重樓全長轉錄組測序及生物信息學分析

Full-length transcriptome sequencing and bioinformatics analysis of Paris

XU Ping'，ZHANG Xuan’，YU Mengwen1，XU Honggao1，TU Zhenhua’，ZHANG Xiaoye'

ZHANG Jie'， OU Zhenggang2， CHEN Jia3， ZHENG Guowei1

Abstract：The purpose of this study is to lay a foundation for the systematic exploration of saponin synthesis genesin Paris byobtaining the full-length transcriptome data of Paris. The third-generation sequencing technologyon PacBio Sequel platform was used.In this study，the rhizome mixed samples of Paris polyphylla Smithvar.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.，Paris fargesiiFranch.andParisforrestii（Takht.）H.Liwith significantdifferences in saponin content were deeply sequenced，and then the obtained data were comprehensivelyanalyzedbybioinformatics.A total of42771 transcriptswereobtained，of which40945（ 95.73% ）were successfully matched to seven functional databases，namely KEGG，NR，Swiss-Prot，TrEMBL，KOG，GOand Pfam.Through enrichmentanalysisofKEGG pathway，48genesrelatedtocholesterol synthesis were successullyidentified，andtwokindsofkey enzyme genes involved insaponin modification were specifically screened：12O cytochrome P45O enzyme genes and 53 UDP-glucosyltransferasegenes.Additionaly，2327transcriptionfactorsweredetected，belonging to71transcriptionfactor families.Atotalof27451microsatelitesequences（SSR）werefoundbyMISAanalysis，therewerethemostcoincident types with overlapping SSR，accounting for 32.88% of all repeat types.With the help of high-throughput full-length transcriptome sequencing technology，thetranscriptomeof rhizome tisueof Pariswassystematicallyanalyzed，and thecandidategens andregulatoryelements closelyrelated tosaponinsynthesis weresuccessfully excavated.Thesefindings laythe groundwork for further study onthe molecular mechanism of saponin biosynthesis in Paris.

Key words： Paris；full-length transcriptome；function annotation；saponin

重樓屬（ParisL.）植物為藜蘆科（Melanthiace-ae）多年生草本植物。目前，中國有30種重樓屬植物，占全球所有重樓屬植物的 81%^[1] ，其中云南重樓[Paris polyphylla Smith var. yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.]和七葉一枝花[ P ：polyphylla Smith var.chinensis（Franch.）Hara]收載于2020年版《中國藥典》，作為藥用重樓的2種基原植物2；球藥隔重樓（P.fargesiiFranch.）則收載于《四川省藏藥材標準》（2014年版）[3]。研究發現，長柱重樓［P.forrestii（Takht.）H.Li]和云南重樓、七葉一枝花具有相似的治療功效[4]。因此，隨著重樓藥材資源的減少，在民間長柱重樓常作為重樓藥材的替代品入藥。重樓除了具有清熱解毒、消腫止痛以及涼肝定驚的功效外[5]，還具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤等藥理活性[。甾體皂苷（重樓皂苷）為重樓的主要活性成分，約占總活性化合物的 80%^[7] 。重樓皂苷主要分為薯皂苷類和偏諾皂昔類，其中薯皂昔類包括重樓皂苷I、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅲ、重樓皂苷V和纖細薯皂苷，偏諾皂苷類包括重樓皂苷V、重樓皂苷VII、重樓皂苷 H^[7] 。在不同重樓屬植物中，皂苷的含量具有差異，云南重樓和長柱重樓主要含薯皂苷類，球藥隔重樓主要含偏諾皂苷類[8]。目前，從延齡草苷和偏諾皂苷-3-0-葡萄糖苷合成重樓皂苷V和重樓皂昔V的途徑已經得到了清晰的闡述，但其余皂昔的合成通路仍在探索中，轉錄組測序對于找到重樓皂昔合成的關鍵基因具有重要的意義。

二代測序技術是轉錄組研究的主要方法，具有高通量、高靈敏度、應用范圍廣等優勢[10]，然而其讀取的DNA片段的長度較短，在轉錄本異構體的組裝過程中存在較多的嵌合體錯誤，容易丟失可變剪切等重要信息，對后續的轉錄組數據分析造成影響[]。隨著三代單分子測序技術的興起和應用，以PacBio為代表的三代全長轉錄組測序可以實現無需組裝即可獲得高質量的單個全長轉錄本序列，可以更真實地反映測序物種的轉錄組信息[12]。目前，全長轉錄組測序已廣泛應用于藥用植物有效成分合成相關基因的篩選中，如利用PacBio測序技術在艾（Artemisiaargyi）中篩選到了12種與萜類化合物生物合成相關的候選基因[13];地黃（Rehmannia gluti-nosa）的全長轉錄組測序結果顯示有14種酶被注釋到毛蕊花糖苷的合成途徑中[14]；通過對滇黃精（ Po. lygonatumkingianum）進行全長轉錄組測序篩選到6個與多糖合成相關的INV基因[15]；利用牛津納米孔技術獲得了甘青蒿（Artemisiatangutica）全長轉錄組數據，并篩選到9個與萜類化合物生物合成相關的候選基因[16]； Xu 等[17]利用PacBio iso-seq 和DNB-seq對毛茛（Ranunculusjaponicus）進行全長轉錄組測序，篩選出9種類黃酮生物合成關鍵酶以及22種參與類黃酮和苯丙烷生物合成的MYB轉錄因子。本研究擬利用不同重樓屬植物皂苷種類不同這一特點，對3種重樓屬植物進行全長轉錄組測序，以便更好地發掘可能與重樓皂苷合成相關的基因，為重樓皂昔的體外合成提供一定的科學依據。

1材料與方法

1.1 試驗材料

從騰沖（ 23.92°N，102.41°E，2 110.9m） 、臨滄（24.64^°N，99.76^°E，1671.8m） 、文山（ 23.00^°N 104.00^°E，1360.0m） 、紅河（ 23.93^°N ， 102.41^°E ，2 130.3m 以及怒江（ 27.71^°N，98.72^°E，2216.4m） 種植基地分別采集3種皂苷含量（高、中、低）的云南重樓［Paris polyphylla Smith var. yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.]、球藥隔重樓（P.fargesiiFranch.）和長柱重樓[P.forresti（Takht.）H.Li]（圖1），根莖洗凈，切片后立即放入液氮中速凍，儲存于-80^°C 冰箱中備用。

圖1不同種重樓表型Fig.1Phenotypesofdifferent speciesofParis

1：低皂苷含量云南重樓；2：中等皂昔含量云南重樓；3：高皂昔含量云南重樓。

1.2 RNA的提取

參照試劑盒說明書，分別提取各樣品總RNA，使用Agilent2100系統（美國加利福尼亞州安捷倫科技公司產品）和QubitRNA檢測試劑盒（美國加利福尼亞州生命技術公司產品）評估RNA的完整性和濃度。取適量每個樣品的高質量RNA，將這些RNA樣本合并，形成一個RNA混合樣本，用于全長轉錄組測序。

1.3文庫構建和全長轉錄組測序

使用SMARTerPCRcDNASynthesisKit試劑盒從純化的總RNA中合成全長cDNA，并通過PCR擴增以獲得更多的雙鏈cDNA模板。使用AMPureXP系統純化PCR產物，并在AgilentBioanalyzer2100系統上評估SMRTbell文庫質量，隨后使用PacBio測序儀進行全長轉錄組測序。

1.4 SMRT測序及數據處理

使用SMRTlink軟件對所得下機數據進行分析，基于同一聚合酶讀長拆分得到的子讀長，經過自我糾錯形成一個環形共識序列（CCS）。根據序列是否包含 5^′ 端引物 ?3^′ 端引物、polyA尾來確定是否為全長非嵌合（FLNC）序列。通過FLNC聚類去余分析，得到一致性轉錄本序列，隨后利用arrow算法對一致性序列進行校正，以獲得高質量的共識序列[18]，利用CD-HIT軟件進行聚類去冗余，得到最終全長轉錄本序列。

1.5編碼序列預測和基因功能注釋

使用TransDecoder對去冗余后得到的轉錄本進行編碼序列（CDS）預測，得到和已知蛋白質庫有同源性的編碼框以及可信度最高的蛋白質編碼框。使用Diamond軟件將去冗余后的單基因序列與數據庫KEGG、NR、Swiss-Prot、TrEMBL、KOG、GO、Pfam比對，進行功能注釋。

1.6長鏈非編碼RNA預測

對上述7大數據庫（KEGG、NR、Swiss-Prot、TrEMBL、KOG、GO、Pfam）均未注釋到的轉錄本，使用編碼潛能預測軟件CNCI[20]、CPC2[21]、PLEK[22]進行編碼潛能預測，將3個軟件（CNCI、CPC2及PLEK）一致預測為非編碼（Non-coding）的序列視為潛在的長鏈非編碼RNA（LncRNA）。

1.7微衛星序列和轉錄因子的鑒定

使用MISA軟件[23]鑒定轉錄本中的微衛星序列（SSR），并使用Shi等[24]描述的方法分析重復基序類型的特征。基于轉錄因子（TF）家族的Pfam搜索結果，使用hmmscan比對方式鑒定轉錄因子。

1.8 重樓皂苷合成基因的挖掘

依據前期關于重樓皂昔生物合成途徑的研究報道[9，25]，從基因功能注釋KEGG途徑中篩選2個與重樓皂苷合成密切相關的候選代謝通路（甾體生物合成途徑、萜類骨架生物合成途徑）[26-27]，從候選途徑中查找相關酶，再根據酶查找酶的相應基因，其中合成膽固醇的上游基因[28-29]包括：GPPs、FPPs、SQE，CAS，SMT，SMO，CPII.CYP5IG，CI4-R，δ，7SI 和CD-SD，從膽固醇到重樓皂苷主要由細胞色素P450酶基因（CYPs）和UDP-糖基轉移酶基因（UGTs）催化[30]

2 結果與分析

2.1PacBio單分子實時測序數據分析

采用PacBioSMRT測序技術共獲得了92.11Gb數據。去除低質量序列和接頭序列后，得到26 043008個子讀長，平均長度為 3465bp （表1）。為了提供更準確和可靠的序列，序列進行自我糾錯后獲得639807個CCS，平均長度為3791bp，通過篩選最終得到了578320個具有polyA的FLNC序列，聚類去除冗余和序列校正后，共獲得51109個共識序列。利用CD-HIT軟件去冗余后得到42771個最終全長轉錄本，用于進一步功能注釋，長度范圍為118～12195bp，N50（N50 指將所有序列按長度從長到短排序后，累加長度達到總序列長度一半時，所對應的序列長度）為 4 073bp ，平均轉錄本長度為3660bp（表1）， 18.74% 的轉錄本長度小于 2500bp 55.82% 的轉錄本長度為2 ÷500～4500bp （圖2）。

表1重樓PacBioSMRT測序結果 Table1 Summary of PacBio SMRT sequencing of Paris

N50指將所有序列按長度從長到短排序后，累加長度達到總序列長度一半時，所對應的序列長度。

圖2同源異構體長度分布Fig.2Isoform size distribution

2.2轉錄本功能注釋

在42771個轉錄本中，有40945（ 95.73% 個轉錄本成功比對到KEGG、NR、Swiss-Prot、TrEMBL、KOG、GO和Pfam數據庫并進行了注釋。分別注釋了35021個、40488個、32834個、40525個、29603個、36425個、34927個轉錄本（表2）。

表2數據庫注釋結果統計

Table2 Statisticsofdatabaseannotationresults

GO分析結果顯示，36425個單基因被聚類為44個GO項，圖3列出了32項，其中 72.88% （26548個）的單基因富集在細胞過程中， 82.49% （30047個）富集在細胞解剖實體中， 67.50% （24587個）富集于結合中。

KOG注釋結果顯示比對為“一般功能預測”的重樓轉錄本最多（8837個），其次為“信號轉導機制”，轉錄本最少的為“細胞運動”，僅35個轉錄本（圖4）。

KEGG富集分析將35021個高質量轉錄本分為144個信號通路，涉及5個類別：代謝、有機系統、遺傳信息處理、環境信息處理和細胞過程，其中次生代謝物的生物合成、淀粉和蔗糖代謝顯著富集（圖5）。

1：細胞過程；2：代謝過程;3：生物調節;4：刺激影響;5：生物過程調節;6：發育過程；7：多細胞生物過程;8：定位；9：生殖；10：生殖過程；11：信號;12：生物過程負調節;13：種間相互作用;14;生物過程正調節;15：生長;16;細胞解剖實體;17：含蛋白質的復合物;18：結合；19：催化活性;20：ATP（腺嘌呤核苷三磷酸）依賴的活動催化活性;21：轉運活性;22：轉錄調節活性;23：結構分子活性;24：分子功能調節劑活性；25：翻譯調節活性;26：分子傳感器活性;27：小分子傳感器活性;28：分子接頭活性;29：細胞骨架運動活性;30：分子載體活性;31：蛋白質折疊伴侶；32：抗氧化活性。

圖3GO注釋結果 Fig.3GO annotation results

圖4KOG注釋結果 Fig.4 KOG annotation results

A：RNA 處理和修飾;B：染色體結構與動態;C：能量生產和轉換;D：細胞周期控制、細胞分裂、染色體分割;E：氨基酸運輸和代謝;F：核苷酸轉運和代謝;G：碳水化合物運輸和代謝;H：輔酶運輸和代謝;I：脂質運輸和代謝;J：翻譯、核糖體結構和生物合成;K：轉錄;L：復制、重組和修復;M：細胞壁/膜/胞膜生物發生;N：細胞運動;O：翻譯后修飾、蛋白質周轉、分子伴侶;P：無機離子轉運和代謝;Q：次級代謝物生物合成、轉運和分解代謝;R：一般功能預測;S：未知功能;T：信號轉導機制;U：細胞內運輸、分泌和囊泡轉運;V：防御機制;W：細胞外結構；X：核結構;Y：細胞骨架。

NR注釋結果（圖6顯示，與重樓全長轉錄組基因序列匹配度最高的基因主要來源于海棗1 24.45% ）、油棕（ 24.29% ）和椰子 （6.94% ）。

2.3 LncRNA預測結果

LncRNA指長度大于200核苷酸（nt）的非編碼RNA，在轉錄、剪接和翻譯過程中發揮重要作用[31]使用CNCI、CPC2和PLEK軟件進行潛能編碼預測，分別預測出952個1449個和781個LncRNA。在3種預測方法中，1637個LncRNA中僅有340個為3個軟件共同預測到的LncRNA（圖7）。

2.4轉錄因子檢測

本研究共鑒定了2327個轉錄因子（TF），分為71個家族，其中SNF2（281個）、FAR1（144個）和SET（131個）家族數量最多，另外MYB、AP2/ERF、bHLH、WRKY和bZIP等轉錄因子可能參與了甾體皂苷的合成[26.32]，在本研究中分別鑒定了58個MYB、19個AP2/ERF、24個bHLH、16個WRKY和32個bZIP轉錄因子（圖8）。

2.5 SSR檢測

使用MISA工具共鑒定出27451個SSR，其中單堿基重復7899個（ 28.77% ），2個堿基重復5372個（ 19.57% ），3個堿基重復3314個（ 12.07% ），4個堿基重復最少，僅占 0.16% （45個）（表3）。

對所有SSR位點的統計分析結果表明， A/T 的單核苷酸重復基序數量最多，占所有單核苷酸重復基序數量的 87.26% （12829個），而C/G僅占12. 74% （1873個）（圖9a）。在二核苷酸重復基序中，AG/CT的二核苷酸重復基序最多（11556個，63.81% ），其次是AA/TT（4434個， 24.49% ），而CG/CG最少，僅占 0.14% （25個）（圖9b）。

圖5KEGG注釋結果 Fig.5KEGG annotation results

MAPK：絲裂原活化蛋白激酶;ABC：三磷酸腺苷結合盒式蛋白。

圖6NR注釋結果 Fig.6NRannotation results

圖7長鏈非編碼RNA（LncRNA）預測結果Fig.7Prediction results of long non-coding RNA（LncRNA）

表3微衛星序列（SSR）的統計分析 Table3Statisticalanalysisof microsatellitesequences（SSRs）

c為復雜重復類型；c*為SSR之間有重疊的復合類型；p1為單堿基 重復；p2為2個堿基重復；p3為3個堿基重復； p4 為4個堿基重復； p5為5個堿基重復;p6為6個堿基重復。

2.6重樓皂苷合成途徑相關酶及其相應基因的挖掘

重樓屬植物的主要活性成分為甾體皂昔，這些復雜的化合物來源于植物體內的萜類化合物[33]。通過KEGG代謝通路分析發現，73個轉錄本參與了留體生物合成途徑，75個轉錄本參與了萜類骨架生物合成（圖5），進一步分析發現，其中包含了48個與膽固醇合成相關的基因（表4），除此之外還篩選到了120個CYPs基因以及53個UGTs基因（表4）。

3討論

重樓屬植物在民間被廣泛用于治療療瘡癰腫、蛇蟲咬傷以及驚風抽搐等[]，其主要活性成分為重樓皂苷，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等藥理作用[34]重樓皂苷主要通過甲羥戊酸（MVA）途徑和2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸（MEP）途徑合成前體物質[33]，再由一系列細胞色素P450酶對前體分子結構進行特定位置的羥基化修飾，最終在糖基轉移酶的催化下生成各類重樓皂苷[35]，但重樓皂苷的具體合成通路仍在探索中。鑒于重樓屬植物體內所含重樓皂昔的種類與含量呈現出顯著的種間差異[8]，故從這些具有特定皂苷組成特征的植物中系統地挖掘和鑒定與重樓皂苷生物合成相關的基因，以實現更為精確的目標基因識別，并優化合成路徑，為提升藥用植物品質及發現新藥源提供科學支撐。采用轉錄組測序可以有效地預測藥用植物的關鍵基因[36]。本研究通過對富含重樓皂苷1和重樓皂苷Ⅱ的云南重樓、富含重樓皂苷Ⅱ的長柱重樓和富含重樓皂苷V、重樓皂苷VII、重樓皂苷H的球藥隔重樓[8根莖混合樣品進行全長轉錄組測序，對序列信息進行分析。通過測序共獲得了42771個轉錄本，比Hua等[30]所測得的轉錄本數量多2896個，進一步證明以不同重樓屬植物作為試驗材料，有利于篩選與重樓皂昔合成相關的基因。其中， 95.73% 的轉錄本成功比對到7大數據庫并進行了注釋，通過KEGG富集通路篩選到48個與膽固醇合成相關的基因，同時還分別篩選到了120個CYPs基因以及53個UGTs基因，對這些與功能相關的基因進行深入的差異表達分析，不僅能夠為解析重樓植物次生代謝產物的合成途徑、積累動態及調控機理提供關鍵的理論依據，同時也有助于為將來針對重樓甾體皂苷類化合物生物合成相關基因的定向克隆工作儲備有價值的候選基因。

圖9單核苷酸和二核苷酸重復基序的類型和數量

Fig.9Thetypesand numbersofmononucleotideand dinucleotiderepeatmotifs

表4重樓皂苷合成途徑相關酶及其相應基因

Table 4Enzymes and corresponding genes involved in saponin biosynthetic pathways in Paris

轉錄因子在調節植物次生代謝產物積累、生理代謝和脅迫方面發揮著重要作用[37]。迄今，已在MYB、WRKY、bHLH、bZIP和AP2/ERF轉錄因子家族中發現了多種具有重要功能的轉錄因子成員[38]據推測，這些轉錄因子通過參與調控植物體內生物合成基因的表達來調節這些特殊代謝物的生物合成[39]，部分轉錄因子被認為與萜類和甾體化合物合成有關[40-43]。在本研究中共鑒定了2327個轉錄因子，分別屬于71個家族，其中包含58個MYB、19個AP2/ERF、24個bHLH、16個WRKY和32個bZIP。

綜上，本研究通過重樓全長轉錄組測序及生物信息學分析，充實了重樓基因信息，為解析重樓活性成分代謝調控及關鍵基因篩選提供了重要參考。

4結論

通過對重樓樣本進行全長轉錄組測序并進行數據分析，成功獲取了42771個去冗余后的獨立轉錄本序列。其中40945個轉錄本成功比對至包括KEGG在內的7大生物信息學數據庫，并完成了注釋。這些單基因在細胞解剖實體、一般功能預測和次生代謝物的生物合成中占據較高比例。在NR數據庫中，重樓與海棗和油棕的基因序列匹配度最高。本研究還預測識別出了27451個微衛星序列（SSR），揭示了豐富的遺傳變異信息源；同時鑒定出1637個潛在的長鏈非編碼RNA（LncRNA），以及2327個可能參與調控基因表達的轉錄因子。篩選了149個與重樓皂苷合成相關的關鍵候選轉錄因子，鑒定了與膽固醇合成直接相關的基因48個，以及120個細胞色素P450酶基因和53個UDP-糖基轉移酶基因。以上結果極大地拓寬了重樓的公共轉錄組數據庫，并為鑒定參與重樓皂苷和其他次生代謝產物生物合成的候選基因提供了寶貴的資源。

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（責任編輯：陳海霞）

收稿日期：2024-09-04

基金項目：國家自然科學基金地區科學基金項目（82160718）；云南省科技廳基礎研究專項面上項目（202301AT070257）；云南省興滇英才支持計劃青年人才專項（YNWR-QNBJ-2020-257、XDYC-QNRC-2022-0277）；云南省中醫藥基礎研究聯合專項（202101AZ070001-057）

作者簡介：徐萍（2000-），女，云南昭通人，碩士研究生，研究方向為中藥材有效成分積累機制。（E-mail）2633822198@qq.com

通訊作者：陳佳，（E-mail）394626580@qq.com;鄭國偉，（E-mail）gwzhengkm@163.com