口蹄疫病毒弱毒株遺傳穩定性構建

口蹄疫（Foot-and-MouthDisease，FMD）是全球畜牧業面臨的重大威脅，由FMDV引發，該病毒屬于小RNA病毒科下的口蹄疫病毒屬，具有高度傳染性和變異能力。FMDV存在7個血清型和眾多亞型，各型之間缺乏交叉保護，一旦暴發，不僅對動物健康造成嚴重影響，還會對國家的畜牧業生產、國際貿易和外交關系產生重大負面影響。因此，世界各國都非常重視對口蹄疫的預防和控制1]

在疫苗研發領域，傳統的滅活疫苗雖是預防口蹄疫的主要手段，但存在在多次免疫后仍能在動物體內產生非結構蛋白抗體的問題，這樣會給疫病的血清學監控和流行病學調查帶來挑戰。

1口蹄疫病毒生物學特性與遺傳變異

1.1口蹄疫病毒的結構與生命周期

口蹄疫病毒（FMDV）的結構與生命周期是其生物學特性的重要組成部分，對病毒的傳播、致病性和疫苗設計具有深遠影響。FMDV為單股正鏈RNA病毒，其基因組長約 8.4kb ，編碼一個多聚蛋白前體，把病毒自身的蛋白酶作用裂解為多個結構和非結構蛋白（如圖1，FMDV基因組RNA基本結構）。病毒顆粒呈二十面體對稱，直徑約為 22～30nm ，由VP1、VP2、VP3和VP4四種結構蛋白組成，其中VP1、VP2和VP3位于病毒表面，參與病毒的吸附和入侵過程，而VP4則位于病毒衣殼的內部。FMDV的非結構蛋白包括2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D，其中3D為RNA依賴的RNA聚合酶，是病毒復制的核心酶，詳見圖1。

病毒基因組非編碼區含有內部核糖體進人位點（IRES），負責調控病毒蛋白的翻譯效率。結構蛋白中，VP1的G～H環區域是重要的抗原決定簇，同時也是毒力相關位點。已有研究通過定點突變該區域的精氨酸一甘氨酸—天冬氨酸（RGD）基序，成功獲得了毒力降低但仍保持良好免疫原性的弱毒株。VP2和VP3蛋白則主要參與病毒衣殼的組裝，其穩定性突變可顯著提升病毒顆粒的熱穩定性，這對疫苗的儲存和運輸具有重要意義。

圖1FMDV基因組RNA基本結構

非結構蛋白如2C、3A等在病毒復制過程中發揮重要作用。其中3A蛋白的長度多態性與病毒宿主范圍密切相關，通過縮短該蛋白的編碼序列可獲得宿主適應性受限的弱毒株。這種基于基因組功能區域系統改造的策略，確保了弱毒株的核心抗原性，還通過多重遺傳屏障有效防止了毒力增強現象的發生。

FMDV的生命周期包括吸附、侵入、脫殼、復制、裝配和釋放等階段。病毒顆粒通過與宿主細胞表面受體的特異性結合進行吸附，因內吞作用而進入細胞。在內吞體中，病毒顆粒脫殼釋放RNA基因組。病毒的RNA基因組在細胞質中作為模板，通過3D聚合酶的催化作用進行復制，在病毒蛋白酶的作用下，多聚蛋白前體被裂解為結構和非結構蛋白[2]。結構蛋白在病毒裝配過程中自我組裝成新的病毒顆粒，非結構蛋白則參與病毒復制的調節和干擾宿主細胞的抗病毒機制。新組裝的病毒顆粒通過細胞膜的出芽或細胞裂解的方式進行釋放，開始新一輪的感染循環。

FMDV的生命周期中，病毒基因組的復制和蛋白的翻譯過程高度依賴于宿主細胞的機制，病毒非結構蛋白的活性對病毒的復制效率和遺傳穩定性具有重要影響。例如，非結構蛋白3C蛋白酶在病毒多聚蛋白前體的裂解過程中發揮關鍵作用，而3D聚合酶的保真性則直接影響病毒復制過程中的變異率。

1.2病毒遺傳變異機制與弱毒株篩選

FMDV的遺傳變異機制主要涉及病毒復制過程中的錯誤傾向和宿主免疫壓力下的適應性進化。病毒RNA聚合酶3D在復制病毒基因組時，缺乏校正功能，這導致了較高的突變率，為病毒提供快速適應環境變化的能力[3。在宿主體內，FMDV面臨強烈的免疫選擇壓力，促使病毒不斷變異以逃避宿主免疫系統的識別與清除。

構建弱毒株時，篩選具有遺傳穩定性和安全性的候選株是關鍵步驟。通過實驗室定向進化和反向遺傳學技術，引入特定的突變或缺失，以削弱病毒的致病性而不影響其免疫原性。刪除或突變非結構蛋白中的免疫優勢表位，發展出能激發有效免疫反應，不會在宿主體內產生非結構蛋白抗體的標記疫苗。引入提前終止密碼子（PrematureTerminationCodon，PTC）和應用遺傳密碼子擴展技術，構建攜帶琥珀終止密碼子的重組口蹄疫病毒（PTC-FMDV），提高弱毒株的遺傳穩定性，降低毒力恢復的風險。

弱毒株篩選按照以下步驟進行：第一步，基于理論分析和實驗數據，設計并構建一系列攜帶不同突變的弱毒株候選株；第二步，通過在細胞系中的連續傳代實驗評估其遺傳穩定性，同時監測其生長特性、抗原性、毒力水平和安全性；第三步，通過動物實驗驗證弱毒株的安全性和有效性，確保其在宿主體內不會引起疾病，激發充分的免疫反應。郭慧琛團隊闡明完整口蹄疫病毒抗原高效保護作用的結構基礎，如圖2。

圖2口蹄疫病毒抗原高效保護作用結構基礎

2弱毒株遺傳穩定性構建策略

2.1基因工程方法在弱毒株構建中的應用

在構建口蹄疫病毒弱毒株的過程中基因工程方法起到了關鍵作用，使得弱毒株的安全性以及遺傳穩定性均得到了提升。舉例來說運用反向遺傳學技術對病毒的RNA基因組加以改造，引入特定的突變或者缺失，以此改變病毒的生物學特性，這項技術可精準控制病毒基因組里的關鍵區域，像是非結構蛋白的免疫優勢表位[4。借助將這些表位給予刪除或者突變，研發出了可激發有效免疫反應且不會在宿主體內產生非結構蛋白抗體的標記疫苗，借助基因編輯技術精確編輯病毒基因組，敲除或者插入特定的遺傳信息，削弱病毒的致病性同時不影響其免疫原性，CRISPR—Cas9所有的高效性以及特異性讓弱毒株的構建變得更加精確且可控。

融合PCR與RT-PCR技術，構建出含有特定氨基酸缺失的全長重組質粒，借助精心設計的引物，研究人員可準確地在病毒基因組中引入缺失或者突變，如圖3所示，針對口蹄疫病毒抗原結構進行解析，優化弱毒株的遺傳特性，結合RT-PCR技術對構建的質粒開展序列測定，驗證其遺傳穩定性，保證構建的弱毒株符合預期設計，擁有良好的遺傳穩定性。還可采用遺傳密碼子擴展技術，憑借在病毒基因組中引入提前終止密碼子，并且利用正交翻譯元件解碼這些密碼子，構建攜帶琥珀終止密碼子的重組口蹄疫病毒，這項技術提升了弱毒株的遺傳穩定性，為研究FMDV的生物學特性提供了全新的工具，比如探討非結構蛋白在病毒復制、感染性以及免疫反應中的作用

圖3口蹄疫病毒抗原結構解析

在構建弱毒株的過程中，生物信息學分析與預測所發揮的作用不容小，研究人員借助對病毒基因組序列展開分析，并對蛋白質結構和功能加以預測，以此可更為精準地挑選突變位點。對弱毒株的設計給予優化，借助像序列比對以及變異分析軟件這類生物信息學工具，可幫助實驗人員對弱毒株的遺傳穩定性進行評估，保證其在連續傳代實驗里的表現契合預期。

2.2遺傳穩定性評估與優化

在弱毒株開發進程中，遺傳穩定性評估屬于關鍵環節，其作用是保障疫苗株于生產、存儲以及應用階段的遺傳一致性，避免毒力恢復與變異情況發生。評估方法有連續傳代實驗、動物實驗驗證以及生物信息學分析等，借助構建系統發育樹與變異網絡，對弱毒株的遺傳進化及穩定性給予評估。依據這些評估方法，可實現對遺傳穩定性的優化，像非結構蛋白優化、運用遺傳密碼子擴展技術以及優化基因編輯技術，借助這些方法，可精確評估并優化弱毒株的遺傳穩定性，保證其作為疫苗株時的安全性與有效性。

評估弱毒株遺傳穩定性需采用體外與體內相結合的實驗體系，通過多維度指標驗證改造毒株在傳代過程中的性狀保持能力。體外評估主要依托細胞模型開展連續傳代實驗，這是驗證基因組穩定性的基礎方法。將重組弱毒株接種于BHK-21細胞，每隔48h收集病毒液進行傳代，通過RT-PCR擴增VP1等關鍵基因片段并測序，比對各代次間目標區域的序列一致性。數據顯示[7]，經過連續傳代后，改造毒株的VP1基因G～H環區域未出現顯著突變，證實定向修飾的位點具有良好穩定性。

體內評估則通過易感動物模型驗證弱毒株的生物學特性和穩定性。選用3～5日齡乳鼠進行連續傳代實驗[8，每代接種后觀察臨床癥狀并測定病毒載量。與野生毒株相比，改造弱毒株在各代次中均未引起典型足部水皰病變，病理組織學檢查顯示其致病性維持在穩定水平。

2.3弱毒株遺傳穩定性影響因素分析

弱毒株的遺傳穩定性會受到諸多因素的影響，這些因素涉及了病毒基因組本身所有的自然變異傾向、特定非結構蛋白區域呈現出的特性，以及實驗室環境和宿主體內環境所產生的作用，病毒基因組存在變異傾向，口蹄疫病毒的RNA基因組由于其RNA依賴的RNA聚合酶缺乏校正功能，有較高的自然變異率這種變異傾向來源于復制過程中存在的錯誤傾向，并且受到宿主免疫系統選擇壓力的作用，在構建弱毒株時，要考慮其基因組的自然變異傾向，借助反向遺傳學技術以及基因編輯技術，減少或者控制這些變異位點，以此來提高弱毒株的遺傳穩定性。

非結構蛋白區域有特定特性，非結構蛋白當中的特定區域，比如3A蛋白的免疫優勢表位，對弱毒株的遺傳穩定性有著關鍵影響。該區域發生變異會致使病毒出現遺傳漂變，影響弱毒株的安全性與有效性，依靠精心設計的突變或者缺失，減弱該區域的變異傾向，提高弱毒株的遺傳穩定性，利用遺傳密碼子擴展技術，構建攜帶琥珀種質密碼子的重組口蹄疫病毒，可有效控制非結構蛋白區域的變異，提高弱毒株的長期穩定性。

在宿主體內，病毒面臨的免疫壓力以及變異選擇機制會致使弱毒株發生變異，借助動物實驗，可以評估弱毒株在真實免疫環境中的遺傳穩定性，先進技術得到應用與優化，基因編輯技術以及生物信息學分析在弱毒株遺傳穩定性評估和優化方面發揮著關鍵作用，CRISPR一Cas9等基因編輯工具可精確修改病毒基因組中的關鍵位點，減少非預期變異，提高弱毒株的遺傳穩定性。生物信息學工具，像序列比對和變異分析軟件，可使研究人員在分子水平上理解弱毒株的變異模式，為遺傳穩定性優化提供科學依據[8]

結語

本文成功構建出一系列有遺傳穩定特性且安全有效的口蹄疫弱毒株疫苗候選株，這些弱毒株于細胞培養過程中呈現出了相當出色的遺傳穩定性。在動物實驗里也證實了它們的安全性以及免疫原性，這為口蹄疫疫苗的研發提供了全新的策略與方法。未來若能優化弱毒株的構建策略，提升疫苗的免疫效果，借助持續不斷的科技創新以及國際合作，有望在全球范圍內控制口蹄疫疫情，保障畜牧業的健康及可持續發展。

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收稿日期：2025-05-23

作者簡介：王賽措（1985—），女，藏族，碩士，工程師。研究方向：獸醫疫苗。*通訊作者：馬志鵬（1978—），男，東鄉族，本科，實驗師。研究方向：獸用生物制品質量評價。