乙酰唑胺對(duì)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊及其鈣化作用

[關(guān)鍵詞] 動(dòng)脈粥樣硬化；血管鈣化；碳酸酐酶II；乙酰唑胺；小鼠，近交C57BL[中圖分類號(hào)] R361.1；R977.3 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A [文章編號(hào)] 2096-5532（2025）03-0376-05doi：10.11712/jms.2096-5532.2025.61.093 [開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）][網(wǎng)絡(luò)出版] https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20250724.1505.003；

2025-07-24 17：42：05

Effects of acetazolamide on atherosclerotic plaque formation and calcification in miceLIU Han ，AN Yi （Department of Cardiology，The Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266oo3，China）

[Abstract]ObjectiveToinvestigate the efects of acetazolamideonatherosclerotic plaque formationand vascularcalcification in mice. MethodsFour-week-old Apoe^-/-（n=3） and wild-type （ n=3 ） C57BL/6 mice were fed for 21 weeks，and subsequently，body weight and serum lipid levels were compared. Twelve l2-week-old Apoe^-/- mice were divided into control group （ n=8 ，given normal saline） and experimental group （ ，given acetazolamide at 40mg/kg .After 2 weeks of treatment，aortic tissues wereharvestedtoevaluate plaquearea withHEstaining，characterizelipidcomposition withOilRedOstaining，measure calcium content using calcium assay kits，and determine the expression of carbonic anhydrase I （CA2）by Western blot. Results Apoe^-/- mice exhibited significantly higher body weight and serum lipid levels than wild-type mice （F=24.15-61.24，t=2.891- 7.229，Plt;0.05） . At 3 months of age， plaque area，calcium content，and CA2 expression in aortic tissues were significantly increased in Apoe^-/- mice （t=2.872-13.360，Plt;0.05） .Compared with controls，acetazolamide-treated Apoe^-/- mice showed significantly reduced CA2 expresson，lipid-rich necrotic core area，and calcification severity （t=3.820-9.701，Plt;0.05） .ConclusionAcetazolamide attenuates atherosclerotic plaque formationand caleification by suppressing CA2 expressioninmice.

[Key words]atherosclerotic；vascular calcification；carbonic anhydrase II；acetazolamide；mice，inbred C57BL

冠心病是一種常見的心血管疾病，其病因是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成導(dǎo)致的血管狹窄與血管鈣化，全球每年因其而死亡病人高達(dá)1700萬[1]。血管鈣化是疾病進(jìn)展的關(guān)鍵標(biāo)志，與斑塊不穩(wěn)定性密切相關(guān)[2-4]。研究表明，碳酸酐酶Ⅱ（CA2）可通過催化碳酸氫鹽形成促進(jìn)鈣鹽沉積，在血管鈣化中發(fā)揮潛在作用[5-6]。一項(xiàng)個(gè)體比較研究顯示，CA2 在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中表達(dá)升高，其與血管鈣化也密切相關(guān)[8]。然而，CA2在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊鈣化中的調(diào)控機(jī)制尚未明確，且CA2抑制劑（如乙酰唑胺）能否干預(yù)鈣化過程仍有待驗(yàn)證。因此，本研究以Apoe基因缺失 （Apoe^-/- ）小鼠為動(dòng)脈粥樣硬化模型，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探究乙酰唑胺對(duì)主動(dòng)脈斑塊組織CA2表達(dá)和動(dòng)脈鈣化的影響，旨在為冠狀動(dòng)脈斑塊形成和血管鈣化的藥物干預(yù)提供新的靶點(diǎn)。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別選擇1對(duì)品系為 C57BL/6 的4周齡 Apoe^-/- 模型小鼠及同周齡野生型（WT）小鼠進(jìn)行繁育，種鼠均由賽業(yè)（蘇州）生物科技有限公司提供。小鼠分籠飼養(yǎng)，房間室溫保持 23～25°C ，環(huán)境明暗交替周期為 ^12h ，小鼠自由獲取飼料和水。小鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境1周。

1.1.2分組及給藥待模型小鼠繁育至12只、野生型小鼠至5只時(shí)可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將模型小鼠分為兩組，其中對(duì)照組8只，實(shí)驗(yàn)組4只。實(shí)驗(yàn)組每2d給予乙酰唑胺 （40mg/kg） 尾靜脈注射1次，對(duì)照組注射等量生理鹽水，兩組均持續(xù)2周。

1.1.3主要試劑蘇木精-伊紅（HE）染液和油紅O染料均由賽維爾生物技術(shù)有限公司提供。兔源抗CA2一抗和羊抗兔CA2二抗均購于正能生物技術(shù)有限公司。RIPA裂解液和SDS-PAGE電泳液均購于上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司。PVDF膜購于密理博中國(guó)有限公司。乙酰唑胺購于美國(guó)麥克化學(xué)公司。其他實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純，購自國(guó)產(chǎn)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1組織切片和染色取小鼠主動(dòng)脈組織，按照文獻(xiàn)的方法9進(jìn)行組織標(biāo)本固定、石蠟包埋、HE染色和油紅O染色。

1.2.2鈣離子（ ?Ca²⁺ ）含量檢測(cè)取小鼠主動(dòng)脈組織剪碎，按照S1063S型鈣含量顯色檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）說明書的步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。取裂解液上清進(jìn)行BCA濃度測(cè)定，計(jì)算每微克蛋白中 Ca²⁺ 的質(zhì)量，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示。

1.2.3蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）檢測(cè)分別取動(dòng)脈的斑塊組織和正常組織，按照文獻(xiàn)方法[10]進(jìn)行組織裂解和Westernblot檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPadPrism9軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料數(shù)據(jù)以 表示，兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本 Ψ_tΨ_Ψ 檢驗(yàn)。采用雙因素重復(fù)測(cè)量方差分析評(píng)估野生型與模型小鼠體質(zhì)量隨飼養(yǎng)時(shí)間的變化，在交互效應(yīng)顯著的前提下進(jìn)行簡(jiǎn)單效應(yīng)分析，并對(duì) P 值進(jìn)行Bonferroni校正。以Plt;0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1野生型和模型小鼠相關(guān)表型指標(biāo)比較

重復(fù)測(cè)量方差分析顯示，兩型小鼠體質(zhì)量比較的時(shí)間和組別主效應(yīng)及其交互效應(yīng)均顯著 （= 8 . 5 1 8 ， P 均 lt;0.05） °模型小鼠體質(zhì)量在 _9～21 周齡均顯著高于野生型小鼠 （F_（1，4）=24.15～61.24 ，Bonferroni校正 P 均 lt; 0.05）。見圖 1A 。血脂分析顯示，模型小鼠血液中總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）和低密度脂蛋白（LDL）均明顯高于野生型，而高密度脂蛋白（HDL）則顯著低于野生型 （t=2.891～7.229，P 均 lt;0.05） 見圖1B。與野生型小鼠相比較，模型小鼠斑塊面積與主動(dòng)脈竇面積之比值（斑塊相對(duì)面積）為 （29.8± 3.8）% ，明顯高于野生型小鼠的 （0.8±0.2）% ，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=13.360，Plt;0.001） 。見圖1C和D。以上數(shù)據(jù)提示，動(dòng)脈粥樣硬化模型的成功建立不僅表現(xiàn)為血脂異常，更直接表現(xiàn)為主動(dòng)脈斑塊形成的病理特征，證實(shí) Apoe^-/- 小鼠是研究斑塊鈣化的可靠模型。

2.2 兩型小鼠主動(dòng)脈組織 Ca²⁺ 和CA2表達(dá)比較

模型小鼠主動(dòng)脈組織中 Ca²⁺ 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.1±0.5 ，明顯高于野生型小鼠的 0.2±0.1 ，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=2.872，Plt;0.05） 。見圖2。通過Protein Atlas數(shù)據(jù)庫（www.proteinatlas.org）分析CA2蛋白在心臟各類型組織細(xì)胞中的表達(dá)顯示，CA2蛋白在血管內(nèi)皮細(xì)胞中具有較高的表達(dá)水平。Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，模型小鼠主動(dòng)脈斑塊組織中CA2蛋白相對(duì)表達(dá)量為 （7.0±3.6）% .顯著高于野生型的 （1.0±0.1）% ，差異具有顯著性1 （t=2.937，Plt;0.05） 。見圖3A和B。以上數(shù)據(jù)表明，CA2蛋白表達(dá)水平與血管鈣化程度呈正相關(guān)，提示CA2可能通過促進(jìn)鈣鹽沉積（如催化 HCO₃^- 與 Ca²⁺ 結(jié)合）參與斑塊組織鈣化的病理進(jìn)程。

2.3 乙酰唑胺對(duì)主動(dòng)脈斑塊組織CA2表達(dá)和鈣化程度影響

Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠主動(dòng)脈斑塊組織CA2蛋白相對(duì)表達(dá)量為 0.1±0.2 ，明顯低于對(duì)照組的 1.0±0.1 ，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ ?_t= 9.701，Plt;0.001） 。見圖4。實(shí)驗(yàn)組小鼠油紅O染色面積（脂質(zhì)壞死核心面積）與主動(dòng)脈根部面積之比（斑塊相對(duì)面積）為 （6.0±2.5）% ，明顯低于對(duì)照組的 （14.6±3.0）% ，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ .Plt;0.05） 。見圖5A和 B 。實(shí)驗(yàn)組小鼠主動(dòng)脈斑塊組織中 Ca²⁺ 含量顯著低于對(duì)照組 （Plt;0.01） 。見圖5C 。以上結(jié)果說明，乙酰唑胺可能通過特異性抑制CA2活性，阻斷鈣化反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)斑塊組織鈣化與脂質(zhì)沉積的干預(yù)，提示CA2可能是調(diào)控血管鈣化的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

3討論

在全球范圍內(nèi)，冠心病是一類高發(fā)且死亡率較

A：兩型小鼠不同周齡體質(zhì)量比較;B：兩型小鼠血脂濃度比較;C：小鼠主動(dòng)脈組織HE染色觀察（標(biāo)尺長(zhǎng)度 200μm ;D：兩型小鼠主動(dòng)脈玟塊相對(duì)面積比較。WT：野生型小鼠； Apoe^-/- 0 Aρoe 基因缺失模型小鼠。 n=3 ;與野生型小鼠比較， ， ， ^***Plt;0.001 0

圖1野生型和模型小鼠相關(guān)表型指標(biāo)比較

高的疾病，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。冠心病主要發(fā)病原因是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致心臟血液供應(yīng)不足[11-12]。因此，探究如何更好地抑制或緩解冠狀動(dòng)脈硬化對(duì)冠心病的治療具有重要意義。冠狀動(dòng)脈鈣化是其硬化發(fā)展到一定程度后的病理改變，主要表現(xiàn)為在硬化斑塊中有鈣鹽沉積。冠狀動(dòng)脈鈣化往往被認(rèn)為是疾病進(jìn)展的表現(xiàn)，在一定程度上可定量反映冠狀動(dòng)脈硬化的程度[13-14]

機(jī)體內(nèi)的碳酸酐酶是一類能夠可逆催化 CO₂ 生成 HCO₃^- 離子的鋅酶，廣泛分布于紅細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、胃壁細(xì)胞、胰腺腺泡細(xì)胞、中樞神經(jīng)細(xì)胞和睫狀體上皮細(xì)胞等[15]。碳酸酐酶家族具有多種同工酶，它們具有一定的組織特異性。在多種代謝活動(dòng)中，碳酸酐酶均發(fā)揮重要功能，比如軟骨形成、纖維化和體液代謝等[16-17]。因此，碳酸酐酶表達(dá)或功能異常可引發(fā)多種疾病。研究已發(fā)現(xiàn)，碳酸酐酶是一種藥理性靶點(diǎn)，在臨床中碳酸酐酶抑制劑已被用于治療多種疾病，如青光眼、阻塞性睡眠呼吸暫停、高原疾病、癲癇和代謝堿中毒等[18-19]。由于碳酸酐酶可催化 HCO₃^- 離子的形成，而 Ca²⁺ 在細(xì)胞內(nèi)可與其結(jié)合形成碳酸鹽沉淀[20]，因此，碳酸酐酶在血管鈣化中也發(fā)揮重要功能，但其對(duì)冠狀動(dòng)脈鈣化的影響目前仍不清楚。此外，靶向CA2的藥理學(xué)干預(yù)能否在活體模型中逆轉(zhuǎn)鈣化進(jìn)程，尚未得到系統(tǒng)驗(yàn)證。本研究在 Apoe^-/- 小鼠模型中證實(shí)，乙酰唑胺干預(yù)2周后，主動(dòng)脈斑塊鈣化程度顯著降低，同時(shí)脂質(zhì)壞死核心面積顯著縮小，這一效應(yīng)與CA2表達(dá)水平下降相關(guān)。該研究結(jié)果可能為臨床抗血管鈣化治療提供新的思路。

本研究以 Apoe^-/- 小鼠為動(dòng)物模型，相關(guān)表型指標(biāo)檢測(cè)顯示，相較于野生型小鼠，模型小鼠體質(zhì)量增大更大，血脂濃度明顯升高，主動(dòng)脈管壁顯著增厚且纖維成分明顯增多，呈現(xiàn)出顯著的主動(dòng)脈粥樣硬化的表現(xiàn)。同時(shí)，模型鼠硬化的主動(dòng)脈組織中 Ca²⁺ 水平明顯升高，表明組織鈣化參與主動(dòng)脈硬化進(jìn)程。Westernblot檢測(cè)結(jié)果表明，模型小鼠主動(dòng)脈斑塊組織CA2表達(dá)水平顯著升高。由于碳酸酐酶可促進(jìn)碳酸鹽沉淀的形成，因此，我們猜測(cè)冠狀動(dòng)脈鈣化也可能與CA2表達(dá)水平上調(diào)和活性升高有關(guān)。為

A：兩型小鼠主動(dòng)脈組織中CA2蛋白表達(dá)的電泳圖;B：兩型小鼠主動(dòng)脈組織CA2蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較。WT：野生型小鼠； Apoe^-/- Apoe 基因缺失模型小鼠。 ①～⑥ 為樣本編號(hào)。 n=3 ；與野生型小鼠比較， 。

圖3兩型小鼠主動(dòng)脈組織中CA2蛋白表達(dá)的比較

A：乙酰唑胺對(duì)模型小鼠主動(dòng)脈斑塊組織CA2蛋白表達(dá)影響的電泳圖;B：兩組小鼠主動(dòng)脈斑塊組織CA2蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較。 ① ～ ⑧ 為樣本編號(hào)。 n=4 ;與對(duì)照組小鼠比較， ^***Plt;0.001 。

圖5乙酰唑胺對(duì)模型小鼠主動(dòng)脈斑塊面積和鈣化程度影響

A：兩組小鼠主動(dòng)脈根部油紅O染色（標(biāo)尺長(zhǎng)度 200μm） 比較;B：兩組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊相對(duì)面積比較;C：兩組小鼠主動(dòng)脈斑塊組糾Ca²⁺ 相對(duì)含量比較。 n=3 ;與對(duì)照組小鼠比較， ^**Plt;0.01 。

進(jìn)一步明確該猜想，我們對(duì)模型小鼠進(jìn)行了尾靜脈注射碳酸酐酶抑制劑乙酰唑胺干預(yù)的觀察。本研究結(jié)果顯示，乙酰唑胺可明顯下調(diào)模型小鼠主動(dòng)脈斑塊組織CA2的表達(dá)；同時(shí)其主動(dòng)脈斑塊組織鈣化水平明顯下降，斑塊的面積也明顯減小。

由于乙酰唑胺的治療機(jī)制在于阻斷鈣化過程的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，不同于臨床常用的雙膦酸鹽類藥物（主要通過吸附羥基磷灰石抑制鈣鹽沉積[21]），乙酰唑胺通過特異性結(jié)合CA2活性中心的鋅離子，抑制其催化 HCO₃^- 生成的能力，從而減少碳酸鈣沉淀的底物供應(yīng)。值得注意的是，本研究還觀察到斑塊脂質(zhì)核心縮小與CA2抑制顯著相關(guān)，提示CA2可能通過調(diào)節(jié)局部微環(huán)境pH值影響脂質(zhì)氧化穩(wěn)定性，這種效應(yīng)在既往研究中尚未見報(bào)道。陳景娣等[22]的研究表明，乙酰唑胺在癲癇大鼠模型中通過調(diào)節(jié)血鉀、血鈣濃度減輕神經(jīng)興奮性。然而，該效應(yīng)源于全身性電解質(zhì)平衡改變，并未涉及組織特異性機(jī)制。而本實(shí)驗(yàn)在動(dòng)脈粥樣硬化模型中揭示了乙酰唑胺選擇性作用于血管內(nèi)皮富集的CA2，使斑塊局部 Ca²⁺ 濃度降低，表明其直接抑制血管鈣化而非全身鈣調(diào)節(jié)。本研究中CA2除了抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊鈣化外，還可同步減少斑塊脂質(zhì)壞死核心面積，而此效應(yīng)在癲癇模型中則未被觀察到。

從轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)角度看，乙酰唑胺的應(yīng)用價(jià)值主要體現(xiàn)在兩方面。首先是高危人群干預(yù)窗口前移。糖尿病和慢性腎病病人的冠狀動(dòng)脈鈣化發(fā)生率較高，但現(xiàn)有干預(yù)手段多在鈣化晚期啟動(dòng)。本研究在動(dòng)物模型中實(shí)現(xiàn)了2周內(nèi)快速起效，提示早期藥物干預(yù)可能阻斷亞臨床鈣化進(jìn)展。其次是聯(lián)合治療策略優(yōu)化。鑒于他汀類降血脂藥物可顯著降低斑塊組織脂質(zhì)含量[23]，若與乙酰唑胺聯(lián)用，可能通過協(xié)同作用提升斑塊穩(wěn)定性。其中，他汀類藥物可降低斑塊脂質(zhì)核心破裂風(fēng)險(xiǎn)，而乙酰唑胺可降低斑塊的鈣化程度，二者聯(lián)合應(yīng)用可靶向斑塊的不同病理組分。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，CA2在主動(dòng)脈斑塊及其鈣化組織中高表達(dá)，而乙酰唑胺可通過下調(diào)CA2的表達(dá)而抑制主動(dòng)脈斑塊面積增大及其鈣化程度，進(jìn)而表現(xiàn)出良好的治療潛力，這有可能為冠心病的治療提供新的途徑。但是，本研究也存在一定局限性，例如觀察周期較短，長(zhǎng)期用藥的安全性與耐受性也需進(jìn)一步驗(yàn)證；另外，未區(qū)分主動(dòng)脈不同節(jié)段的鈣化敏感性差異，后續(xù)可結(jié)合Micro-CT分層進(jìn)行更深入的分析。

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