紫花苜蓿RALF基因家族的全基因組鑒定及鹽脅迫下表達(dá)分析

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2025.07.002

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；RALF基因；表達(dá)分析；生物信息學(xué)分析；鹽脅迫中圖分類號(hào)： s68;Q946.83⁺6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)： 1000-4440（2025）07-1260-10

Genome-wide identification of the RALF gene family in Medicago sativa and expression analysis under salt stress

WANG Xinlei， ZHU Siqi， TIAN Xiaona，YANG Qi

（KeyLboatestadeoetddf

（24號(hào) ty ，Hohhot 010018，China）

Abstract：Rapidalkalinizationfactor（RALF）isaclassofsmallpeptides that playcrucial roles inplant growth， development，and stress response.To investigate keygenes involved insalt stressresponse，weidentified membersof the RALF gene family in the whole genome of Medicago sativa and analyzed their response characteristicsunder salt stress.

Throughwhole-genome BLASTanalysis，weidentifiednine RALF genes in M .sativa.The encoded proteins ranged from59to 128 aminoacidsinlength.Their isoelectric pointsclusteredbetween5.13and 5.41.All exhibited hydrophobic properties.These genes were distributed across sixchromosomes，with two pairs exhibiting collinearity. Phylogenetic analysis grouped these genes into four subgroups，and all members retained the conserved motifl and

motif2.Furthermore，promoteranalysisrevealedthatmost MsRALFgenescontainedcis-regulatoryelementsassociatedwith plantgrowth，development，andstressresponse.Undersaltstress，MsRALF1，MsRALF2andMsRALF3expresioly decreased but subsequently increased，peaking at ^7d ，whileMsRALF6declined，then increased，and finallydecreased， reaching maximal expressionat3d. MsRALF4，MsRALF5，MsRALF7，MsRALF8 and MsRALF9 all peaked immediatelyon dayO of salt exposure.These findings suggest that the nine MsRALF genes identified in M sativa maybe involved in the plant's response to salt stress，with their expression being regulated by salt stress conditions.

KeyWords： Medicago sativa；RALF gene；expression analysis；bioinformatics；salt stress

植物小分子信號(hào)肽是一類具有特殊功能的多肽，其長(zhǎng)度通常少于100個(gè)氨基酸。這些信號(hào)肽在植物中廣泛存在，除了調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育外，還參與應(yīng)對(duì)非生物逆境脅迫等重要過(guò)程[1]

快速堿化因子RALF（Rapidalkalinization fac-tor）是一種相對(duì)分子量約為5000的小分子信號(hào)肽，首次在煙草（Nicotianatabacum）葉片中發(fā)現(xiàn)，因其可以引起培養(yǎng)基的快速堿化而得名[2]。RALF是一種含有大量半胱氨酸的多肽，其整體結(jié)構(gòu)由49個(gè)氨基酸組成，并且具有一個(gè)保守的C端結(jié)構(gòu)域。此外，RALF的C末端結(jié)構(gòu)域富含半胱氨酸（Cys），通常包含4個(gè)Cys，這些Cys之間能夠通過(guò)分子內(nèi)二硫鍵形成連接，從而進(jìn)一步生成成熟的活性肽[2]

RALF基因存在于一些單子葉植物、雙子葉植物以及裸子植物中，其在植物不同器官和組織中的表達(dá)模式各不相同。RALF基因參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，例如首次被克隆的是番茄（Lycopersi-conesculentum）中的一個(gè)RALF基因，該基因可以在特定時(shí)期抑制番茄花粉管的生長(zhǎng)且不影響花粉活力[3]。擬南芥（Arabidopsis thaliana）中AtRALF1基因和AtRALF23基因在根中特異性表達(dá)，此外，植物在該基因過(guò)表達(dá)后可能表現(xiàn)出根系減少和生長(zhǎng)緩慢的表型。也有研究結(jié)果表明，在擬南芥中AtRALF1基因通過(guò)快速胞外堿化作用抑制根尖生長(zhǎng)[4]。RALF4和RALF19是擬南芥的兩種肽配體，它們與受體BUPS1和BUPS2相互作用，調(diào)控花粉管的生長(zhǎng)和發(fā)育，并保持其完整性[2]。RALF多肽與FERONIA（FER）ANJEA（ANJ）和 HERCU-LESRECEPTORKINASE1（HERKI）受體激酶相互作用，從而調(diào)節(jié)花粉管的行為，最終確保成功受精并防止多精現(xiàn)象[5]

RALF還在植物的生物和非生物脅迫防御反應(yīng)中發(fā)揮作用。相關(guān)研究結(jié)果表明，AtRALF8是一種在擬南芥中參與應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞壁修飾的信號(hào)分子基因，然而，其過(guò)度表達(dá)會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)、耐旱性以及對(duì)線蟲(chóng)感染的抗性產(chǎn)生負(fù)面影響[6]。ALF23和RALF33通過(guò)抑制病原體相關(guān)分子模式誘導(dǎo)的活性氧（ROS）暴發(fā)，負(fù)調(diào)控植物免疫反應(yīng)[7]。鹽脅迫條件下，RALF22/RALF23-FER和LRX3/LRX4/LRX5通過(guò)維持細(xì)胞壁完整性、調(diào)節(jié)離子穩(wěn)態(tài)及抑制ROS過(guò)度積累，共同提高植物的耐鹽性[8]。此外，過(guò)表達(dá)藜麥（Chenopodiumquinoa）CqRALF15基因的擬南芥在高鹽環(huán)境下僅表現(xiàn)出葉片失綠表型，表明該基因參與調(diào)控植物的耐鹽性[9]

RALF可被玫瑰花類受體樣激酶1蛋白（CrRLK1L）家族感知，RALF通過(guò)與CrRLK1L家族的受體相互作用，誘導(dǎo)植物細(xì)胞外區(qū)域的快速堿化，并導(dǎo)致植物生長(zhǎng)受到抑制，RALF和CrRLK1L受體復(fù)合物在其他組織中也參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明，RALF和CrRLK1L受體家族在植物細(xì)胞伸長(zhǎng)信號(hào)傳導(dǎo)中與許多生理反應(yīng)相互作用[10]

全球范圍內(nèi)，土壤鹽漬化已成為亟待解決的重要生態(tài)問(wèn)題，鹽漬化土壤面積龐大且分布廣泛。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球鹽堿地中中國(guó)占比達(dá) 10.38% ，鹽堿地對(duì)植物生長(zhǎng)及全球生態(tài)環(huán)境均帶來(lái)重大威脅[1]。紫花苜蓿（Medicagosativa）為多年生草本植物，屬于豆科首蓿屬，憑借其優(yōu)良品質(zhì)，在現(xiàn)代草產(chǎn)業(yè)中占有重要地位。因其產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)被譽(yù)為“牧草之王”[12]。中國(guó)紫花苜蓿主要分布在、新疆、甘肅等鹽堿地較多的地區(qū)[13]。因此，研究紫花首蓿的耐鹽機(jī)制，對(duì)合理開(kāi)發(fā)和利用鹽堿地具有重要意義。

本研究對(duì)紫花苜蓿基因組中RALF基因家族成員進(jìn)行了鑒定，隨后進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析、基因結(jié)構(gòu)解析、染色體定位及啟動(dòng)子響應(yīng)元件的研究。此外，還檢測(cè)在鹽脅迫處理下紫花苜蓿RALF家族基因的表達(dá)，為深入探討RALF家族基因在紫花苜蓿鹽脅迫響應(yīng)中的作用提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 植物培養(yǎng)與鹽脅迫處理

選取飽滿均勻的紫花苜蓿（品種為中首1號(hào)）種子，播種在裝有蛭石：營(yíng)養(yǎng)土 δ=3：1 （體積比）的培養(yǎng)缽中，培養(yǎng)30d后進(jìn)行鹽脅迫處理。

利用濃度為 300mmol/L 的 ΔNaCl 溶液澆灌紫花首蓿幼苗進(jìn)行鹽脅迫處理，分別在處理當(dāng)天與處理后1d、3d和7d取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取4株幼苗，迅速用水沖洗干凈，將樣品在研缽中磨碎，然后放入 50mL 離心管中液氮速凍，將樣品儲(chǔ)存于-80^°C 的超低溫冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1紫花首蓿RALF家族基因的鑒定、染色體定位和共線性分析中首1號(hào)紫花苜蓿數(shù)據(jù)下載自Figshare 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//info.figshare.com/）[14]。為了鑒定紫花苜蓿中的RALF基因，從TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了39個(gè)RALF家族基因序列作為種子序列，通過(guò)TBtools[15的Blastp功能鑒定紫花苜蓿中的RALF同源基因；使用ExPASy網(wǎng)站（http：//expasy.org/tools/）預(yù)測(cè)MsRALF蛋白的相對(duì)分子量、等電點(diǎn)、親水性總平均值（GRAVY）。本研究從紫花苜蓿基因組的GFF文件中獲取了9個(gè)MsRALF基因的染色體位置信息，并通過(guò)TBtools進(jìn)行了可視化分析和共線性分析。基因的復(fù)制事件則通過(guò)KaKs_Calculatoi Γ2.0^[16] 進(jìn)行分析。

1.2.2系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析使用MEGA11[17]軟件的MUSCLE工具比對(duì)9個(gè)MsRALF基因編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列與39個(gè)擬南芥RALF蛋白氨基酸序列，并采用鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap檢驗(yàn)次數(shù)為1O00次。擬南芥RALF蛋白氨基酸序列來(lái)自TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)。將9個(gè)MsRALF基因編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列上傳至MEME網(wǎng)站[18]（http：//meme-suite.org/tools/meme）進(jìn)行基序分析，并使用MEGA11軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。通過(guò)TBtools整合并可視化分析結(jié)果。

1.2.3蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用在線工具SOPMA（https：//npsa-prabi.ib-cp.fr）對(duì)9個(gè)MsRALF蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[19] O

1.2.4順式作用元件分析從紫花苜蓿基因組中提取9個(gè)RALF基因起始密碼子上游2000個(gè)堿基對(duì)的序列，使用TBtools獲取每個(gè)基因起始密碼子上游2000bp 的 CDS序列，驗(yàn)證后上傳至PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plant-care/html/），篩選反饋結(jié)果并通過(guò)TBtools進(jìn)行可視化分析。

表1本研究所用引物Table1 Primersused inthisstudy

1.2.5紫花首蓿總RNA提取使用TIANGEN總RNA提取試劑盒按照操作手冊(cè)提取RNA，利用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。

1.2.6表達(dá)模式分析以紫花苜蓿cDNA為模板，目的基因和內(nèi)參基因（MsEIF4A）引物見(jiàn)表1。反應(yīng)體系（ 20μL ）： 5μL 模板 引物（濃度為 10μmol/L ），TBGreen °ledast Premix Ex TaqTM（TliRNaseH Plus） 10μL ddH₂0 補(bǔ)至 20μL 。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?94^9C 預(yù)變性 30s，94° 變性 5s，60° 退火15s， 72^°C 延伸10s，45個(gè)循環(huán)。基因相對(duì)表達(dá)量通過(guò) 2^-ΔΔGt 法計(jì)算[20]

2 結(jié)果與分析

2.1紫花苜蓿MsRALF基因家族成員的鑒定、基因染色體定位以及共線性關(guān)系

本研究從中首1號(hào)基因組中鑒定到9個(gè)MsRALF基因，分別命名為MsRALF1～MsRALF9（表2）。通過(guò)ExPASy分析，MsRALF基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列長(zhǎng)度在59aa至128aa之間，且MsRALF9的氨基酸序列最長(zhǎng)，相對(duì)分子量為32088.28。9個(gè)MsRALF的等電點(diǎn)為5.13～5.41，且均為疏水蛋白。

表2紫花苜蓿中MsRALF基因鑒定結(jié)果

Table2 ResultsoftheidentificationofMsRALFgenesinMedicagosativt

親水性總平均值大于0的為疏水蛋白，小于0的為親水蛋白。

如圖1所示，MsRALF基因主要集中在2號(hào)染色體上，共3個(gè)基因，3號(hào)染色體、4號(hào)染色體、6號(hào)染色體、7號(hào)染色體和8號(hào)染色體上有1～2個(gè)基因。1號(hào)染色體和5號(hào)染色體上未發(fā)現(xiàn)MsRALF基因。

圖1MsRALF基因染色體定位 Fig.1 Chromosomal localization of MsRALF genes

共線性分析結(jié)果表明，MsRALF基因家族成員中有2對(duì)基因存在共線性關(guān)系，分別是MsRALF7和MsRALF9MsRALF8和MsRALF9（圖2）。為評(píng)估其進(jìn)化選擇模式，對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因進(jìn)行非同義替換率（ Ka ）與同義替換率（Ks）比值的計(jì)算結(jié)果顯示，非同義替換率（ Ka） 和同義替換率（Ks）之間的比值小于

1，表示MsRALF基因受到正選擇，即有利突變被保留（表3）。

2.2紫花苜蓿MsRALF基因的系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)和保守基序

將擬南芥中的39個(gè)RALF基因與本研究鑒定出的9個(gè)紫花苜蓿MsRALF基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，擬南芥和紫花苜蓿共48個(gè)RALF基因被分成6個(gè)組，其中擬南芥的RALF基因在6個(gè)組中都有成員分布，而紫花苜蓿MsRALF基因只分布于I組、Ⅱ組、Ⅱ組和V組中（圖3）。其中屬于I組的紫花苜蓿MsRALF基因數(shù)量有4個(gè)，分別是MsRALF4、MsRALF7、MsRALF8和MsRALF9，I組包括擬南芥中已經(jīng)報(bào)道的與鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)的RALF22、RALF23（即 AT3G05490.I.AT3GI6570.I） 。紫花首蓿MsRALF1、MsRALF6與調(diào)控?cái)M南芥花粉管伸長(zhǎng)的AT1G28270.1基因均處于Ⅱ組。

圖2MsRALF的共線性關(guān)系Fig.2CollinearityofMsRALF

表3MsRALF基因中非同義替換率、同義替換率及其比值 Table3Non-synonymous substitution rate，synonymous substitutionrateandtheirratioinMsRALFgenes

對(duì)紫花苜蓿MsRALF蛋白保守基序進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有5個(gè)不同的保守基序（圖4）。其中，motif1和motif2基序在9個(gè)MsRALF蛋白中都存在，motif4僅在MsRALF2蛋白和MsRALF3蛋白中存在。MsRALF4、MsRALF5、MsRALF7、MsRALF8和MsRALF9則都由motif1、motif2、motif3和motif54個(gè)基序組成。

2.3紫花苜蓿MsRALF蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

利用SOPMA網(wǎng)站預(yù)測(cè)和分析MsRALF基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，MsRALF蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括4種類型： α -螺旋、延伸鏈 B -轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲。其中， α -螺旋的比例在 18.86% 至35.11% 之間，延伸鏈的比例為 11.84%～27.36%，β?轉(zhuǎn)角的比例為 0～15.25% ，而無(wú)規(guī)則卷曲的比例在36.17% 至 57.20% 之間。

圖3紫花苜蓿與擬南芥 RALF 基因家族進(jìn)化分析 Fig.3Evolutionaryanalysisof theRALF genefamilyinMedicagosativaand Arabidopsis thaliana

2.4紫花首蓿MsRALF基因啟動(dòng)子順式作用元件

對(duì)紫花首蓿MsRALF基因啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果顯示，9個(gè)MsRALF基因啟動(dòng)子上都具有數(shù)量眾多的脅迫響應(yīng)順式作用元件。序列中包含大量激素響應(yīng)元件和非生物脅迫響應(yīng)順式作用元件。其中激素響應(yīng)元件包括脫落酸（ABA）響應(yīng)元件和赤霉素（GA）響應(yīng)元件。非生物脅迫響應(yīng)元件包括防御與脅迫響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件，以及多個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件（調(diào)控類黃酮生物合成、光響應(yīng)及干旱誘導(dǎo)等過(guò)程）。除此以外，各基因啟動(dòng)子上還具有大量的光響應(yīng)和晝夜節(jié)律相關(guān)順式作用元件。這些結(jié)果說(shuō)明，紫花苜蓿MsRALF基因表達(dá)可能受到各種激素和非生物脅迫的調(diào)控。

2.5 紫花首蓿MsRALF基因在鹽脅迫下的表達(dá)

為探究紫花苜蓿MsRALF基因表達(dá)是否受鹽脅迫調(diào)控，本研究采用RT-qPCR檢測(cè)了9個(gè)MsRALF基因在鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果（圖5）表明，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，MsRALF1、MsRALF2MsRALF3的表達(dá)量呈先下降后上升的趨勢(shì)，并在第7d達(dá)到最高值；MsRALF6的表達(dá)量呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)，并在第3d達(dá)到最高值。MsRALF4MsRALF7和MsRALF9的表達(dá)量呈先下降后上升的趨勢(shì)，3個(gè)基因的表達(dá)量均在0d時(shí)達(dá)峰值。MsRALF5MsRALF8的表達(dá)量呈先下降后上升 再下降的趨勢(shì)，2個(gè)基因的表達(dá)量均在0d時(shí)達(dá)峰值。

圖4MsRALF蛋白保守基序分析

Fig.4Conserved motifanalysisofMsRALFproteins

3討論

RALF小分子信號(hào)肽在植物中廣泛分布，在調(diào)節(jié)植物激素和調(diào)控植物生長(zhǎng)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。前人利用基因組測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)很多種類植物的

RALF基因家族成員進(jìn)行了鑒定和分析。例如，Liu等[21]在大豆中鑒定到27個(gè)RALF基因家族成員，并分析了其對(duì)真菌的響應(yīng);Jiang等在藜麥中鑒定到18個(gè)RALF基因家族成員，并對(duì)其在鹽脅迫下的表達(dá)和功能進(jìn)行了分析，鑒定到藜麥中與鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)的RALF基因;Sui等[22]在巴西橡膠樹(shù)基因組中鑒定到23個(gè)RALF基因家族成員，并研究了割膠和乙烯對(duì)RALF基因表達(dá)的影響；Xue等[23在玉米基因組中鑒定到20個(gè)RALF基因并分析了它們?cè)诜巧锩{迫下的表達(dá)水平。此外，研究人員還對(duì)野生草莓（Fragariavesca）和栽培草莓（Fragaria×ananassa）等不同物種RALF基因家族成員進(jìn)行了鑒定[24]。本研究通過(guò)全基因組Blast在紫花苜蓿中共鑒定到9個(gè)RALF基因家族成員，分布在6條不同的染色體上。作為豆科植物，紫花苜蓿中鑒定到的RALF基因家族成員數(shù)量遠(yuǎn)低于大豆，這種差異可能與不同植物基因組大小有關(guān)，也可能反映了紫花苜蓿RALF基因與大豆RALF基因在進(jìn)化上不同。另外，已有研究結(jié)果表明，在豆科植物（如大豆、苜蓿）中，RALF基因的數(shù)量通常少于非豆科植物（如擬南芥）。這是由于基因擴(kuò)增模式的差異，非豆科植物的RALF基因擴(kuò)增主要通過(guò)串聯(lián)重復(fù)完成，而豆科植物則以片段重復(fù)為主[25]

本研究對(duì)紫花苜蓿的9個(gè)RALF基因家族成員進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示，MsRALF1和MsRALF6與調(diào)控?cái)M南芥花粉管伸長(zhǎng)的RALF4（AT1G28270.1）同處于Ⅱ組，存在較近的親緣關(guān)系。RALF4是調(diào)節(jié)花粉管完整性和極性伸長(zhǎng)的分泌型小肽，通過(guò)與富含亮氨酸重復(fù)序列-類伸展素蛋白（LRX）和長(zhǎng)春花受體樣激酶1-類受體激酶配體（CrRLK1L-LG）蛋白家族的相互作用，形成復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，以維持花粉管的正常功能[26]，推測(cè)紫花苜蓿的MsRALF1、MsRALF6基因可能與花粉管發(fā)育有關(guān)。MsRALF4、MsRALF7、MsRALF8和MsRALF9這4個(gè)基因與擬南芥RALF22和RALF23同處于I組，親緣關(guān)系較近。擬南芥中RALF22和RALF23通過(guò)與LRX3、LRX4、LRX5及FERONIA（FER）形成復(fù)合體，通過(guò)影響細(xì)胞壁的完整性進(jìn)而調(diào)控植物的生長(zhǎng)和對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)[8]，因此處于同一組的紫花苜蓿MsRALF4、MsRALF7、MsRALF8和MsRALF9基因可能參與了鹽脅迫響應(yīng)的調(diào)控。

啟動(dòng)子順式作用元件與基因表達(dá)、功能密切相關(guān)[27-33]，在紫花苜蓿的MsRALF基因啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)與植物激素響應(yīng)和脅迫響應(yīng)的順式作用元件，尤其是ABA響應(yīng)元件和GA響應(yīng)元件，這些響應(yīng)元件為啟動(dòng)子區(qū)域的功能研究提供了重要線索。ABA是植物響應(yīng)非生物脅迫的重要激素之一。ABA激素通過(guò)ABRE順式作用元件招募轉(zhuǎn)錄因子（如ABI5、AREB），進(jìn)而調(diào)控鹽脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，這一機(jī)制有助于植物在鹽脅迫下維持水分平衡和抗逆性。ABA通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活鹽脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，并協(xié)同調(diào)控離子通道和水通道蛋白，從而增強(qiáng)植物的耐鹽性[34]。另一方面，GA 作為植物生長(zhǎng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也在鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。GA能夠通過(guò)調(diào)節(jié)GA合成酶和降解酶的表達(dá)緩解鹽脅迫引起的植物生長(zhǎng)抑制[35]。在鹽脅迫條件下，GA通過(guò)調(diào)節(jié)與生長(zhǎng)相關(guān)的基因表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，協(xié)同作用于ABA，達(dá)到共同調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和脅迫響應(yīng)的目標(biāo)。GA與ABA在鹽脅迫下的植物適應(yīng)性調(diào)節(jié)中發(fā)揮了復(fù)雜而重要的作用。紫花苜蓿MsRALF基因的啟動(dòng)子不僅包含ABA和GA響應(yīng)元件，還富含與防御和脅迫相關(guān)的順式作用元件，如MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和低溫響應(yīng)元件。這些調(diào)控元件可能與ABA和GA信號(hào)通路交叉調(diào)控，影響紫花苜蓿MsRALF基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)。例如，MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員已被證實(shí)在ABA介導(dǎo)的耐鹽性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[36，而低溫響應(yīng)元件則可能使紫花苜蓿MsRALF基因在低溫脅迫與鹽脅迫的交互作用中產(chǎn)生響應(yīng)。綜上，紫花苜蓿MsRALF基因可能通過(guò)啟動(dòng)子區(qū)域的激素響應(yīng)元件與ABA和GA信號(hào)通路協(xié)同作用，調(diào)節(jié)植物對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)性響應(yīng)。這種調(diào)控機(jī)制不僅會(huì)影響植物的耐鹽能力，還可能影響其整體生長(zhǎng)發(fā)育。

根據(jù)目前的研究結(jié)果，擬南芥中RALF基因主要通過(guò)與FERONIA（FER）受體激酶相互作用調(diào)控細(xì)胞壁重塑、離子平衡以及ROS信號(hào)通路，從而參與植物的抗逆性調(diào)節(jié)。尤其是在鹽脅迫下，RALF基因通過(guò)FER受體激酶影響ABA信號(hào)通路，是植物在脅迫條件下調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆性的一個(gè)重要機(jī)制[8]。與擬南芥相比，紫花苜蓿MsRALF4、MsRALF7MsRALF8和MsRALF9基因在鹽脅迫下表現(xiàn)出下調(diào)趨勢(shì)，在系統(tǒng)發(fā)育分析中同屬I(mǎi)組，這表明它們可能具有相似的調(diào)控機(jī)制。然而，這些基因在紫花首蓿中的具體功能仍不完全明確，例如它們是否像擬南芥中的RALF基因一樣通過(guò)FER受體及其他脅迫響應(yīng)相關(guān)途徑調(diào)控植物的鹽脅迫響應(yīng)。結(jié)合保守基序分析，具有相似表達(dá)模式的基因在其編碼蛋白的保守基序組成上也有較高的相似性（如MsRALF4MsRALF7等）。這一特點(diǎn)為進(jìn)一步揭示這些基因的功能提供了線索。值得注意的是，MsRALF基因的調(diào)控可能不僅與ABA信號(hào)通路相關(guān)，還可能涉及GA信號(hào)通路、MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、ROS信號(hào)通路等多重機(jī)制。MsRALF基因可能在鹽脅迫的條件下通過(guò)調(diào)節(jié)這些信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)調(diào)控植物的耐鹽性。

因此，未來(lái)的研究應(yīng)進(jìn)一步探索MsRALF基因在紫花苜蓿鹽脅迫響應(yīng)中的具體調(diào)控機(jī)制，特別是通過(guò)功能驗(yàn)證與擬南芥中已知的RALF基因功能進(jìn)行對(duì)比分析，揭示其在鹽脅迫中的作用。此外，還可結(jié)合基因敲除、過(guò)表達(dá)以及RT-qPCR等技術(shù)手段深入解析MsRALF基因在紫花苜蓿中的功能，為耐鹽作物的育種改良提供理論依據(jù)。

4結(jié)論

本研究通過(guò)全基因組分析，鑒定到9個(gè)紫花苜蓿MsRALF基因家族成員，系統(tǒng)進(jìn)化分析將其分在4個(gè)不同組中。紫花苜蓿RALF與擬南芥RALF進(jìn)化關(guān)系、啟動(dòng)子順式作用元件和基因表達(dá)分析結(jié)果表明，MsRALF基因與紫花苜蓿對(duì)鹽脅迫及其他非生物脅迫的響應(yīng)有關(guān)，相同組的MsRALF基因在鹽脅迫下的表達(dá)模式基本相同。本研究結(jié)果初步揭示了MsRALF基因參與了紫花苜蓿對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)，為進(jìn)一步探究RALF在鹽脅迫響應(yīng)中的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：黃克玲）