zhuǎn)角（ β. -Turn）。利用Swiss-Model軟件構(gòu)建CsLUX蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，研究結(jié)果顯示，茶樹(shù)CsLUX蛋白主要是由5個(gè) α? -螺旋和1個(gè) β -Turn隨機(jī)卷曲組成，預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)基本一致（圖3）。

2.7CsLUX互作預(yù)測(cè)與分析

以擬南芥AtLUX為參考，對(duì)CsLUX互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行預(yù)測(cè)性分析發(fā)現(xiàn)，CsLUX與生物鐘的關(guān)鍵元件如CCA1、ELF3、ELF4存在較高的互作概率，此外，APRR1、APRR5、APRR7、APRR9與其他蛋白也表現(xiàn)出頻繁的互作聯(lián)系，暗示這些蛋白可能在生物鐘調(diào)控過(guò)程中具有重要作用（圖4）。

2.8葉片氣孔開(kāi)度及光合參數(shù)節(jié)律性變化分析

表3CsLUX蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

表2不同植物中LUX氨基酸組成比例及理化性質(zhì)分析

Table3ThepredictionofsubcellularlocalizationofCsLUXprotein

圖3CsLUX蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)（A）和三級(jí)結(jié)構(gòu)（B）預(yù)測(cè)Fig.3Prediction of the secondary （A） and tertiary structure （B） of CsLUX

葉片是高等植物光合作用的關(guān)鍵器官，而氣孔作為葉片表皮特殊器官，其開(kāi)閉情況與茶樹(shù)光合特性密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)葉片的氣孔開(kāi)度具有晝夜節(jié)律性變化，如圖5和表4所示，ZT0時(shí)氣孔呈現(xiàn)開(kāi)放狀態(tài)；隨后ZT4～ZT12時(shí)的氣孔開(kāi)度保持穩(wěn)定，均約為 41μm²進(jìn)入ZT16～ZT20階段大多數(shù)氣孔趨于閉合，僅有少數(shù)氣孔呈開(kāi)放狀態(tài)，且氣孔開(kāi)度顯著降低，約 32.99μm² ；ZT24時(shí)氣孔逐漸重新開(kāi)啟，氣孔開(kāi)度上升至約 51.14μm² 。對(duì)比ZT0～ZT24與ZT24～ZT48兩個(gè)時(shí)間段，氣孔的開(kāi)閉趨勢(shì)呈現(xiàn)出一定的相似性。具體而言，在時(shí)間點(diǎn)ZT0、ZT24和ZT48，氣孔大多處于開(kāi)放狀態(tài)，且氣孔開(kāi)度均為約 50μm² ；相反，在ZT16～ZT20以及ZT40～ZT44兩個(gè)時(shí)間段內(nèi)，氣孔普遍處于閉合狀態(tài)，氣孔開(kāi)度下降至約 30μm² 。

P_n 、 T_r 、 G_s 、 C_i 是衡量葉片光合作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵指標(biāo)。如圖6所示，在兩個(gè)光周期內(nèi) G_s 與 P_n 的變化趨勢(shì)大致相同，兩者的峰值均出現(xiàn)在ZT4和ZT28兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)。而 P_n 在ZT4～ZT12和ZT28～ZT36兩個(gè)階段呈現(xiàn)一種平緩的下降趨勢(shì)，與此同時(shí) G_s 在ZT4～ZT16和ZT28～ZT44兩個(gè)階段的下降速度略大于 P_n C_i 濃度在ZTO、ZT4和ZT28均處于較低狀態(tài)，而在ZT16～ZT24和ZT40～ZT48兩個(gè)階段分別呈顯著下降趨勢(shì)；

T_r 變化幅度呈現(xiàn)出“W”型趨勢(shì)，具體經(jīng)歷了以下5個(gè)階段：在ZT0～ZT4內(nèi)迅速上升，ZT4～ZT20內(nèi)緩慢下降，ZT20～ZT28內(nèi)再次急劇上升，ZT28～ZT44內(nèi)又緩慢下降、最后在ZT44～ZT48內(nèi)再次急劇上升。

圖4CsLUX蛋白互作預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)

圖5茶樹(shù)葉片氣孔特征節(jié)律性變化

Fig.5Rhythmicchangesof stomatalcharacteristicsintealeaves

表4茶樹(shù)葉片氣孔開(kāi)度節(jié)律性變化

Table4Rhythmicchangesofstomatalopeningintealeaves

社；衣十雙但均為切值工你誰(shuí)決。牛同小與于母衣小牛間的向點(diǎn)左開(kāi)業(yè)有！ ± Plt;0.05 ）。 Note： The data in the table are mean ± SE.Different lowercase letters indicate significant differences at different time points （Plt;0.05）

圖6茶樹(shù)葉片光合參數(shù)的節(jié)律性變化

Fig.6Rhythmicchangesof photosynthetic parametersintea leaves

圖7茶樹(shù)葉片葉綠素SPAD值的晝夜節(jié)律變化

Fig.7RhythmicchangesofchlorophyllSPADvalueintealeaves

2.9茶樹(shù)葉片葉綠素含量分析

對(duì)茶苗葉片的葉綠素含量進(jìn)行測(cè)定，如圖7所示，在兩個(gè)光周期內(nèi)，葉綠素SPAD值的變化范圍在40～60，且基本穩(wěn)定不變。在ZT0～ZT8階段茶樹(shù)葉片的葉綠素含量位于峰值，而在ZT12時(shí)，葉綠素含量跌至谷值。在ZT28～ZT32階段葉綠素含量又維持在較高水平，此后又逐步下降。其中ZT8和ZT28時(shí)的葉綠素含量分別為ZT12時(shí)的1.46倍和1.51倍。

2.10CsLUX基因表達(dá)晝夜節(jié)律變化

為探究生物鐘基因CsLUX的表達(dá)模式及其晝夜節(jié)律性變化，使用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)‘龍井43’茶樹(shù)葉片在兩個(gè)光周期內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)CsLUX基因表達(dá)情況（圖8）。結(jié)果顯示，生物鐘基因CsLUX在兩個(gè)光周期內(nèi)呈現(xiàn)出持續(xù)表達(dá)的模式，在ZT12、ZT16、ZT36和ZT40的表達(dá)量分別為ZT0的4.86倍、4.55倍、6.95倍和7.14倍，而在ZT0、ZT20、ZT24、ZT28和ZT48的表達(dá)量普遍較低。ZT0～ZT8時(shí)該基因的表達(dá)量呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)，在ZT12時(shí)出現(xiàn)第一個(gè)峰值；ZT16～ZT20時(shí)表達(dá)量呈現(xiàn)迅速下降趨勢(shì)，ZT20出現(xiàn)第一個(gè)谷值；ZT20～ZT28階段該基因表達(dá)趨于平緩，相對(duì)表達(dá)量都比較低；而在ZT32～ZT36時(shí)表達(dá)量迅速增高，出現(xiàn)第二個(gè)峰值；ZT40～ZT44時(shí)表達(dá)量又顯著下降，迎來(lái)該基因的第二個(gè)表達(dá)量谷值；ZT44～ZT48時(shí)該基因的表達(dá)量維持穩(wěn)定低表達(dá)水平，整體表達(dá)呈節(jié)律性變化。

3討論

茶樹(shù)是一種葉用經(jīng)濟(jì)作物，光照是茶樹(shù)生長(zhǎng)過(guò)程中重要的環(huán)境因素之一，其光合利用效率直接影響茶樹(shù)鮮葉產(chǎn)量及質(zhì)量[17]。生物鐘是內(nèi)在生物節(jié)律與外界環(huán)境節(jié)律的一種重要協(xié)調(diào)機(jī)制，植物的整個(gè)生命進(jìn)程都與生物鐘基因的調(diào)控密不可分[18]。生物鐘組分能夠幫助植物感知周圍環(huán)境的晝夜節(jié)律性變化并與環(huán)境變化周期相適宜，從而增強(qiáng)植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性[19]。

LUX基因最早在擬南芥中被鑒定，隨后在豌豆（Pisumsativum）、蓮花（Nelumbonucifera）和大麥（Hordeumvulgare）等多種植物中發(fā)現(xiàn)[20]。本研究對(duì)茶樹(shù)CsLUX蛋白氨基酸理化性質(zhì)以及二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，CsLUX編碼由316個(gè)氨基酸組成的親水性蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)總體上由無(wú)規(guī)則卷曲和a -螺旋組成，與番茄（Lycopersiconesculentum）中LUX蛋白性質(zhì)相近[21]。進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)揭示了茶樹(shù)CsLUX存在1個(gè)myb DNA-binding保守結(jié)構(gòu)域，這與陸地棉（Gossypiumhirsutum）等27個(gè)植物物種中的預(yù)測(cè)結(jié)果一致[22]。互作預(yù)測(cè)顯示CsLUX與ELF3、ELF4直接互作，這與擬南芥晚間復(fù)合物EC（ELF3-ELF4-LUX）的作用模式一致。該復(fù)合物通過(guò)耦合下胚軸生長(zhǎng)與晝夜節(jié)律調(diào)控光周期響應(yīng)[11]，提示CsLUX可能在不同物種中保守參與EC介導(dǎo)的生理過(guò)程。

圖8CsLUX基因表達(dá)的晝夜節(jié)律性Fig.8 Circadian rhythmof CsLUX gene expression

綠色植物的生長(zhǎng)與發(fā)育依賴于光合作用，同時(shí)農(nóng)作物的產(chǎn)量也依托于光合強(qiáng)弱[23]。葉綠素是植物進(jìn)行光合作用過(guò)程中起到重要作用一類綠色色素，其含量對(duì)植物的光合效率有很大的影響[24-25]。研究發(fā)現(xiàn)，在兩個(gè)光周期內(nèi)，茶樹(shù)葉綠素SPAD值的變化范圍在40～60，且基本穩(wěn)定不變，表明葉綠素含量在短期內(nèi)受光周期影響較小。本研究對(duì)4個(gè)光合參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，茶樹(shù)‘龍井43’在白天 P_n 、 G_s 、 T_r 的數(shù)值明顯高于夜間，而 C_i 則相反。與此同時(shí)，CsLUX基因表達(dá)呈現(xiàn)與光合參數(shù)相反的晝夜節(jié)律模式，暗示其可能通過(guò)生物鐘調(diào)控光合進(jìn)程。這一發(fā)現(xiàn)與油茶研究中氣孔導(dǎo)度與凈光合速率正向相關(guān)的結(jié)論相呼應(yīng)[26]，且本研究發(fā)現(xiàn)氣孔開(kāi)度與 P_n 、 G_s 、 T_r 晝夜波動(dòng)同步，而CsLUX表達(dá)峰谷與氣孔運(yùn)動(dòng)呈鏡像關(guān)系，提示該基因可能通過(guò)調(diào)控氣孔開(kāi)閉節(jié)律影響光合特性。進(jìn)一步支持這一機(jī)制的是跨物種證據(jù)：擬南芥EC復(fù)合物中的LUX蛋白已被證實(shí)調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因[8-9]，而大豆lux突變體因生物鐘失調(diào)導(dǎo)致光周期響應(yīng)異常[27]。這些發(fā)現(xiàn)表明，LUX基因可能通過(guò)協(xié)調(diào)氣孔運(yùn)動(dòng)與光合基因表達(dá)，整合生物鐘信號(hào)與光合作用相關(guān)通路，進(jìn)而優(yōu)化光能利用效率。

在 的光周期下，LUX基因在茶樹(shù)中的表達(dá)呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性，其表達(dá)水平在光照和黑暗條件下呈現(xiàn)周期性波動(dòng)，這與生物鐘的核心功能一致[28]。在兩個(gè)光周期內(nèi)對(duì)CsLUX基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果表明，CsLUX基因在ZT0～ZT12和ZT24～ZT36兩個(gè)時(shí)間段內(nèi)呈上升趨勢(shì)，分別在ZT12和ZT40達(dá)到峰值；在ZT16～ZT24和ZT40～ZT48兩個(gè)時(shí)間段內(nèi)呈下降趨勢(shì)，在ZT20～ZT28階段該基因表達(dá)趨于平緩，相對(duì)表達(dá)量都較低。對(duì)蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）晝夜表達(dá)模式的研究顯示，MtLUX基因的表達(dá)量表現(xiàn)出較強(qiáng)的節(jié)律振蕩模式，在夜間達(dá)到峰值，在黎明時(shí)出現(xiàn)低谷，與本研究CsLUX基因的表達(dá)趨勢(shì)一致[29]。

本研究成功克隆了CsLUX基因，并對(duì)該基因在茶樹(shù)晝夜節(jié)律過(guò)程中的響應(yīng)模式進(jìn)行分析。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)對(duì)茶樹(shù)光合特性產(chǎn)生特定影響，具體表現(xiàn)在CsLUX基因在兩個(gè)光周期內(nèi)的表達(dá)量與光合參數(shù)的節(jié)律性變化呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。然而，CsLUX基因在茶樹(shù)中的具體作用機(jī)制及其對(duì)光合作用的調(diào)控作用仍需進(jìn)一步研究。未來(lái)的工作將集中在CsLUX基因的功能驗(yàn)證及其在茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育中的作用機(jī)制上。

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