免疫組織化學實驗關鍵影響因素解析及優化對策

免疫組織化學（IHC）技術在病理診斷與基礎研究中應用廣泛，其結果可靠性依賴于全流程質量控制。實驗流程涵蓋取材固定、脫水透明、切片、抗原修復、抗體孵育及顯色觀察等步驟，各環節的操作規范直接影響實驗成功率。近5年研究顯示，約 42% 實驗偏差源于前處理不當[1。本文根據作者多年的經驗并結合2019—2024年最新文獻與技術規范，詳細解析各個步驟中的關鍵影響因素并提出有效的優化策略。

1取材與固定

取材是實驗的第一步，其質量直接影響到后續實驗結果的可靠性。取材的關鍵在于組織的新鮮程度、大小、固定方式及固定時間。

1.1組織新鮮程度

組織離體后，細胞會迅速發生自溶和腐敗，導致抗原降解或擴散，影響抗原的保存和檢測。組織離體后需在 30min 內浸入足量固定液。離體后2h內未及時固定易導致抗原降解或彌散，HE染色出現細胞核灰染，免疫組化信號減弱甚至丟失[2]。

1.2組織大小

組織塊過大，固定液難以滲透，導致中心部位固定不良；組織塊過小則可能不足以進行多次切片或檢測。一般建議組織塊大小為1 cm×1cm×0.3cm 左右，組織塊不要超過 1.5cm×1.5cm×0.5cm^[2] 。

1.3固定方式

固定方法不當會導致抗原丟失或結構破壞。對于不同的組織和抗原，應選擇合適的固定方法，如靈長類肝組織采用灌注固定聯合浸入固定，較單一方法抗原保存率提升 25%

1.4固定時間

過度固定（ gt;48h ）會因醛基交聯導致抗原表位遮蔽，固定不足則引起組織自溶和抗原彌散，固定時間在12～48h為宜，具體時間應根據組織類型和固定液種類確定。

1.5固定液

IHC固定液推薦 10% 中性緩沖福爾馬林，pH值為7.2～7.4 ，能較好地保存組織形態和抗原性，固定時間需嚴格控制，固定液體積需為組織體積4～10倍，確保充分滲透。

2 脫水、透明和浸蠟[3]

脫水是免疫組化實驗中的重要步驟，脫水不徹底會影響后續透明和浸蠟效果，導致切片質量下降。常用的脫水劑為乙醇，其濃度、脫水時間及溫度是影響脫水效果的關鍵因素。

2.1脫水溫度

脫水溫度過高會導致組織快速收縮，影響組織結構的完整性。脫水溫度過低則可能導致脫水不徹底，脫水溫度一般控制在室溫或略高于室溫，避免高溫導致的組織快速收縮。

2.2乙醇濃度及脫水時間

脫水時間過短會導致脫水不徹底，影響組織的透明度和切片質量；脫水時間過長則可能引起組織過度收縮，影響組織結構。需遵循梯度酒精脫水（ 70%～10% ），每級停留時間依組織類型調整（如肝、腎組織 30min 級，淋巴組織，確保水分完全置換。

2.3脫水劑

不同的脫水劑對組織的收縮作用不同，應根據組織類型和目標抗原的特性選擇合適的脫水劑，對于大多數組織，乙醇是常用的脫水劑。

2.4透明及浸蠟

二甲苯透明時間過長會導致組織硬化發脆，推薦時間為 1～2h ；浸蠟選擇 56～58^°C 低熔點石蠟，浸蠟3次共 2～3h ，避免高溫（ gt;65°C ）破壞抗原結構。

3切片制備

切片是免疫組化實驗中的關鍵步驟，其質量直接影響到抗原檢測的準確性和可靠性。切片不當會導致組織結構破壞、抗原丟失或分布不均。切片的厚度、刀片的質量以及切片機的性能都會影響切片的質量。

3.1切片厚度

切片過厚會導致抗原分布不均，會影響抗原的暴露和抗體的穿透，導致背景加深；切片過薄，則容易破碎，不利于操作和觀察，可能導致抗原信號減弱。常規石蠟切片 3～5μm ，淋巴結、腎等致密組織 2～4μm 腦等疏松組織 6～8μm ，冰凍切片 10～15μm （2號

3.2切片速度

切片速度過快會導致組織拉伸或斷裂，影響組織結構的完整性；切片速度過慢則可能導致組織受熱，影響抗原的保存。根據組織類型和切片厚度調整切片速度，確保切片平整、無拉伸或斷裂。

3.3切片刀角度

建議切片刀角度為 15～30^° 。組織皺褶和刀痕是切片制備中常見的問題。應根據組織類型和切片需求調整切片刀角度，確保切片平整、均勻，在切片過程中保持組織的平整和穩定。

4烤片與脫蠟

烤片需嚴格控制溫度和時間，高溫或長時間烘烤會加速抗原氧化。一般在60 °C 烤片 1～2h ，不超過 ³h ；脫蠟不完全會阻礙抗體與抗原的結合，造成染色弱或無著色。可采用梯度脫蠟法，先使用高濃度二甲苯，再逐步降低濃度。推薦二甲苯浸泡2次共20～30min ，確保蠟層完全去除。

5抗原修復

抗原修復的是通過物理或化學方法去除這種遮蔽，暴露抗原決定簇，提高抗原的檢出率和檢測的準確性。

5.1修復方法

高壓修復和微波修復是常用的方法。高壓修復（121 C ， 2～3min ）能更徹底地暴露抗原，但對組織形態有一定影響，適用于大多數抗體；微波修復相對溫和，對組織形態影響較小，但修復效果不如高壓修復，適用于對抗原修復要求不高的抗體[4。

5.2修復液

不同的修復液適用于不同的抗原。修復液的pH值會影響抗原修復效果，檸檬酸鹽緩沖液pH值為6.0，染色背景清晰，適合大多數抗體；EDTA緩沖液pH值為8.0～9.0，對部分抗原修復效果較強，但染色背景可能加深，易造成假陽性結果。不同抗原適宜pH值不同，如ER、PR抗原在pH值為 18.0～9.0 修復效果更佳，細胞表面抗原多適用pH值為 6.0 需根據抗體說明書優化緩沖液，避免單一pH值導致部分抗原修復不足或過度。

5.3修復時間

修復時間過短會導致抗原修復不足，影響抗原的檢出率；修復時間過長則可能導致抗原過度修復，影響抗原的結構和檢測的準確性。高壓修復時間控制在2～3min ；微波修復時間可根據功率適當調整。

6抗體孵育

抗體孵育是免疫組化實驗的核心步驟，孵育不當會導致非特異性結合增加，背景過高，影響檢測的特異性和靈敏度。抗體孵育的效果受到抗體濃度、孵育時間、孵育溫度以及封閉液的影響。

6.1抗體濃度

抗體濃度過高會導致非特異性結合增加、背景過高，濃度過低則可能導致抗原檢出率降低，導致信號弱或假陰性，影響檢測的靈敏度。優先選擇特異性強、親和力高的單克隆抗體，避免多克隆抗體非特異性結合，其次抗體稀釋需預實驗優化濃度，推薦倍比稀釋法梯度測試，選擇陽性強、背景好、信噪比較高的濃度作為實驗濃度。

6.2孵育溫度與時間

孵育時間和溫度也會影響抗體與抗原的結合。孵育溫度過低，會降低抗體與抗原的結合效率；孵育溫度過高，則可能導致抗體變性5。孵育時間過短會導致抗體與抗原的結合不充分；孵育時間過長則可能導致非特異性結合增加，背景過高。推薦4 C 過夜或37 C1h ， 37°C 孵育1h適用于多數抗體， 4^°C 過夜孵育可增強低表達抗原信號

6.3封閉與洗滌

封閉液的選擇和封閉時間都會影響封閉效果。封閉液選擇與二抗同源的血清（如羊血清封閉鼠源抗體），濃度為 5%～10% ，室溫孵育 30min ，阻斷非特異性蛋白結合位點。洗滌時加人 0.05% Tween-20的PBS能有效清除殘留抗體，每次洗滌時間不少于 3min ，共3次。

7顯色

顯色是免疫組化實驗的最后一步，顯色不當會導致信號弱、背景高或非特異性染色，影響檢測結果的準確性和可靠性。顯色的強度和時間是影響顯色效果的關鍵因素

7.1顯色劑

不同的顯色劑靈敏度不同，需要根據實驗目的選擇合適的顯色劑。常用的顯色劑包括DAB、TMB等。對于大多數免疫組化實驗，DAB是常用的顯色劑。DAB顯色需現配現用，顯微鏡下觀察顯色進程，棕黃色出現后立即終止，避免時間過長導致背景加深。

7.2顯色時間

顯色時間過短，會導致信號弱或無法觀察到；顯色時間過長則可能導致背景過高或非特異性染色，影響檢測的特異性。顯色時間對于DAB一般為 1～5min ，具體時間應根據顯色劑種類和檢測需求確定。顯色后應立即用流水沖洗或使用終止液終止反應，以防止顯色過度。

7.3顯色溫度

顯色溫度會影響酶的活性，從而影響顯色反應的速度。溫度過高會導致顯色反應過快，難以控制顯色程度；溫度過低則可能導致顯色反應緩慢，影響檢測的靈敏度。顯色溫度一般控制在室溫。

8討論

8.1實驗效果的多因素協同性與標準化必要性

IHC實驗效果是多環節協同作用的結果。如取材固定不規范可導致后續抗原修復失效，抗體孵育條件不當會掩蓋組織前處理的優化效果。本文系統梳理了各環節關鍵因素，強調建立并遵循標準化操作流程（SOP）的重要性。SOP應涵蓋從取材固定到顯色封片的所有步驟，明確關鍵參數。引入自動化染色設備可有效減少人為操作誤差，提高實驗的一致性和重復性。加強抗體驗證和質量管控是從源頭減少誤差的關鍵。

8.2常見異常染色現象解析

假陽性。常因內源性過氧化物酶或生物素未充分阻斷、抗體非特異性結合、組織邊緣干燥、試劑污染、抗原修復過度導致抗原彌散等。為避免假陽性應充分阻斷內源性酶/生物素、優化抗體濃度及封閉條件、確保組織全程濕潤、使用高特異性單克隆抗體并優化抗原修復強度。

假陰性。常因抗原修復不充分、抗體濃度過低或孵育時間不足、一抗失活、組織固定過度或不當、顯色時間過短或顯色劑失效等。根據抗體說明書和預實驗優化抗原修復方法及參數、優化抗體稀釋度及孵育條件、確保組織及時適度固定、優化顯色時間并在顯微鏡下監控這些方法可有效防止假陰性發生。

邊緣效應。常因滴加抗體未完全覆蓋組織，導致邊緣與中心抗體濃度差異。確保抗體覆蓋劑完全覆蓋組織，孵育環境保持濕潤就可以避免邊緣效應。

脫片。與組織前處理不當、切片黏附不佳、抗原修復過激有關。應優化脫水透明程序；使用多聚賴氨酸或APES等處理的防脫載玻片；嚴格控制抗原修復條件。

8.3質量控制體系構建

一是建立詳細的SOP是質量核心。框架需明確規定各步驟的操作方法、試劑規格、濃度、時間、溫度等關鍵參數。例如：固定液為 10% 中性緩沖福爾馬林，pH值為7.2～7.4，固定時間 18～24h ，切片厚度 3～4μm 抗原修復液根據抗體選擇檸檬酸鹽pH值為6.0或EDTApH值為9.0，修復條件高壓121 C ，2min或微波中高火， 20min2 ，抗體孵育（一抗4 °C 過夜），顯色（DAB，鏡下控制約 1～5min ）等。

二是對照設置。陽性對照選擇已知目標抗原陽性的組織，與待測樣本同批處理染色，驗證整個實驗體系有效；陰性對照包括空白對照（用PBS）和自身對照。

三是自動化設備應用。自動化設備能精確控制孵育時間、溫度、試劑添加量，顯著提高結果一致性

四是進行內源性過氧化物酶阻斷和內源性生物素阻斷。

8.4技術挑戰與未來展望

IHC的核心挑戰在于平衡抗原充分暴露與背景有效控制。標準化操作是減少變異的關鍵。未來研究可關注：一是分子探針技術：開發更靈敏、特異的探針提高檢測精度。二是多色熒光IHC（mIHC/IF）：實現在單張切片上同時檢測多個靶標，提供更豐富的空間信息[8。三是人工智能（AI）輔助分析：應用AI算法進行陽性區域識別、定量分析（如H-score）、結果判讀，提高客觀性、效率和可重復性。

結語

免疫組織化學實驗結果的準確性和可靠性受制于從取材到顯色觀察的全流程關鍵因素。本文系統分析了組織固定、脫水透明浸蠟、切片、抗原修復、抗體孵育及顯色等環節的主要影響因素，并提出了針對性的優化對策。有效解決脫片、背景高、信號弱、假陽性/假陰性等常見問題。依賴于對上述關鍵控制點的精準管控，嚴格執行標準化操作流程，結合合理的對照設置、自動化設備的應用以及嚴格的質量控制體系，是提升IHC實驗成功率和結果可靠性的根本保障。隨著分子探針、多色熒光標記及人工智能等技術的發展，IHC技術將在病理診斷和基礎研究中發揮更精準、更強大的作用。

參考文獻：

[1]李振坤等.免疫組化前處理標準化研究進展[J].臨床與實驗病理學雜志，2021，37（5）：543-546.

[2]王明等.組織固定時效性對抗原保存的影響[J].中華病理學雜志，2020，49（8）：831-834.

[3]張偉，陳紅.自動化染色儀在免疫組化質量控制中的應用[J].臨床與實驗病理學雜志，2022，38（6）：721-725.

[4]陳敏華等.不同pH修復液對核抗原暴露的影響[J].中國組織化學雜志，2022，31（4）：332-336.

[5]劉燕，趙強.免疫組化抗體濃度優化方法的對比研究[J]診斷病理學雜志，2021，28（4）：281-285.

[6]劉偉等.微流控芯片在抗體孵育中的創新應用[J].中國醫學裝備，2024，21（1）：45-49.

[7]張立國等.智能監控系統在病理前處理中的應用[J].診斷病理學雜志，2023，30（2）：112-115.

[8]郭偉，周敏.多色熒光免疫組化技術的研究進展[J].中國組織化學與細胞化學雜志，2020，29（2）：183-188.

收稿日期：2025-06-19

作者簡介：張海林（1985—），女，漢族，碩士，工程師。研究方向：病理學檢測與分析。*通訊作者：呂龍寶（1974—），男，漢族，碩士，研究員。研究方向：實驗動物學研究。