重樓全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析

Full-length transcriptome sequencing and bioinformatics analysis of Paris

XU Ping'，ZHANG Xuan’，YU Mengwen1，XU Honggao1，TU Zhenhua’，ZHANG Xiaoye'

ZHANG Jie'， OU Zhenggang2， CHEN Jia3， ZHENG Guowei1

Abstract：The purpose of this study is to lay a foundation for the systematic exploration of saponin synthesis genesin Paris byobtaining the full-length transcriptome data of Paris. The third-generation sequencing technologyon PacBio Sequel platform was used.In this study，the rhizome mixed samples of Paris polyphylla Smithvar.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.，Paris fargesiiFranch.andParisforrestii（Takht.）H.Liwith significantdifferences in saponin content were deeply sequenced，and then the obtained data were comprehensivelyanalyzedbybioinformatics.A total of42771 transcriptswereobtained，of which40945（ 95.73% ）were successfully matched to seven functional databases，namely KEGG，NR，Swiss-Prot，TrEMBL，KOG，GOand Pfam.Through enrichmentanalysisofKEGG pathway，48genesrelatedtocholesterol synthesis were successullyidentified，andtwokindsofkey enzyme genes involved insaponin modification were specifically screened：12O cytochrome P45O enzyme genes and 53 UDP-glucosyltransferasegenes.Additionaly，2327transcriptionfactorsweredetected，belonging to71transcriptionfactor families.Atotalof27451microsatelitesequences（SSR）werefoundbyMISAanalysis，therewerethemostcoincident types with overlapping SSR，accounting for 32.88% of all repeat types.With the help of high-throughput full-length transcriptome sequencing technology，thetranscriptomeof rhizome tisueof Pariswassystematicallyanalyzed，and thecandidategens andregulatoryelements closelyrelated tosaponinsynthesis weresuccessfully excavated.Thesefindings laythe groundwork for further study onthe molecular mechanism of saponin biosynthesis in Paris.

Key words： Paris；full-length transcriptome；function annotation；saponin

重樓屬（ParisL.）植物為藜蘆科（Melanthiace-ae）多年生草本植物。目前，中國(guó)有30種重樓屬植物，占全球所有重樓屬植物的 81%^[1] ，其中云南重樓[Paris polyphylla Smith var. yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.]和七葉一枝花[ P ：polyphylla Smith var.chinensis（Franch.）Hara]收載于2020年版《中國(guó)藥典》，作為藥用重樓的2種基原植物2；球藥隔重樓（P.fargesiiFranch.）則收載于《四川省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2014年版）[3]。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)柱重樓［P.forrestii（Takht.）H.Li]和云南重樓、七葉一枝花具有相似的治療功效[4]。因此，隨著重樓藥材資源的減少，在民間長(zhǎng)柱重樓常作為重樓藥材的替代品入藥。重樓除了具有清熱解毒、消腫止痛以及涼肝定驚的功效外[5]，還具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤等藥理活性[。甾體皂苷（重樓皂苷）為重樓的主要活性成分，約占總活性化合物的 80%^[7] 。重樓皂苷主要分為薯皂苷類和偏諾皂昔類，其中薯皂昔類包括重樓皂苷I、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅲ、重樓皂苷V和纖細(xì)薯皂苷，偏諾皂苷類包括重樓皂苷V、重樓皂苷VII、重樓皂苷 H^[7] 。在不同重樓屬植物中，皂苷的含量具有差異，云南重樓和長(zhǎng)柱重樓主要含薯皂苷類，球藥隔重樓主要含偏諾皂苷類[8]。目前，從延齡草苷和偏諾皂苷-3-0-葡萄糖苷合成重樓皂苷V和重樓皂昔V的途徑已經(jīng)得到了清晰的闡述，但其余皂昔的合成通路仍在探索中，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)τ谡业街貥窃砦艉铣傻年P(guān)鍵基因具有重要的意義。

二代測(cè)序技術(shù)是轉(zhuǎn)錄組研究的主要方法，具有高通量、高靈敏度、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)勢(shì)[10]，然而其讀取的DNA片段的長(zhǎng)度較短，在轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體的組裝過程中存在較多的嵌合體錯(cuò)誤，容易丟失可變剪切等重要信息，對(duì)后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析造成影響[]。隨著三代單分子測(cè)序技術(shù)的興起和應(yīng)用，以PacBio為代表的三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以實(shí)現(xiàn)無需組裝即可獲得高質(zhì)量的單個(gè)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本序列，可以更真實(shí)地反映測(cè)序物種的轉(zhuǎn)錄組信息[12]。目前，全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序已廣泛應(yīng)用于藥用植物有效成分合成相關(guān)基因的篩選中，如利用PacBio測(cè)序技術(shù)在艾（Artemisiaargyi）中篩選到了12種與萜類化合物生物合成相關(guān)的候選基因[13];地黃（Rehmannia gluti-nosa）的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示有14種酶被注釋到毛蕊花糖苷的合成途徑中[14]；通過對(duì)滇黃精（ Po. lygonatumkingianum）進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選到6個(gè)與多糖合成相關(guān)的INV基因[15]；利用牛津納米孔技術(shù)獲得了甘青蒿（Artemisiatangutica）全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并篩選到9個(gè)與萜類化合物生物合成相關(guān)的候選基因[16]； Xu 等[17]利用PacBio iso-seq 和DNB-seq對(duì)毛茛（Ranunculusjaponicus）進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選出9種類黃酮生物合成關(guān)鍵酶以及22種參與類黃酮和苯丙烷生物合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子。本研究擬利用不同重樓屬植物皂苷種類不同這一特點(diǎn)，對(duì)3種重樓屬植物進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，以便更好地發(fā)掘可能與重樓皂苷合成相關(guān)的基因，為重樓皂昔的體外合成提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從騰沖（ 23.92°N，102.41°E，2 110.9m） 、臨滄（24.64^°N，99.76^°E，1671.8m） 、文山（ 23.00^°N 104.00^°E，1360.0m） 、紅河（ 23.93^°N ， 102.41^°E ，2 130.3m 以及怒江（ 27.71^°N，98.72^°E，2216.4m） 種植基地分別采集3種皂苷含量（高、中、低）的云南重樓［Paris polyphylla Smith var. yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.]、球藥隔重樓（P.fargesiiFranch.）和長(zhǎng)柱重樓[P.forresti（Takht.）H.Li]（圖1），根莖洗凈，切片后立即放入液氮中速凍，儲(chǔ)存于-80^°C 冰箱中備用。

圖1不同種重樓表型Fig.1Phenotypesofdifferent speciesofParis

1：低皂苷含量云南重樓；2：中等皂昔含量云南重樓；3：高皂昔含量云南重樓。

1.2 RNA的提取

參照試劑盒說明書，分別提取各樣品總RNA，使用Agilent2100系統(tǒng)（美國(guó)加利福尼亞州安捷倫科技公司產(chǎn)品）和QubitRNA檢測(cè)試劑盒（美國(guó)加利福尼亞州生命技術(shù)公司產(chǎn)品）評(píng)估RNA的完整性和濃度。取適量每個(gè)樣品的高質(zhì)量RNA，將這些RNA樣本合并，形成一個(gè)RNA混合樣本，用于全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3文庫(kù)構(gòu)建和全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

使用SMARTerPCRcDNASynthesisKit試劑盒從純化的總RNA中合成全長(zhǎng)cDNA，并通過PCR擴(kuò)增以獲得更多的雙鏈cDNA模板。使用AMPureXP系統(tǒng)純化PCR產(chǎn)物，并在AgilentBioanalyzer2100系統(tǒng)上評(píng)估SMRTbell文庫(kù)質(zhì)量，隨后使用PacBio測(cè)序儀進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.4 SMRT測(cè)序及數(shù)據(jù)處理

使用SMRTlink軟件對(duì)所得下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，基于同一聚合酶讀長(zhǎng)拆分得到的子讀長(zhǎng)，經(jīng)過自我糾錯(cuò)形成一個(gè)環(huán)形共識(shí)序列（CCS）。根據(jù)序列是否包含 5^′ 端引物 ?3^′ 端引物、polyA尾來確定是否為全長(zhǎng)非嵌合（FLNC）序列。通過FLNC聚類去余分析，得到一致性轉(zhuǎn)錄本序列，隨后利用arrow算法對(duì)一致性序列進(jìn)行校正，以獲得高質(zhì)量的共識(shí)序列[18]，利用CD-HIT軟件進(jìn)行聚類去冗余，得到最終全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本序列。

1.5編碼序列預(yù)測(cè)和基因功能注釋

使用TransDecoder對(duì)去冗余后得到的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行編碼序列（CDS）預(yù)測(cè)，得到和已知蛋白質(zhì)庫(kù)有同源性的編碼框以及可信度最高的蛋白質(zhì)編碼框。使用Diamond軟件將去冗余后的單基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)KEGG、NR、Swiss-Prot、TrEMBL、KOG、GO、Pfam比對(duì)，進(jìn)行功能注釋。

1.6長(zhǎng)鏈非編碼RNA預(yù)測(cè)

對(duì)上述7大數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG、NR、Swiss-Prot、TrEMBL、KOG、GO、Pfam）均未注釋到的轉(zhuǎn)錄本，使用編碼潛能預(yù)測(cè)軟件CNCI[20]、CPC2[21]、PLEK[22]進(jìn)行編碼潛能預(yù)測(cè)，將3個(gè)軟件（CNCI、CPC2及PLEK）一致預(yù)測(cè)為非編碼（Non-coding）的序列視為潛在的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）。

1.7微衛(wèi)星序列和轉(zhuǎn)錄因子的鑒定

使用MISA軟件[23]鑒定轉(zhuǎn)錄本中的微衛(wèi)星序列（SSR），并使用Shi等[24]描述的方法分析重復(fù)基序類型的特征。基于轉(zhuǎn)錄因子（TF）家族的Pfam搜索結(jié)果，使用hmmscan比對(duì)方式鑒定轉(zhuǎn)錄因子。

1.8 重樓皂苷合成基因的挖掘

依據(jù)前期關(guān)于重樓皂昔生物合成途徑的研究報(bào)道[9，25]，從基因功能注釋KEGG途徑中篩選2個(gè)與重樓皂苷合成密切相關(guān)的候選代謝通路（甾體生物合成途徑、萜類骨架生物合成途徑）[26-27]，從候選途徑中查找相關(guān)酶，再根據(jù)酶查找酶的相應(yīng)基因，其中合成膽固醇的上游基因[28-29]包括：GPPs、FPPs、SQE，CAS，SMT，SMO，CPII.CYP5IG，CI4-R，δ，7SI 和CD-SD，從膽固醇到重樓皂苷主要由細(xì)胞色素P450酶基因（CYPs）和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶基因（UGTs）催化[30]

2 結(jié)果與分析

2.1PacBio單分子實(shí)時(shí)測(cè)序數(shù)據(jù)分析

采用PacBioSMRT測(cè)序技術(shù)共獲得了92.11Gb數(shù)據(jù)。去除低質(zhì)量序列和接頭序列后，得到26 043008個(gè)子讀長(zhǎng)，平均長(zhǎng)度為 3465bp （表1）。為了提供更準(zhǔn)確和可靠的序列，序列進(jìn)行自我糾錯(cuò)后獲得639807個(gè)CCS，平均長(zhǎng)度為3791bp，通過篩選最終得到了578320個(gè)具有polyA的FLNC序列，聚類去除冗余和序列校正后，共獲得51109個(gè)共識(shí)序列。利用CD-HIT軟件去冗余后得到42771個(gè)最終全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，用于進(jìn)一步功能注釋，長(zhǎng)度范圍為118～12195bp，N50（N50 指將所有序列按長(zhǎng)度從長(zhǎng)到短排序后，累加長(zhǎng)度達(dá)到總序列長(zhǎng)度一半時(shí)，所對(duì)應(yīng)的序列長(zhǎng)度）為 4 073bp ，平均轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度為3660bp（表1）， 18.74% 的轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度小于 2500bp 55.82% 的轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度為2 ÷500～4500bp （圖2）。

表1重樓PacBioSMRT測(cè)序結(jié)果 Table1 Summary of PacBio SMRT sequencing of Paris

N50指將所有序列按長(zhǎng)度從長(zhǎng)到短排序后，累加長(zhǎng)度達(dá)到總序列長(zhǎng)度一半時(shí)，所對(duì)應(yīng)的序列長(zhǎng)度。

圖2同源異構(gòu)體長(zhǎng)度分布Fig.2Isoform size distribution

2.2轉(zhuǎn)錄本功能注釋

在42771個(gè)轉(zhuǎn)錄本中，有40945（ 95.73% 個(gè)轉(zhuǎn)錄本成功比對(duì)到KEGG、NR、Swiss-Prot、TrEMBL、KOG、GO和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行了注釋。分別注釋了35021個(gè)、40488個(gè)、32834個(gè)、40525個(gè)、29603個(gè)、36425個(gè)、34927個(gè)轉(zhuǎn)錄本（表2）。

表2數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)

Table2 Statisticsofdatabaseannotationresults

GO分析結(jié)果顯示，36425個(gè)單基因被聚類為44個(gè)GO項(xiàng)，圖3列出了32項(xiàng)，其中 72.88% （26548個(gè)）的單基因富集在細(xì)胞過程中， 82.49% （30047個(gè)）富集在細(xì)胞解剖實(shí)體中， 67.50% （24587個(gè)）富集于結(jié)合中。

KOG注釋結(jié)果顯示比對(duì)為“一般功能預(yù)測(cè)”的重樓轉(zhuǎn)錄本最多（8837個(gè)），其次為“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制”，轉(zhuǎn)錄本最少的為“細(xì)胞運(yùn)動(dòng)”，僅35個(gè)轉(zhuǎn)錄本（圖4）。

KEGG富集分析將35021個(gè)高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄本分為144個(gè)信號(hào)通路，涉及5個(gè)類別：代謝、有機(jī)系統(tǒng)、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理和細(xì)胞過程，其中次生代謝物的生物合成、淀粉和蔗糖代謝顯著富集（圖5）。

1：細(xì)胞過程；2：代謝過程;3：生物調(diào)節(jié);4：刺激影響;5：生物過程調(diào)節(jié);6：發(fā)育過程；7：多細(xì)胞生物過程;8：定位；9：生殖；10：生殖過程；11：信號(hào);12：生物過程負(fù)調(diào)節(jié);13：種間相互作用;14;生物過程正調(diào)節(jié);15：生長(zhǎng);16;細(xì)胞解剖實(shí)體;17：含蛋白質(zhì)的復(fù)合物;18：結(jié)合；19：催化活性;20：ATP（腺嘌呤核苷三磷酸）依賴的活動(dòng)催化活性;21：轉(zhuǎn)運(yùn)活性;22：轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性;23：結(jié)構(gòu)分子活性;24：分子功能調(diào)節(jié)劑活性；25：翻譯調(diào)節(jié)活性;26：分子傳感器活性;27：小分子傳感器活性;28：分子接頭活性;29：細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)活性;30：分子載體活性;31：蛋白質(zhì)折疊伴侶；32：抗氧化活性。

圖3GO注釋結(jié)果 Fig.3GO annotation results

圖4KOG注釋結(jié)果 Fig.4 KOG annotation results

A：RNA 處理和修飾;B：染色體結(jié)構(gòu)與動(dòng)態(tài);C：能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換;D：細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂、染色體分割;E：氨基酸運(yùn)輸和代謝;F：核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝;G：碳水化合物運(yùn)輸和代謝;H：輔酶運(yùn)輸和代謝;I：脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝;J：翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成;K：轉(zhuǎn)錄;L：復(fù)制、重組和修復(fù);M：細(xì)胞壁/膜/胞膜生物發(fā)生;N：細(xì)胞運(yùn)動(dòng);O：翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、分子伴侶;P：無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝;Q：次級(jí)代謝物生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝;R：一般功能預(yù)測(cè);S：未知功能;T：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制;U：細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn);V：防御機(jī)制;W：細(xì)胞外結(jié)構(gòu)；X：核結(jié)構(gòu);Y：細(xì)胞骨架。

NR注釋結(jié)果（圖6顯示，與重樓全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組基因序列匹配度最高的基因主要來源于海棗1 24.45% ）、油棕（ 24.29% ）和椰子 （6.94% ）。

2.3 LncRNA預(yù)測(cè)結(jié)果

LncRNA指長(zhǎng)度大于200核苷酸（nt）的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄、剪接和翻譯過程中發(fā)揮重要作用[31]使用CNCI、CPC2和PLEK軟件進(jìn)行潛能編碼預(yù)測(cè)，分別預(yù)測(cè)出952個(gè)1449個(gè)和781個(gè)LncRNA。在3種預(yù)測(cè)方法中，1637個(gè)LncRNA中僅有340個(gè)為3個(gè)軟件共同預(yù)測(cè)到的LncRNA（圖7）。

2.4轉(zhuǎn)錄因子檢測(cè)

本研究共鑒定了2327個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（TF），分為71個(gè)家族，其中SNF2（281個(gè)）、FAR1（144個(gè)）和SET（131個(gè)）家族數(shù)量最多，另外MYB、AP2/ERF、bHLH、WRKY和bZIP等轉(zhuǎn)錄因子可能參與了甾體皂苷的合成[26.32]，在本研究中分別鑒定了58個(gè)MYB、19個(gè)AP2/ERF、24個(gè)bHLH、16個(gè)WRKY和32個(gè)bZIP轉(zhuǎn)錄因子（圖8）。

2.5 SSR檢測(cè)

使用MISA工具共鑒定出27451個(gè)SSR，其中單堿基重復(fù)7899個(gè)（ 28.77% ），2個(gè)堿基重復(fù)5372個(gè)（ 19.57% ），3個(gè)堿基重復(fù)3314個(gè)（ 12.07% ），4個(gè)堿基重復(fù)最少，僅占 0.16% （45個(gè)）（表3）。

對(duì)所有SSR位點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明， A/T 的單核苷酸重復(fù)基序數(shù)量最多，占所有單核苷酸重復(fù)基序數(shù)量的 87.26% （12829個(gè)），而C/G僅占12. 74% （1873個(gè)）（圖9a）。在二核苷酸重復(fù)基序中，AG/CT的二核苷酸重復(fù)基序最多（11556個(gè)，63.81% ），其次是AA/TT（4434個(gè)， 24.49% ），而CG/CG最少，僅占 0.14% （25個(gè)）（圖9b）。

圖5KEGG注釋結(jié)果 Fig.5KEGG annotation results

MAPK：絲裂原活化蛋白激酶;ABC：三磷酸腺苷結(jié)合盒式蛋白。

圖6NR注釋結(jié)果 Fig.6NRannotation results

圖7長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.7Prediction results of long non-coding RNA（LncRNA）

表3微衛(wèi)星序列（SSR）的統(tǒng)計(jì)分析 Table3Statisticalanalysisof microsatellitesequences（SSRs）

c為復(fù)雜重復(fù)類型；c*為SSR之間有重疊的復(fù)合類型；p1為單堿基 重復(fù)；p2為2個(gè)堿基重復(fù)；p3為3個(gè)堿基重復(fù)； p4 為4個(gè)堿基重復(fù)； p5為5個(gè)堿基重復(fù);p6為6個(gè)堿基重復(fù)。

2.6重樓皂苷合成途徑相關(guān)酶及其相應(yīng)基因的挖掘

重樓屬植物的主要活性成分為甾體皂昔，這些復(fù)雜的化合物來源于植物體內(nèi)的萜類化合物[33]。通過KEGG代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，73個(gè)轉(zhuǎn)錄本參與了留體生物合成途徑，75個(gè)轉(zhuǎn)錄本參與了萜類骨架生物合成（圖5），進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，其中包含了48個(gè)與膽固醇合成相關(guān)的基因（表4），除此之外還篩選到了120個(gè)CYPs基因以及53個(gè)UGTs基因（表4）。

3討論

重樓屬植物在民間被廣泛用于治療療瘡癰腫、蛇蟲咬傷以及驚風(fēng)抽搐等[]，其主要活性成分為重樓皂苷，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等藥理作用[34]重樓皂苷主要通過甲羥戊酸（MVA）途徑和2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸（MEP）途徑合成前體物質(zhì)[33]，再由一系列細(xì)胞色素P450酶對(duì)前體分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行特定位置的羥基化修飾，最終在糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下生成各類重樓皂苷[35]，但重樓皂苷的具體合成通路仍在探索中。鑒于重樓屬植物體內(nèi)所含重樓皂昔的種類與含量呈現(xiàn)出顯著的種間差異[8]，故從這些具有特定皂苷組成特征的植物中系統(tǒng)地挖掘和鑒定與重樓皂苷生物合成相關(guān)的基因，以實(shí)現(xiàn)更為精確的目標(biāo)基因識(shí)別，并優(yōu)化合成路徑，為提升藥用植物品質(zhì)及發(fā)現(xiàn)新藥源提供科學(xué)支撐。采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以有效地預(yù)測(cè)藥用植物的關(guān)鍵基因[36]。本研究通過對(duì)富含重樓皂苷1和重樓皂苷Ⅱ的云南重樓、富含重樓皂苷Ⅱ的長(zhǎng)柱重樓和富含重樓皂苷V、重樓皂苷VII、重樓皂苷H的球藥隔重樓[8根莖混合樣品進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)序列信息進(jìn)行分析。通過測(cè)序共獲得了42771個(gè)轉(zhuǎn)錄本，比Hua等[30]所測(cè)得的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量多2896個(gè)，進(jìn)一步證明以不同重樓屬植物作為試驗(yàn)材料，有利于篩選與重樓皂昔合成相關(guān)的基因。其中， 95.73% 的轉(zhuǎn)錄本成功比對(duì)到7大數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行了注釋，通過KEGG富集通路篩選到48個(gè)與膽固醇合成相關(guān)的基因，同時(shí)還分別篩選到了120個(gè)CYPs基因以及53個(gè)UGTs基因，對(duì)這些與功能相關(guān)的基因進(jìn)行深入的差異表達(dá)分析，不僅能夠?yàn)榻馕鲋貥侵参锎紊x產(chǎn)物的合成途徑、積累動(dòng)態(tài)及調(diào)控機(jī)理提供關(guān)鍵的理論依據(jù)，同時(shí)也有助于為將來針對(duì)重樓甾體皂苷類化合物生物合成相關(guān)基因的定向克隆工作儲(chǔ)備有價(jià)值的候選基因。

圖9單核苷酸和二核苷酸重復(fù)基序的類型和數(shù)量

Fig.9Thetypesand numbersofmononucleotideand dinucleotiderepeatmotifs

表4重樓皂苷合成途徑相關(guān)酶及其相應(yīng)基因

Table 4Enzymes and corresponding genes involved in saponin biosynthetic pathways in Paris

轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物次生代謝產(chǎn)物積累、生理代謝和脅迫方面發(fā)揮著重要作用[37]。迄今，已在MYB、WRKY、bHLH、bZIP和AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族中發(fā)現(xiàn)了多種具有重要功能的轉(zhuǎn)錄因子成員[38]據(jù)推測(cè)，這些轉(zhuǎn)錄因子通過參與調(diào)控植物體內(nèi)生物合成基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)這些特殊代謝物的生物合成[39]，部分轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為與萜類和甾體化合物合成有關(guān)[40-43]。在本研究中共鑒定了2327個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，分別屬于71個(gè)家族，其中包含58個(gè)MYB、19個(gè)AP2/ERF、24個(gè)bHLH、16個(gè)WRKY和32個(gè)bZIP。

綜上，本研究通過重樓全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析，充實(shí)了重樓基因信息，為解析重樓活性成分代謝調(diào)控及關(guān)鍵基因篩選提供了重要參考。

4結(jié)論

通過對(duì)重樓樣本進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，成功獲取了42771個(gè)去冗余后的獨(dú)立轉(zhuǎn)錄本序列。其中40945個(gè)轉(zhuǎn)錄本成功比對(duì)至包括KEGG在內(nèi)的7大生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，并完成了注釋。這些單基因在細(xì)胞解剖實(shí)體、一般功能預(yù)測(cè)和次生代謝物的生物合成中占據(jù)較高比例。在NR數(shù)據(jù)庫(kù)中，重樓與海棗和油棕的基因序列匹配度最高。本研究還預(yù)測(cè)識(shí)別出了27451個(gè)微衛(wèi)星序列（SSR），揭示了豐富的遺傳變異信息源；同時(shí)鑒定出1637個(gè)潛在的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA），以及2327個(gè)可能參與調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。篩選了149個(gè)與重樓皂苷合成相關(guān)的關(guān)鍵候選轉(zhuǎn)錄因子，鑒定了與膽固醇合成直接相關(guān)的基因48個(gè)，以及120個(gè)細(xì)胞色素P450酶基因和53個(gè)UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶基因。以上結(jié)果極大地拓寬了重樓的公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，并為鑒定參與重樓皂苷和其他次生代謝產(chǎn)物生物合成的候選基因提供了寶貴的資源。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）

收稿日期：2024-09-04

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（82160718）；云南省科技廳基礎(chǔ)研究專項(xiàng)面上項(xiàng)目（202301AT070257）；云南省興滇英才支持計(jì)劃青年人才專項(xiàng)（YNWR-QNBJ-2020-257、XDYC-QNRC-2022-0277）；云南省中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項(xiàng)（202101AZ070001-057）

作者簡(jiǎn)介：徐萍（2000-），女，云南昭通人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幉挠行С煞址e累機(jī)制。（E-mail）2633822198@qq.com

通訊作者：陳佳，（E-mail）394626580@qq.com;鄭國(guó)偉，（E-mail）gwzhengkm@163.com