超聲對PC12細胞的調(diào)控及對6-OHDA誘導的帕金森病小鼠模型運動行為的影響

[關鍵詞」 帕金森病；超聲波；PC12細胞；黑質(zhì)；小鼠；運動活動[中圖分類號]R338.2 [文獻標志碼］A [文章編號] 2096-5532（2025）03-0322-05doi：10.11712/jms.2096-5532.2025.61.076 [開放科學（資源服務）標識碼（OSID）][網(wǎng)絡出版]https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20250709.1559.003； 2025-07-10 14：18：01

Regulatory effects of ultrasoud onPC12cels and motorbhaviors of mouse modelof 6-OHDA-induced Parkinson’sdiseaseZHONG Guangjun，JIA Guorui，ZHAODi，XIEJunxia（Department of Physiologyand Pathophysiology，School of Basic Medicine， Qingdao Medical College of Qingdao University，Qingdao 266o71，China）

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of ultrasound（US）on pheochromocytoma （PC12）celsand the motor behaviorsofamousemodelof6-hydroxydopamine（6-OHDA）inducedParkinson'sdisease.MethodsPC12celsweredividedinto control group and US group （stimulated with US），and the Ca²⁺ fluorescence intensity of the cells in the two groups was measured. C57BL/6J mice were divided into control group，model group，and US group to receive injection of normal saline，6-OHDA solution，and6-OHDA solutionintothestriatum，respectively；after2weeks，gaitanalysis wasperformedforthethre groups；and then，the US group was given US stimulation for 3d ，followed by gait analysis for the locomotion ability of the mice.Results PC12 cells in the US group showed a significant increase in the fluorescence intensity of Ca²⁺ than those in the control group （t= 3.071，Plt;0.05） . Compared with the model group，the mice in the US group showed a significantlylarger maximum contact area of the paws ?F=2.99，q=2.410，Plt;0.05） and a significantly higher movement frequency （F=40.35，q=3.879，Plt;0.01） . In theUS group，the step length of the mice was increased significantly after US stimulation compared with before US stimulation （ 2.636-9.760，Plt;0.05） . The content of tyrosine hydroxylase（TH） in the substantia nigra（SN） of the mice in the US group was significantly increased than that in the model group （F=78.03，q=3.589，Plt;0.05） ）but significantly lower than that in the control group .ConclusionUS can promote Ca²⁺ inflow in PCl2 cells，alleviate the movement disorder of PD mice，and save TH-positive neurons in the SN region.

[Key words]Parkinson disease；ultrasonic waves；PCl2 cells；substantia nigra；mice；motor activity

帕金森病（PD）是一種以黑質(zhì)（SN）內(nèi)多巴胺

（DA）能神經(jīng)元進行性丟失為主要病理學特征的神經(jīng)退行性疾病，其臨床特征有運動遲緩、肌肉強直、靜息性震顫、姿勢跟步態(tài)障礙等[1]。經(jīng)顱磁刺激（TMS）作為一種非侵入性治療PD的腦刺激方法，可以抑制去極化神經(jīng)元的皮質(zhì)興奮，能夠增加紋狀體（Str）DA水平[2-3]。然而，由于空間靶向性與穿透深度有限，導致TMS的使用較少。超聲（US）作為一種新興的外源刺激，具有非侵入性及組織穿透力深等特點[4-5]。US已被證明可以加速骨愈合，促進跟腱、韌帶、軟骨等軟組織再生[，還能夠刺激脾臟膽堿能抗炎通路，可保護腎臟形態(tài)和功能，減輕腎缺血再灌注造成的損傷。在神經(jīng)調(diào)控方面，US可以激活如MscL、MsclG22S、TRPA1等多種機械敏感離子通道[8]，并且能夠降低小鼠大腦中動脈閉塞模型的中性粒細胞表達，能夠減輕大腦炎癥反應[9]。此外，低強度脈沖超聲（LIPUS）能夠增加海馬神經(jīng)元自發(fā)動作電位和自發(fā)興奮性突觸電流頻率和振幅[10]，還可以抑制小鼠炎癥模型中小膠質(zhì)細胞的促炎反應[11]。更重要的是，US刺激PD小鼠模型可在一定程度上恢復Str腦區(qū)中DA含量[5]。因此，US在調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)方面具有重要的潛力。本研究聚焦于探究US刺激對大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC12細胞）及PD小鼠模型的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗細胞及實驗動物本實驗所用的大鼠PC12細胞購自上海富衡生物科技有限公司。實驗動物選用8周齡雄性SPF級 C57BL/6J 小鼠，體質(zhì)量 （23±2）g ，全部購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。將小鼠飼養(yǎng)在有充足食物及水源的清潔環(huán)境中并保證室溫 （23±2）^°C 、濕度 （50±5）% 、晝夜循環(huán)光照（ （12h/12h） 。動物實驗符合青島大學青島醫(yī)學院動物倫理學要求。

1.1.2主要試劑及來源DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司，馬血清以及胎牛血清購自依科賽公司，F(xiàn)lou-4AM購自北京博奧森生物技術公司，6-羥基多巴胺（6-OHDA）、阿撲嗎啡（APO）購自美國Sigma公司，酪氨酸羥化酶（TH）抗體購自美國Millipore公司，驢抗兔綠色熒光二抗購自美國ThermoFisher公司，驢血清購自美國JacksonImmunoResearch公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞實驗分組及處理PC12細胞計數(shù)后接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，培養(yǎng) 24h ，將培養(yǎng)皿中的細胞分為對照組和US組。待細胞密度達到 60% 左右時加入 Fluo-4AMCa²⁺ 探針工作液（取 Ca²⁺ 探針用無血清培養(yǎng)液稀釋至 1mmol/L） ，孵育 30min 后吸出工作液，用磷酸鹽緩沖液洗滌1次后加入過濾除菌的人工腦脊液穩(wěn)定 30min 。

1.2.2光學顯微鏡下觀察細胞熒光強度對US組細胞施加US刺激（強度： 0.4W/cm² ，工作頻率：1MHz ，時長： 10s）^[5] ，立即放于尼康倒置顯微鏡下實時觀察細胞的熒光強度，每間隔5s拍攝記錄細胞的熒光強度，持續(xù)記錄 1min 。

1.2.3實驗動物的分組及PD小鼠模型構建將30只小鼠隨機分成對照組、模型組與US組，每組7～10 只小鼠。通過立體定位注射方法向?qū)φ战M小鼠的Str腦區(qū)（左側 Str 立體定位坐標為前兇前0.4mm 、左旁開 1.5mm 、深度 3.5mm? 注射 2μL 生理鹽水；模型組及US組小鼠腹腔注射地昔帕明溶液 （25mg/kg） ，并分別向兩組小鼠的 Str 腦區(qū)注射 2μL 6-OHDA 溶液（ 2g/L） ，建立PD小鼠模型。注射完成后將頭皮縫合，連續(xù) 10d 向PD小鼠皮下注射乳酸鈉林格注射液，防止PD小鼠脫水致死。

1.2.4US刺激以 2W/cm² 的強度對US組小鼠進行刺激（工作頻率： 1MHz ，時長： 5min^? ，持續(xù) 3d 后進行后續(xù)實驗。

1.2.5 旋轉實驗在6-OHDA注射2周后，小鼠腹腔注射 APO（0.5mg/kg） ；等待 5min 后觀察小鼠有無向健康側“首尾相接”的旋轉行為，并手動記錄10min 內(nèi)小鼠的旋轉圈數(shù)， 10min 內(nèi)旋轉圈數(shù) ?40 圈即視為造模成功，選取造模成功的小鼠進行后續(xù)實驗。在US刺激結束之后再次對小鼠進行旋轉實驗，檢測US是否緩解了US組小鼠SN-Str中的DA損傷。

1.2.6步態(tài)分析實驗采用步態(tài)分析系統(tǒng)（Cat-WalkXT，Noldus，荷蘭）進行檢測。正式實驗前對小鼠進行訓練，使小鼠能夠自主且流暢地穿過固定長度的檢測通道。進行步態(tài)實驗前將所有實驗小鼠放置于步態(tài)實驗室內(nèi)穩(wěn)定 30min 以上。實驗時，小鼠流暢無停頓地跑過完整的通道為1次步態(tài)檢測，每只小鼠最少需要完成5次步態(tài)檢測，從中選取3次步態(tài)檢測結果進行分析。統(tǒng)計每只小鼠4只爪子的長度、寬度，與玻璃板接觸的面積，運動頻率以及步長等與運動相關的指標。

1.2.7免疫印跡實驗實驗小鼠經(jīng)心臟灌注后立即斷頭取腦，迅速摘取SN后加入預冷的RIPA裂解緩沖液，低溫研磨后靜置 30min 。 4^°C 條件下以12 000r/min 離心 30min ，取上清后使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量蛋白樣品，隨后采用濕式轉膜法將蛋白轉移至 0.45μm 孔徑的PVDF膜上。室溫條件下采用 50g/L 脫脂牛奶封閉 ^2h ，依次孵育一抗（TH1：6 000 β -actin 過夜）以及辣根過氧化物酶標記的二抗 （1：10 000 ，室溫 。將蛋白條帶顯影，最終通過圖像分析軟件對目標蛋白（TH）與內(nèi)參 β -actin的灰度值進行定量分析，計算其相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用GraphPadPrism9統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。所有的計量資料數(shù)據(jù)以 表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組均數(shù)比較采用 Ψ_t 檢驗，以 Plt;0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1US刺激對PC12細胞 Ca²⁺ 釋放的影響與對照組相比，US組細胞的 Ca²⁺ 熒光強度顯著升高，在US刺激后2Os熒光強度達到最高，US組與對照組細胞相比差異具有顯著性（ Φ_t=3.071 .Plt;0.05） 。US刺激結束 1min 后，細胞 Ca²⁺ 熒光強度恢復正常。見圖1。

2.2APO 對PD小鼠旋轉行為的影響

對照組小鼠未發(fā)生首尾相接旋轉行為，而模型組與US組小鼠出現(xiàn)了明顯的旋轉行為，且 10min 的旋轉圈數(shù) ?40 圈，提示PD小鼠模型構建成功。

2.3US刺激對PD小鼠DA損傷及運動障礙影響

經(jīng)過US刺激后，US組小鼠APO誘導產(chǎn)生的自發(fā)旋轉圈數(shù)有下降趨勢。與模型組小鼠相比，US組小鼠爪子與玻璃板接觸的最大面積顯著升高（F=2.99，q=2.410，Plt;0.05） ，左后爪的運動頻率顯著增高 （F=40.35，q=3.879，Plt;0.01） 。US組小鼠US后步長較US前明顯增加（ t=2.636～ 9.760，Plt;0.05） 。見圖2。

A：兩組PC12細胞 Ca²⁺ 熒光強度觀察;B：兩組PC12細胞 Ca²⁺ 熒光強度比較。兩組相比， ^*Plt;0.05;n=3 。

圖1兩組PC12細胞 Ca²⁺ 熒光強度變化

圖2各組小鼠US刺激前后運動行為學變化

A：US組小鼠US刺激前后旋轉圈數(shù)比較;B：各組小鼠爪子最大接觸面積比較;C：各組小鼠腳步循環(huán)時間比較;D：US組小鼠US刺激前后步長的比較。ns表示 Pgt;0.05 ;與US組相比， ^*Plt;0.05 ， ^**Plt;0.01 ， ^???Plt;0.001 ;與US前相比， ^?Plt;0.05 。

2.4US刺激對PD小鼠SN中TH表達的影響與模型組相比，US組小鼠SN中的TH表達量明顯升高 （F=78.03，q=3.589，Plt;0.05） ；但與對照組相比，US組小鼠SN的TH含量明顯下降（ 9.821， Plt;0.001） （圖3）。表明US在一定程度上改善了PD小鼠的病理損傷。

圖3各組小鼠SN中TH表達量變化

A：各組小鼠SN中TH表達的免疫印跡檢測；B：各組小鼠SN中TH表達量比較。與US組相比， ^*Plt;0.05，^***Plt;0.001;n=6， 0

3討論

PD是最常見的神經(jīng)退行性疾病之一，這種疾病不僅對病人的生活質(zhì)量產(chǎn)生重大負面影響，而且給社會和經(jīng)濟造成沉重負擔。然而，由于其復雜的病因，目前缺乏安全有效的治療方案[12]。PD目前的手術治療方法包括腦深部電刺激（DBS）[13-14]、左旋多巴卡比多巴腸凝膠治療[15]、TMS等，但這些方法均具有較高的侵入性。

US作為一種新興刺激手段，能夠促進神經(jīng)營養(yǎng)因子的生成、調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞數(shù)量[16]、減少氧化應激[17]、促進神經(jīng)元的再生和修復[18]。US的一個重要參數(shù)是強度。診斷成像應用的US強度范圍為0.05～0.50W/cm^2[19-20] ，US 在手術中的應用強度為 0.2～100.0W/cm² ，高強度聚焦超聲強度可達10000W/cm^2[21] ，US治療可同時應用高、低強度US^[22] 。高強度US主要利用其熱效應[23]，而低強度US的有效性主要依靠非熱效應，包括聲空化和生物信號等。LIPUS是一種特殊類型的US，它以低強度傳輸并以脈沖波的方式輸出，已被證明是一種用于治療的非侵入性物理刺激[24]。LIPUS由于其低強度和脈沖輸出模式而具有最小的熱效應，同時保持聲能向目標組織的傳輸[25-26]。但目前關于US治療PD的研究報道較少，更沒有其對PD作用效果的深入研究。因此本研究探究了LIPUS對PC12細胞和PD小鼠模型運動的影響。中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)末梢去極化時通過囊泡釋放 Ca²⁺ ，從而促進動作電位產(chǎn)生以及調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放[27]， Ca²⁺ 的熒光強度一定程度上代表了US對細胞的調(diào)控作用。本文研究結果表明，US刺激可以促進 Ca²⁺ 內(nèi)流。已有研究結果證明了機械敏感性離子通道蛋白1（Piezo1）是US刺激體外神經(jīng)元的重要介質(zhì)，細胞中的異源Piezol表達可使細胞對US產(chǎn)生反應。小鼠神經(jīng)元細胞內(nèi)源性表達Piezo1，單獨US刺激可以打開機械敏感性離子通道，促進 Ca²⁺ 流人[28]因此認為US刺激PC12細胞使其 Ca²⁺ 熒光強度增加可能是激活了細胞的機械敏感性離子通道。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)US刺激可以緩解PD小鼠的運動障礙，并且可以減緩DA能神經(jīng)元的損傷。SN、Str和丘腦底核（STN）參與基底神經(jīng)核回路，在運動控制中起重要作用[29]。STN神經(jīng)元的異常放電可引起SN腦區(qū)的神經(jīng)毒性，導致 Str 中DA能神經(jīng)元死亡。STN-DBS作為目前治療PD最有效的方法，可以防止SN腦區(qū)中的DA能神經(jīng)元和Str腦區(qū)中TH的丟失，減輕PD病人的運動障礙。本文研究結果表明，經(jīng)過US刺激后，PD小鼠SN腦區(qū)的TH蛋白表達量明顯升高，表明US能夠在一定程度上挽救6-OHDA導致的TH陽性細胞死亡。并且US刺激可以影響STN腦區(qū)中c-Fos陽性神經(jīng)元的數(shù)量。因此認為US刺激影響了小鼠STN腦區(qū)的電活動，繼而抑制了基底核神經(jīng)環(huán)路間接通路，使PD小鼠的運動能力得到顯著提升，同時減緩了DA能神經(jīng)元的死亡。

綜上所述，本研究證明了US刺激對細胞具有一定的調(diào)控作用并且改善了PD小鼠的運動障礙，在一定程度上緩解了PD小鼠SN腦區(qū)的病理損傷。本研究結果為US改善PD運動障礙及病理損傷提供了理論依據(jù)，但沒有對US刺激作用機制進行系統(tǒng)研究。下一步研究將繼續(xù)探究US對細胞以及PD小鼠模型的刺激效果以及刺激機制，以期為無創(chuàng)治療PD提供新的思路。

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（本文編輯 王雪婧）