長(zhǎng)喙殼菌侵染甘薯的轉(zhuǎn)錄組分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.311 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)： 1000-4440（2025）07-1320-12

Transcriptomic analysis of sweet potato infected by Ceratocystis fimbriata

YANG Dongjing，GAO Fangyuan， CHEN Jingwei， MA Jukui，TANG Wei， LIANG Zhao， ZHANGChengling， SUN Houjun， XIE Yiping

（XuzhouIstiulecofuitrfreKbtdeofAgriculture and Rural Affairs，Xuzhou ，China）

Abstract：SweetpotatoblackrotiscausedbytheinfectionofCeratocystisfimbriataElisetHalsted.Asoneof theimportantdiseases of sweet potato，itcanoccur during field production and storage，seriouslyafectingthe yieldandqualityof swet potato.Toclarifythepathogenic mechanismofCeratocystisfmbriataonsweet potato，thisstudyused Nanjing 92（aresistant varietytoswet potato black rot）and Xushu18（a susceptiblevariety）astest materials.The methodof needle prick inoculationwith spore suspensionwas adopted to artificially inoculate Ceratocystis fimbriata on sweet potato.Samples were collected at O d， ¹ d ，3 d and 7 d after inoculation， and transcriptome sequencing technology was used for sequencing analysis.The results of transcriptome sequencing showedthatcomparedwith thedayofinoculation，thenum bersof up-regulateddiferentiallexpressedgenes（DEGs）at1d，3dand7dafterinoculationofCeratocystis fimbriataon Nanjing92tuberswere1124，1713and2O32，respectively，andthenumbersofdown-regulatedDEGswere869，1042and 1005，respectively.For Xushu18tubers，thenumbersofup-regulatedDEGsat1d，3dand7dafterinoculationwere901， 1625and1957respectively，and the numbers of down-regulated DEGs were1O17，976and1O32 respectively.Theresults of GOfunctionalenrichmentanalysisrevealedthatthediferentiallyexpressedgeneswrepredominantlyenrichedinbiological processcategoriessuchasbiological process，metabolicprocessandsingle-organism process，aswellas incellarcomoent categories including cell，cellpartandorganelle.The main pathways enriched by KEGG pathwaywere metabolic pathways. VenndiagramanalysisshowedthatthecommonDEGsatdiferenttimepointsafterinoculationofCeratocystis fimbriataon Nanjing92tubers were1545，andthoseon Xushu18 tubers were1116.Through interactive analysis of these DEGs，it was found that there were 925common DEGs inthetwosweet potatovarieties ateach time period.KEGG clusteranalysis of the 925common DEGs showed that these DEGs were mainly enriched in metabolic pathways，such as carbohydrate metabolism， lipid metabolism，aminoacid metabolism，nucleotide metabolism，cofactorand vitamin metabolism，and energy metabolism. FurtherscreeningoftheseDEGs identified 20keypathogenic genes withrelativeexpresion levels higherthan1.OO，continuousup-regulationandafoldchangeof morethan4Otimes.Theresultsofthisstudylayanimportantfoundationfortheindepth studyofthemolecularpathogenicmechanismof Ceratocystisfimbriata.

Key words： sweet potato；Ceratocystis fiumbriata；transcriptome sequencing；diffrentially expressed genes （DEGs）；pathogenic mechanism

甘薯［Ipomoeabatatas（L.）Lam.]作為重要的糧食、飼料及能源作物，廣泛分布于全球100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。中國(guó)是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國(guó)，其耐貧瘠、超高產(chǎn)特性對(duì)保障國(guó)家糧食安全意義重大。隨著生活水平提升，甘薯保健價(jià)值日益凸顯，產(chǎn)業(yè)格局逐步演變[1-2]。然而，甘薯在田間種植及貯藏階段易受多種病原菌侵害，其中長(zhǎng)喙殼菌（CeratocystisfimbriataEllisetHalsted）引發(fā)的甘薯黑斑病是主要病害之一，嚴(yán)重制約甘薯生產(chǎn)[3-4]。現(xiàn)有研究結(jié)果表明，目前尚無(wú)完全免疫黑斑病的甘薯品種[5]。中國(guó)登記用于防治甘薯黑斑病的藥劑自前僅有多菌靈、甲基硫菌靈、代森銨、乙蒜素和大蒜素5種。受藥劑殘留、使用技術(shù)及防治效果等因素限制，化學(xué)防治難以有效解決黑斑病的預(yù)防和控制難題[6]

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等技術(shù)已被廣泛用于研究生物體的特定生物學(xué)過(guò)程和分子機(jī)制。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-Seq）由于通量大、時(shí)間短、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)在植物病害研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，它可以用于特定條件下的基因表達(dá)研究，在解析植物和病原菌互作的分子機(jī)制中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在甘薯抗生物和非生物脅迫的分子機(jī)制研究中得到廣泛應(yīng)用，大大豐富了轉(zhuǎn)錄組學(xué)在甘薯上的研究成果[7-9]。Onofua[10]以高抗蔓割病甘薯品種金山57和高感蔓割病甘薯品種新種花為材料，用致病性強(qiáng)的蔓割病菌株Fob-07和非致病菌株Fob-04分別侵染甘薯莖蔓，然后分別提取各樣品的RNA，利用高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，高抗品種金山57經(jīng)Fob-07侵染后，有6454個(gè)差異表達(dá)基因，其中3843個(gè)為上調(diào)表達(dá)基因，2611個(gè)為下調(diào)表達(dá)基因；高感品種新種花經(jīng)Fob-07侵染后，有6826個(gè)差異表達(dá)基因，其中5552個(gè)為上調(diào)表達(dá)基因，1274個(gè)為下調(diào)表達(dá)基因，此外，還發(fā)現(xiàn)如CERK1基因 ，MAPK 基因、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因以及NAC等轉(zhuǎn)錄因子、PR蛋白和R蛋白等與抗病相關(guān)。羅勤川[11]對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)接種腐皮鐮刀菌（Fusariumsola-ni ）的甘薯樣本進(jìn)行取樣和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，結(jié)果表明，在接種 6h，24h，3d 和5d后，分別檢測(cè)到1056個(gè)、995個(gè)、737個(gè)和935個(gè)顯著差異表達(dá)基因（DEGs）。GO功能富集分析結(jié)果表明，這些DEGs主要參與生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分。KEGG富集的通路多屬于代謝、有機(jī)體系統(tǒng)、細(xì)胞進(jìn)程、遺傳信息進(jìn)程。梅玉琴[12]通過(guò)對(duì)甘薯根腐病抗病品種和感病品種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗病品種鄂薯11在根腐病病菌侵染7d和13d時(shí)分別有10665個(gè)和10171個(gè)DEGs，感病品種勝利百號(hào)在根腐病病菌侵染7d和13d時(shí)分別有10050個(gè)和9972個(gè)DEGs，并由此推測(cè)鄂薯11更快速響應(yīng)根腐病病菌脅迫從而有利于增強(qiáng)甘薯對(duì)根腐病的抗性。Bednarek等[13]對(duì)甘薯病毒?。⊿PVD）敏感品種Beauregard中的mRNA和sRNA群體進(jìn)行深度測(cè)序，發(fā)現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因顯著受病毒感染影響，同時(shí)鑒定到幾種對(duì)病毒感染有反應(yīng)的新型microRNA，其中一些被預(yù)測(cè)為靶向核苷酸結(jié)合位點(diǎn)編碼富含亮氨酸重復(fù)序列（NBS-LRR）的抗病基因，此外病毒感染導(dǎo)致水楊酸介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)途徑相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，這在一定程度上也解釋了Beauregard品種對(duì)SPVD易感。

目前，關(guān)于長(zhǎng)喙殼菌引起的甘薯黑斑病研究報(bào)道較少，其致病機(jī)理尚不明確。本研究擬對(duì)兩個(gè)接種長(zhǎng)喙殼菌的甘薯品種不同時(shí)期取樣并進(jìn)行互作轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析接種后不同時(shí)期長(zhǎng)喙殼菌中存在的DEGs以及共有DEGs的GO功能和KEGG通路，結(jié)合關(guān)鍵通路和差異表達(dá)倍數(shù)篩選關(guān)鍵致病因子，以期為研究長(zhǎng)喙殼菌侵染甘薯的致病分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為甘薯黑斑病的預(yù)防和控制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 供試材料

供試甘薯選擇相對(duì)抗黑斑病的南京92和相對(duì)感黑斑病的徐薯18，甘薯長(zhǎng)喙殼菌采用PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯 20g/L ，葡萄糖 20g/L ，瓊脂粉 16g/L ）繼代培養(yǎng)。長(zhǎng)喙殼菌和甘薯薯塊均由徐淮地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。

1.2 病原菌接種及取樣方法

選擇健康、大小一致的薯塊洗凈晾干后用 75% 酒精噴霧消毒，備用。長(zhǎng)喙殼菌在PDA平板上培養(yǎng)5～7d，采用滅菌水洗滌平板獲得分生孢子懸浮液，在顯微鏡下將孢子液含孢子量調(diào)整為 1×10⁵ CFU/mL ，用滅菌針頭吸取孢子懸浮液針刺薯塊，每針刺1次需要吸取1次孢子懸浮液，每個(gè)薯塊接種3排，每排均勻接種5個(gè)點(diǎn)，分別在接種當(dāng)天與接種后1d、3d和7d取少量發(fā)病部位于液氮中速凍后再置于 -70^°C 冰箱中，南京92薯塊上的各樣品分別命名為R1、R2、R3和R4;徐薯18薯塊上的各樣品分別命名為S1、S2、S3和S4，樣品寄送至廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3總RNA提取檢測(cè)及轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建

采用植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品]提取樣品總RNA，進(jìn)一步通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、NanoDrop微量分光光度計(jì)和Agilent2100檢測(cè)RNA的完整性、濃度和純度，轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建和質(zhì)量檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[14]。

1.4轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、差異表達(dá)基因篩選及通路富集分析

采用IlluminaHiSeq400O平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，下機(jī)的原始測(cè)序數(shù)據(jù)（Raw reads）采用Fastp[15]進(jìn)行質(zhì)量控制，過(guò)濾后得到清潔讀數(shù)（Cleanreads），從而保證數(shù)據(jù)質(zhì)量。序列比對(duì)分析方面，針對(duì)核糖體序列的比對(duì)采用短reads比對(duì)軟件Bowtie2[16去除比對(duì)上核糖體的reads后再進(jìn)行分析，采用HISAT2軟件比對(duì)測(cè)序序列和參考基因組[Ceratocystis fim-briata CBS 114723（assembly Cfim 3.0 ）][17]，采用Stringtie軟件[18重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本，并計(jì)算每個(gè)樣本所有基因的表達(dá)量。基于表達(dá)量信息，采用R語(yǔ)言（ht-tp：//www.r-project.org/）開(kāi)展主成分分析。差異表達(dá)基因采用DESeq 2^[19] 進(jìn)行分析，以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率號(hào) （FDR）lt;0.05 且 |log₂FC|gt;1 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行DEGs篩選（ FC ：變化倍數(shù)）。將DEGs向GO數(shù)據(jù)庫(kù)各term進(jìn)行映射，計(jì)算每個(gè)term的基因數(shù)，從而得到具有某個(gè)GO功能的基因列表及基因數(shù)目，進(jìn)一步比對(duì)檢驗(yàn)，找出DEGs顯著富集的GO條目。將測(cè)序結(jié)果與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析[20]，并對(duì)DEGs進(jìn)行通路富集分析、功能分類(lèi)和注釋。對(duì)差異表達(dá)倍數(shù)顯著提升的基因采用Excel軟件篩選并進(jìn)行功能預(yù)測(cè)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

將rawreads中低質(zhì)量數(shù)據(jù)過(guò)濾掉后，每個(gè)樣品獲得的cleanreads數(shù)量均大于62529524個(gè)。堿基測(cè)序錯(cuò)誤率Q20堿基百分比（錯(cuò)誤率 lt;1.00% ）和Q30堿基百分比（錯(cuò)誤率 lt;0.10% ）分別在 97.51% 和 92.87% 以上， G+C 含量均在 56.40% 以上，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量較高，可用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)和參考基因組（assemblyCfim3.0）進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果如表1所示，比對(duì)到參考基因組的比值介于 0.54%～25.60% ；比對(duì)到參考基因外顯子區(qū)域序列占比69. 19%～84.23% ，比對(duì)到參考基因內(nèi)含子區(qū)域序列占比 0.69%～1. 19% ，基因間隔區(qū)占比 14.87%～30.12% 。

基于每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄本每百萬(wàn)映射讀取的片段數(shù)（FPKM）來(lái)統(tǒng)計(jì)基因的表達(dá)量，選擇任意兩個(gè)樣本的表達(dá)量，計(jì)算它們之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)（圖1），從圖1可以看出，每個(gè)樣品的3次生物學(xué)重復(fù)間具有較好的重復(fù)性，表明樣品達(dá)到重復(fù)性試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明結(jié)果是可靠的。此外，同一品種薯塊接種長(zhǎng)喙殼菌后隨時(shí)間點(diǎn)延長(zhǎng)基因表達(dá)量與接種當(dāng)天的基因表達(dá)量相關(guān)性逐漸降低，如R2基因表達(dá)量和R1基因表達(dá)量的相關(guān)性系數(shù)均高于0.6896，R3基因表達(dá)量與R1基因表達(dá)量的相關(guān)性系數(shù)為0.6645～0.6905，R4 基因表達(dá)量與R1基因表達(dá)量的相關(guān)性系數(shù)為 0.613 8～0.636 0. ，總體而言，接種后不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)量與接種當(dāng)天的基因表達(dá)量相關(guān)性較強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)均超過(guò)0.6000；兩個(gè)甘薯品種接種后各時(shí)間點(diǎn)基因表達(dá)量與接種當(dāng)天基因表達(dá)量相關(guān)性系數(shù)變化呈現(xiàn)相似的規(guī)律。

表1轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組的比對(duì)分析Table1 Alignment and analysis of transcriptome sequencing data with the reference genome

R1～R4：分別表示南京92薯塊接種長(zhǎng)喙殼菌分生孢子懸浮液當(dāng)天與接種后第1d、第3d、第7d的發(fā)病部位樣品;S1～S4：分別表示徐薯18薯塊接種長(zhǎng)喙殼菌分生孢子懸浮液當(dāng)天與接種后第1d、第3d、第7d的發(fā)病部位樣品。

2.2接種后不同時(shí)間點(diǎn)長(zhǎng)喙殼菌中的DEGs

基于差異分析結(jié)果，本研究篩選 FDRlt;0.05 且|log₂FC|gt;1 的基因?yàn)轱@著差異表達(dá)基因。從圖2可以看出，隨著接種后時(shí)間延長(zhǎng)，抗病品種南京92中長(zhǎng)喙殼菌的上調(diào)基因數(shù)量逐漸增加，感病品種徐薯18中也呈現(xiàn)相似的規(guī)律（圖2A～圖2F）。分別對(duì)接種后不同時(shí)間點(diǎn)（R2～R4）抗病品種南京92中長(zhǎng)喙殼菌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與R1進(jìn)行比較分析可以看出，接種后1d差異表達(dá)基因有1993個(gè)，其中上調(diào)DEGs和下調(diào)DEGs的數(shù)量分別為1124個(gè)和869個(gè)；接種3d時(shí)差異表達(dá)基因有2755個(gè)，其中上調(diào)DEGs和下調(diào)DEGs的數(shù)量分別為1713和1042個(gè)；接種7d時(shí)差異表達(dá)基因有3037個(gè)，其中上調(diào)DEGs和下調(diào)DEGs的數(shù)量分別為2032個(gè)和1005個(gè)。分別對(duì)接種后不同時(shí)間點(diǎn)感病品種徐薯18中長(zhǎng)喙殼菌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與S1進(jìn)行比較分析可以看出，接種1d時(shí)差異表達(dá)基因有1918個(gè)，其中上調(diào)DEGs和下調(diào)DEGs的數(shù)量分別為901和1017個(gè)；接種3d時(shí)差異表達(dá)基因有2601個(gè)，其中上調(diào)DEGs和下調(diào)DEGs的數(shù)量分別為1625和976個(gè)；接種7d時(shí)差異表達(dá)基因有2989個(gè)，其中上調(diào)DEGs和下調(diào)DEGs的數(shù)量分別為1957個(gè)和1032個(gè)（圖2G）。

R1～R4和S1～S4見(jiàn)表1注。R1-1～R1-3分別表示R1樣品的3次生物學(xué)重復(fù)，R2-1～R2-3分別表示R2樣品的3次生物學(xué)重復(fù)，R3-1～R3-3分別表示R3樣品的3次生物學(xué)重復(fù)，R4-1～R4-3分別表示R4樣品的3次生物學(xué)重復(fù);S1-1～S1-3分別表示S1樣品的3次生物學(xué)重復(fù)，S2-1～S23分別表示S2樣品的3次生物學(xué)重復(fù)，S3-1～S3-3分別表示S3樣品的3次生物學(xué)重復(fù)，S4-1～S4-3分別表示 S4樣品的3次生物學(xué)重復(fù)。

圖1樣本相關(guān)性熱圖

Fig.1Sample correlationheat map analysis

2.3 DEGs的GO功能富集

GO功能富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)喙殼菌接種至南京92薯塊后第1d、第3d和第7d，生物過(guò)程（BP）類(lèi)別分別富集了630個(gè)、782個(gè)和818個(gè)DEGs；在分子功能（MF）類(lèi)別中，分別富集了532個(gè)、670個(gè)和687個(gè)DEGs；在細(xì)胞組分（Cellularcomponent，CC）類(lèi)別中，分別富集了462個(gè)、579個(gè)和595個(gè)DEGs。長(zhǎng)喙殼菌接種至徐薯18薯塊后第1d、第3d和第7d，BP類(lèi)別分別富集到556個(gè)、697個(gè)和766個(gè)DEGs;MF類(lèi)別分別富集到458個(gè)、588個(gè)和648個(gè)DEGs；CC類(lèi)別分別富集到406個(gè)507個(gè)和541個(gè)DEGs。這些DEGs在GO功能分類(lèi)中，BP類(lèi)別主要包含生物進(jìn)程（Cellularprocess）代謝進(jìn)程（Metabolicprocess）和單一生物進(jìn)程（Single-organismprocess）等，MF類(lèi)別主要涉及催化活性（catalyticactivity）和結(jié)合（binding），而CC類(lèi)別中主要包括細(xì)胞（cell）細(xì)胞部分（cellpart）和細(xì)胞器（organelle）等條目，且長(zhǎng)喙殼菌接種至徐薯18薯塊后這些差異表達(dá)基因的隸屬類(lèi)別與長(zhǎng)喙殼菌接種至南京92薯塊后具有相似性，但是也存在一定的差異，比如屬于BP類(lèi)別的細(xì)胞進(jìn)程的DEGs在接種至抗病品種薯塊上上調(diào)數(shù)目和下調(diào)數(shù)目相當(dāng)，而在接種至感病品種薯塊上下調(diào)數(shù)目高于上調(diào)數(shù)目（圖3、圖4）。

圖2差異表達(dá)基因火山圖以及不同處理間差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)結(jié)果

Fig.2Volaoagfiereallepredgesdtaistalesultsofietiallexpeedesetdittat ments

R1～R4和S1～S4見(jiàn)表1注。A、B、C分別代表與R1相比，R2、R3和R4差異表達(dá)基因火山圖;D、E、F分別代表與S1相比，S2、S3和S4差異表達(dá)基因火山圖；G代表不同處理間差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)結(jié)果。 FDR ：錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率； FC ：變化倍數(shù)。

2.4 DEGs的KEGG通路富集

為深入探討DEGs的功能，本研究對(duì)DEGs進(jìn)行KEGG通路富集分析，總體來(lái)看，富集最多的是代謝途徑，其次是遺傳信息加工途徑，然后是細(xì)胞加工途徑。圖5分別為富集最顯著的10條KEGG通路，長(zhǎng)喙殼菌接種至抗病品種南京92薯塊后第1d富集的主要通路有代謝途徑、次生代謝物的生物合成、抗生素生物合成、真核生物核糖體的生物合成以及淀粉和糖代謝等（圖5A），接種后第3d富集到的通路主要有代謝途徑、次生代謝物的生物合成、真核生物核糖體的生物合成以及嘧啶代謝等（圖5B），接種后第7d富集到的通路主要有代謝途徑、真核生物核

A：R2與R1相比GO功能富集的DEGs;B：R3與R1相比GO功能富集的DEGs;C：R4與R1相比GO功能富集的 DEGs_? 糖體的生物合成、嘧啶代謝、蛋白酶體等（圖5C）；長(zhǎng)喙殼菌接種至感病品種徐薯18薯塊后第1d富集的主要通路有代謝途徑、次生代謝物的生物合成和抗生素的生物合成等（圖5D），第3d富集到的通路主要是代謝途徑、真核生物核糖體的生物合成等（圖5E）；第7d富集到的通路主要為代謝途徑，但次生代謝物的生物合成的差異表達(dá)基因數(shù)量比第3d明顯增多（圖5F）?？傮w來(lái)講，這些通路主要為碳水化合物、氨基酸、核苷酸代謝以及遺傳信息加工等，與長(zhǎng)喙殼菌自身的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖以及侵染薯塊的過(guò)程中破除寄主防御系統(tǒng)等密切相關(guān)。此外，本研究還分別比較分析了長(zhǎng)喙殼菌接種至不同品種薯塊相同時(shí)間點(diǎn)之間的差異表達(dá)基因及富集到的通路差異，結(jié)果表明，長(zhǎng)喙殼菌接種至兩個(gè)品種薯塊的相同時(shí)間點(diǎn)，差異表達(dá)基因非常少，據(jù)此推測(cè)，長(zhǎng)喙殼菌在抗黑斑病甘薯品種和感黑斑病甘薯品種中侵染過(guò)程和機(jī)理相對(duì)一致。

圖3與R1相比R2、R3、R4的GO功能富集分類(lèi)二級(jí)柱狀圖

ig.3Comparative GO functional enrichment bar charts at level-2 subcategories for R2，R3 and R4 versus

2.5長(zhǎng)喙殼菌致病關(guān)鍵基因的篩選和分析

通過(guò)維恩圖分析，篩選到長(zhǎng)喙殼菌接種至南京92薯塊不同時(shí)間點(diǎn)共有DEGs為1545個(gè)（圖6A），接種至徐薯18薯塊不同時(shí)間點(diǎn)的共有DEGs有1116個(gè)（圖6B），進(jìn)一步將這兩組基因集進(jìn)行維恩圖分析，得到925個(gè)共有DEGs（圖6C），對(duì)這925個(gè)共有DEGs進(jìn)行KEGG聚類(lèi)分析，發(fā)現(xiàn)這些DEGs主要富集到代謝通路中，如碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、輔因子和維生素代謝、核苷酸代謝以及能量代謝等途徑中（圖7）。

A：S2與S1相比GO功能富集的DEGs;B：S3與S1相比GO功能富集的DEGs;C：S4與S1相比GO功能富集的 DEGs

□上調(diào);口下調(diào)

圖4與S1相比S2、S3、S4的GO功能富集分類(lèi)二級(jí)柱狀圖

Fig.4Comparative GO functional enrichment bar charts at level-2 subcategories for S2，S3and S4 versus S1

將這925個(gè)共有DEGs進(jìn)一步篩選，得到相對(duì)表達(dá)量高于1.00、持續(xù)上調(diào)表達(dá)并且差異表達(dá)倍數(shù)達(dá)到40倍以上的關(guān)鍵致病相關(guān)基因共有20個(gè)（表2），這些基因主要涉及與轉(zhuǎn)座酶相關(guān)、CF-IPO蛋白質(zhì)、MFS單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、核糖核酸酶Z1、維西考林還原酶、ATP酶家族、6-磷酸葡萄糖酸磷酸酶、糖原-1、木質(zhì)素酶LG5 、L? -氨基酸氧化酶、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)多銅氧化酶FET3、二氫吡啶甲酸合成酶家族蛋白質(zhì)、果膠裂解酶以及一些假定蛋白質(zhì)。

3討論

長(zhǎng)喙殼菌侵染甘薯引起的黑斑病嚴(yán)重影響甘薯的產(chǎn)量和品質(zhì)，然而其致病機(jī)理至今尚不明確。本研究以抗甘薯黑斑病的南京92和感甘薯黑斑病的徐薯18兩個(gè)甘薯品種為試驗(yàn)材料，采用人工接種長(zhǎng)喙殼菌并于不同時(shí)間取樣，采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與R1相比，R2、R3、R4長(zhǎng)喙殼菌中上調(diào)表達(dá)的DEGs分別有1124個(gè)、1713個(gè)、2032個(gè)，下調(diào)的DEGs分別有869個(gè)、1042個(gè)、1005個(gè)；與S1相比，S2、S3、S4長(zhǎng)喙殼菌中上調(diào)的DEGs分別有901個(gè)、1625個(gè)、1957個(gè)，下調(diào)DEGs分別為1017個(gè)、976個(gè)、1032個(gè)，對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GO功能富集分析結(jié)果表明，差異表達(dá)基因主要富集于生物過(guò)程類(lèi)別的生物進(jìn)程、代謝進(jìn)程、單一生物過(guò)程等；KEGG通路富集的主要通路為代謝途徑，這與羅勤川[的研究結(jié)果較為一致，表明病原菌侵染植物過(guò)程中，破除寄主植物的防御系統(tǒng)、侵入寄主體內(nèi)以及在寄主體內(nèi)定殖增殖等環(huán)節(jié)具有相似性。

A：長(zhǎng)喙殼菌接種至南京92薯塊不同時(shí)間點(diǎn)差異表達(dá)基因的維恩圖;B：長(zhǎng)喙殼菌接種至徐薯18 薯塊不同時(shí)間點(diǎn)差異表達(dá)基因的維恩圖;C：A與B中共有差異表達(dá)基因的維恩圖。

圖7925個(gè)共有差異表達(dá)基因（DEGs）的KEGG通路富集分析 Fig.7KEGG pathway enrichment analysis of 925 common differentially expressd genes （DEGs）

植物細(xì)胞壁是植物應(yīng)對(duì)病原菌侵染的第一道屏障，病菌分泌大量細(xì)胞壁降解酶協(xié)助病原菌侵入植物組織[21]。果膠裂解酶是細(xì)胞壁降解酶之一，具有軟化和分解植物細(xì)胞壁和組織等功能[22-23]，果膠裂解酶作為毒力因子，在侵染植物的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。許春景等[24]采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病病菌果膠裂解酶基因Vmpl4在野生菌株與寄主互作過(guò)程中的表達(dá)水平，結(jié)果表明，Vmpl4基因在病菌侵染過(guò)程中呈上調(diào)表達(dá)；王嘉欣[25]研究發(fā)現(xiàn)，接種膠孢炭疽菌至忙果果實(shí)后膠孢炭疽菌 PL 基因表達(dá)均在接種后第3d、第5d顯著上調(diào)。本研究中， PlyA 基因在長(zhǎng)喙殼菌侵染甘薯過(guò)程中持續(xù)上調(diào)表達(dá)，且接種第7d，與接種當(dāng)天相比PlyA的表達(dá)量上調(diào)高達(dá)40.64倍，與前人研究結(jié)果一致。此外，姜明等[26]研究發(fā)現(xiàn)，敲除大麗輪枝菌的果膠裂解酶基因VdPL1-4，棉花黃萎病發(fā)病率顯著下降；閆淼等[27]研究發(fā)現(xiàn)，分別敲除甜瓜枯萎病病菌果膠裂解酶基因FopLb、FopLe、FopL1和FopL2，突變體菌株△Fo-pLb 和 Δ FopL1幾乎不產(chǎn)生孢子，致病力明顯降低；洪坤奇等[28]研究發(fā)現(xiàn)，敲除蘋(píng)果輪紋病病菌果膠裂解酶基因Bdpl1后，對(duì)離體蘋(píng)果枝條致病力沒(méi)有減弱。這些研究結(jié)果表明，不同的果膠裂解酶基因家族成員在功能上存在差異，對(duì)寄主的致病性也存在差異。本研究中長(zhǎng)喙殼菌PlyA基因在侵染甘薯的過(guò)程中持續(xù)顯著上調(diào)表達(dá)，該基因是否參與致病力調(diào)控有待進(jìn)一步深入研究。

表2篩選出長(zhǎng)喙殼菌關(guān)鍵致病基因及功能描述 Table 2Screened key pathogenicity-asociated genes in Ceratocystis fimbriata and their functional annotations

R1～R4見(jiàn)表1注。

本研究篩選出致病關(guān)鍵基因共20個(gè)，除了上述討論的果膠裂解酶基因之外，還涉及與轉(zhuǎn)座酶相關(guān)基因、CF-IPO蛋白基因、MFS單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、核糖核酸酶Z1基因、維西考林還原酶基因、ATP酶家族基因、6-磷酸葡萄糖酸磷酸酶基因、糖原-1基因、木質(zhì)素酶LG5基因 ??L -氨基酸氧化酶基因、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)多銅氧化酶FET3基因、二氫吡啶甲酸合成酶家族蛋白質(zhì)基因，這些關(guān)鍵基因在長(zhǎng)喙殼菌侵染甘薯的過(guò)程中均是持續(xù)顯著高表達(dá)，特別是與轉(zhuǎn)座酶相關(guān)基因和CF-IPO蛋白基因在接種第7d上調(diào)表達(dá)超過(guò)1000倍，有可能是非常關(guān)鍵的致病基因，后續(xù)將進(jìn)一步明確其功能。

4結(jié)論

本研究對(duì)長(zhǎng)喙殼菌侵染的甘薯塊根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)喙殼菌接種至薯塊后不同時(shí)間的DEGs，通過(guò)GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，初步明確了長(zhǎng)喙殼菌侵染甘薯的致病分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；同時(shí)篩選出與接種當(dāng)天相比表達(dá)量高于1.00、持續(xù)上調(diào)表達(dá)并且差異表達(dá)倍數(shù)在40倍以上的關(guān)鍵致病基因20個(gè)。后續(xù)將進(jìn)一步結(jié)合通路和基因注釋?zhuān)瑢?duì)關(guān)鍵致病基因進(jìn)行分子克隆和功能研究，并對(duì)相應(yīng)的蛋白質(zhì)功能以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行深入研究，從而明確其致病分子機(jī)制。

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（責(zé)任編輯：黃克玲）

收稿日期：2024-10-11

基金項(xiàng)目：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項(xiàng)目（CARS-1O）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（32001599）

作者簡(jiǎn)介：楊冬靜（1983-），女，四川射洪人，博士，副研究員，主要從事植物病理學(xué)研究。（E-mail）njnd831215@126.com

通訊作者：謝逸萍，（E-mail） xieyiping6216@163.com