類芽孢桿菌對攜帶NDM基因的超級耐藥大腸桿菌的抑菌活性分析

doi：10.13304/j.nykjdb.2024.0457

中圖分類號：S968.22 文獻標志碼：A 文章編號：1008-0864（2025）08-0119-13

Analysis of Bacteriostasis Activity of Paenibacillus sp.Against Super Drug-resistant Escherichia coli CarryingNDM Genes

LI Haili ^1，2 ， YANG Fan2， CHEN Jianhao2， YANG Kang2， YANG Yiping2， DUAN Jingang2， LI Bin2， ZHANG Wanqi2，MA Chunjiang2 （1.InstituteofAnimal Husbandry，HenanAcademyofAgriculturalSciences，Zhengzhou450o02，China；2.HamiCityAnimal Disease Prevention and Control Center Xinjiang，Xinjiang Hami 839oo1，China）

Abstract：Inorderto screen medicinal plant endophytes with goodantibacterial activityagainst super drug-resistant Escherichia coli that simultaneously carry New Delhi metal- β lactamase（NDM）gene NDM1/NDM5and NDM4/ NDM5，the endophytes of Forsythia suspensa that had antagonistic effects on the super drug-resistant E .coli carrying NDMI/NDM5and NDM4/NDM5were isolatedand screened bysurfacedisinfectionmethodand plateconfrontation method.Morphological and molecular biological identificationof these endophytes were performed，and their antibacterialactivities were investigatedbygenome-wideanalysis.Theresultsshowed that23strainsof endophytes wereisolatedfromroot，stem，leafand fruitdifferentofForsythiasuspensa.AGram-positiveendophyte with good antibacterial efect wasobtained from23endophyte strains byplate confrontationassay.Itwas identifiedas

Paenibacillussp bymorphologyand molecular identification，andnamedas HNYJ2209J.HNYJ2209J could effectively inhibit the super drug-resistant E .coli.Whole genome sequencing analysis showed that the genome size of HNYJ2209Jwas5827342bp，the content ofGCwas 46.22% ，and the number ofcoding geneswas5232.There were 5 229，3 648，4 107，3 493 and 2495 annotated genes by NR，Swis-Prot，COG，GO and KEGG databases， respectively，and 8 gene clusters related to secondary metabolite synthesis were predicted byantiSMASH.The main secondary metabolites werecyclolipopeptide antibiotics（fusaricidin B），tridecaptin，polymyxin B，paenibacilin， marthiapeptideA，paeninodin，paenilipoheptin and aurantinin B/C/D.Among them，fusaricidin B，tridecaptin， polymyxin B and paenibacillin showed 100% ， 100% ， 100% and 90% homology between the predicted synthetic gene cluster and the known gene cluster.To sumup，HNYJ22O9Jhadthe potential to develop new drugs against super drug-resistant E.coli carrying NDM1/NDM5and NDM4/NDM5andas a feedable microorganism.

Keywords：Paenibacillussp.；Forsythia suspensa；endophytes；feeding microorganism；antibacterial effect; Escherichia coli；super drug-resistant

大腸桿菌（Escherichiacoli）是一種重要的人畜共患病原體，在世界范圍內流行，對畜禽養殖業造成重大的經濟損失。隨著我國畜禽養殖規模化發展及抗生素用量的增加，細菌耐藥性增強，獸醫臨床出現多重耐藥菌株和超級耐藥菌株，嚴重威脅著公共衛生安全和畜禽產品安全。目前，大腸桿菌感染的治療主要依賴抗生素，然而，大腸桿菌耐藥性是非常令人擔憂的問題。抗耐藥微生物及其活性產物資源的開發和利用被認為是抗生素的可行替代品。研究表明，藥用植物內生菌及其代謝活性產物具有開發新藥的潛力和解決細菌多重耐藥問題的潛力。因此，從藥用植物中尋找抗生素的替代品及新的抗耐藥微生物藥物是解決細菌耐藥性的重要舉措。

內生菌是指生活史某一階段在健康的寄主植物體內，但對寄主并不引起明顯病癥的細菌或真菌，可存在于植物的根、莖、葉、花、果實和種子等部位[3。藥用植物內生菌存在于藥用植物體內，能單獨合成與藥用植物相同或類似的活性產物。中藥材本身具有特殊的藥用價值，內生菌可產生多種具有生物活性的次級代謝產物和新的天然產物（naturalproducts，NPS）的潛力，特別是來自特定產地的道地藥材的內生菌，是活性先導化合物的重要天然產物資源庫4。近年來，具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌活性的植物內生微生物次生代謝產物的發現為天然藥物的研發和生產提供了重要研究思路[5]。

中藥材內生菌除產生具有抗菌、抗腫瘤和抗氧化作用的活性物質外，還能產生抗蟲類、抗糖尿病類等其他作用的活性物質。從巴西蓮子草（Alternantherabrasiliana）中分離出的枯草芽孢桿菌（Bacillussp）可產生與其寄主植物相同的生物活性化合物;從藥用植物鳶尾（IristectorumMaxim）內生真菌中分離出2種異構體（pestacin和異pestacin）都表現出抗菌活性和抗氧化活性;從莢蘭屬（Podorchid）植物內生菌的代謝產物中分離的芳香倍半萜烯類物質對惡性瘧原蟲（Plasmodium）具有顯著殺滅活性;黃連（CoptischinensisFranch）內生真菌Phomopsissp.能夠產出黃連主要活性生物堿小檗堿;從短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）內生菌安德列亞霉（Taxomycesandreanae）的次生代謝產物中發現了抗癌化合物紫杉醇[；藥用植物烏頭（AconitumcarmichaeliDebx）的內生菌黑孢霉（Nigrosporasp.）產生的代謝產物對流感病毒H1N1具有顯著抗病毒活性；從藥用植物Kennedianigriscans內生菌StreptomycesNRRL30562中分離了4種肽類化合物，具有廣譜抗菌活性；長春花（Catharanthusroseus）中分離的內生真菌尖孢鏈孢菌（Fusariumoxysporum）能夠產生抗癌物質長春新堿[13]；藥用植物附子（RadixAconitiLateralisPreparata）中分離的鏈霉菌屬（Streptomycessp.）微生物能產生具有抗真菌活性的 _2，2， -聯吡啶類化合物u4；來自喜樹（CamptothecaacuminataDecne）種子的內生放線菌能產生次生代謝產物喜樹堿[15]。

藥用植物及其內生菌是重要的藥用資源，有利于天然藥物的研究與開發，這類內生菌一旦開發，能夠直接與實際生產應用相關聯，產生巨大的經濟價值和社會價值。這對加大天然產物的生產力及藥用植物的保護均具有重要意義，對民族藥和中藥產業的發展具有重要推動作用。中藥材內生菌是一個用之不竭的重要化合物庫，是可持續發展的資源，因此，加大內生菌代謝成分的研究，獲取新的有效成分途徑是未來研究的重點。進一步深入了解內生菌與宿主植物的動態相互作用和內生菌基因的起源將有利于中藥材內生菌戰略產業的發展。此外，在新資源匱乏的今天，內生菌的代謝產物可能會成為新化合物獲得的突破點。目前，從獸醫臨床分離出大量耐藥菌，尤其是同時攜帶新德里金屬β-內酰胺酶（NewDelhimetal- ?β -lactamase，NDM）基因NDM1/NMD5和NDM4/NDM5基因的超級耐藥菌的出現，給動物疫病防控和公共衛生安全造成了極大威脅。因此，本研究擬從連翹（Forsythiasuspensa）根、莖、葉、花和果中分離并篩選針對超級耐藥大腸桿菌具有抑菌活性的內生菌，并對其抑菌效果及抑菌活性物質進行研究，旨在為新型抗菌活性物質篩選和新型抗耐藥微生物藥物研究提供參考。

1材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1藥用植物組織連翹根、莖、葉、花、果實等組織均采自三門峽連翹種植基地。

1.1.2供試菌株同時攜帶新德里金屬 β -內酰胺酶NDM1/NMD5和NDM4/NDM5基因的超級耐藥大腸桿菌由河南省農業科學院畜牧研究所分離、鑒定、保存[16-17]。

1.1.3試劑與培養基TSA（tryptone soyagar）、TSB（tryptic soyBorth）、PDA（potato dextrose agar）和LB（Luria-Bertani）培養基均購自北京路橋生物科技有限公司；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、SanTaqPlusPCRMix預混液購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2 試驗方法

1.2.1連翹內生菌的分離將連翹根、莖、葉、花和果進行表面消毒，然后接種至PDA培養基上，37°C 培養 48～72h ，挑取不同形態的菌落在TSA培養基上純化，然后通過顯微鏡觀察形態特征，剔除相同的菌株。純化后的菌株 -80^°C 保存備用。

1.2.2拮抗內生菌的篩選取 -80°C 保存的內生菌在TSA培養平板中央劃線接種，然后在劃線內生菌的兩側分別劃線接種同時攜帶新德里金屬β-內酰胺酶基因NDM1/NMD5和NDM4/NDM5的超級耐藥大腸桿菌， 37^°C 培養 24h ，觀察內生菌對病原菌的抑制情況。

為進一步探究內生菌的抑菌活性，取 -80^°C 保存的內生菌接種至TSA平板中央，然后將 1× 10⁹CFU?mL^-1 的超級耐藥大腸桿菌菌液涂布在內生菌周圍， 37°C 培養 24h ，觀察內生菌對超級耐藥大腸桿菌的抑制情況。若內生菌周圍有透明抑菌圈，說明內生菌對超級耐藥大腸桿菌有抑菌和殺菌效果。抑菌效果以抑菌圈大小表示，抑菌圈直徑 gt;20mm 表示抑菌效果較強， 10mmlt; 抑菌圈直徑 lt;20mm 表示抑菌效果中等，抑菌圈直徑 lt;10 mm 表示抑菌效果較弱。

1.2.3內生菌形態觀察挑取平板內生長的內生菌單菌落涂布于載玻片上，革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察內生菌形態。

1.2.4內生菌分子鑒定使用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒按說明書步驟提取DNA；采用16SrRNA（引物序列： ?5^′ -AGAGTTTGATCCTGG-CTCAG-3';5'-GGTTACCTTGTTACGACTTC-3'）進行PCR擴增和測序鑒定。PCR體系 50μL ： PCRMasterMix 25μL，DNA2μL. ，超純水 19μL ，上、下游引物各 2μL 。PCR程序： 95^°C30s;95^°C60s ，55^°C60s，72^°C60s，30 個循環； 72^°C30s 。對PCR產物檢測合格后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。通過與本地數據庫對比，基于16SrRNA序列選擇在種屬水平上最接近的20株菌株，通過MEGA6.0軟件選擇NJ（neighbor-joining）法構建系統進化樹，確定內生菌的種屬。

1.2.5內生菌發酵液活性檢測首先，將同時攜帶新德里金屬 β -內酰胺酶NDM1/NMD5和NDM4/NDM5基因的超級耐藥大腸桿菌涂布至整個平板，然后挑取 -80^°C 保存的內生菌接種至TSB培養基中， 37^°C 培養 24h，12000r?min^-1 離心 10min ，取上清液用 0.22μm 無菌濾膜過濾。添加 100μL 內生菌發酵液至涂布于有超級耐藥大腸桿菌的平板中，4次重復，用游標卡尺測量抑菌圈大小，取其平均值。

1.2.6全基因組測序將在 -80^°C 低溫冰箱保存的內生菌劃線接種在TSA培養基上， 37°C 培養24h ，挑取單菌落接種于 200mL TSB肉湯培養基， 37^°C 培養 24h，12000r?min^-1 離心 5min ，棄上清，留菌體沉淀，菌體送至武漢菲沙基因信息有限公司采用IluminaHiseq+PacBio的測序方式進行全基因組測序。

1.2.7基因組組裝及基因組注釋首先，利用短序列組裝軟件 SOAPdenovo2（http：//soap.genomics.org.cn/對IlluminaHiseq測序后的優化序列進行多個Kmer參數的組裝，得到基因組掃描圖；然后，再使用unicycler軟件對PacBio測序序列進行組裝，最終得到完整的染色體及質粒序列。通過與NCBI（national center for biotechnology information）、NR（non-redundant database）、Swiss-Prot（Swiss-Protprotein sequence database）、Pfam（the protein familydatabase）、COG（clusters of orthologous groups）、GO（gene ontology）、KEGG（Kyoto encyclopedia of genesand genomes）、VFDB（virulence factors of pathogenicbacteria）數據庫比對，對預測到的編碼基因進行功能注釋;通過碳水化合物活性酶數據庫（CAZy，http：//www.cazy.org/）分析碳水化合物活性酶活性，使用ResFinder 數據庫（https：//cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/）預測耐藥基因。

2 結果與分析

2.1內生菌的分離及拮抗菌的篩選

從連翹根、莖、葉、花和果不同組織中共分離得到23株內生菌，用平板對峙法從23株內生菌中篩選出1株對同時攜帶NDM1/NDM5和NDM4/NDM5基因的超級耐藥大腸桿菌有抑制效果的內生菌，將其命名為HNYJ2209J（圖1）。拮抗試驗結果（圖2）表明，HNYJ2209J菌株對超級耐藥大腸桿菌有較好的抑制效果。

2.2 內生菌HNYJ2209J的形態觀察

菌株HNYJ2209J在TSA固體培養基上培養，菌落為乳白色，圓形隆起。革蘭氏染色后呈紫色，為革蘭氏陽性菌，桿狀，孢子橢圓形（圖3）。

2.3內生菌HNYJ2209J系統發育樹分析

對內生菌HNYJ2209J基因組進行PCR擴增，獲得長度約 1800bp 的產物（圖4），對序列進行同源性比對并構建系統進化樹，結果如圖5所示。可以看出，HNYJ2209J的序列與類芽孢桿菌（Paenibacillussp，GenBank登錄號為CP151948.1）序列相似度達 100% 。結合形態學和分子生物學

圖1拮抗菌株的篩選

A：攜帶NDM1/NDM5的超級耐藥大腸桿菌；B：攜帶NDM4/NDM5的超級耐藥大腸桿菌

A：Super-resistant E. coli carrying NDM1/NDM5 B：Super drug-resistantE.colicarryingNDM4/NDM5A：攜帶NDM1/NDM5的超級耐藥大腸桿菌；B：攜帶NDM4/NDM5的超級耐藥大腸桿菌

A：Super-resistant E.coli carrying NDMI/NDM5 B：Super drug-resistant E.coli carryingNDM4/NDM5

Fig.1Screening of antagonistic strains

圖2菌株HNYJ2209J對超級耐藥大腸桿菌的拮抗試驗 Fig.2Antagonism test of strain HNYJ22O9J on super drugresistantE.coli

Fig.3Morphology of strainHNYJ2209J

A：菌落形態；B：革蘭氏染色A：Colonymorphology;B：Gram staining因 UNV鑒定結果，將內生菌HNYJ2209J鑒定為類芽孢桿菌。

2.4內生菌HNYJ2209J發酵液的活性分析

由圖6可知，HNYJ2209J發酵液對攜帶NDM1/NDM5基因的超級耐藥大腸桿菌的抑菌圈 為 29±0.20mm ;對攜帶NDM4/NDM5基因的超級 耐藥大腸桿菌的抑菌圈為 （27.00±0.22）mm 。

圖4菌株HNYJ2209J的16SrRNAPCR結果 Fig.4 16SrRNA PCR result of strain HNYJ2209J

2.5 內生菌HNYJ2209J基因組分析

注：M—Marker；1～3—HNYJ2209J的3次生物學重復。

Note：M—Marker;1～3—3biologicalreplicatesofHNYJ2209J.

對菌株HNYJ2209J基因組進行測序，結果（圖7）表明，其基因組序列全長為 5827342bp GC含量為 46.22% ；對測序結果進行組裝和注釋，預測其編碼基因數為5232個。

2.6內生菌HNYJ2209J的功能基因分析

對菌株HNYJ2209J基因組進行注釋，NR、Swiss-Prot、COG、GO、KEGG數據庫分別有5229、3648，4107，3493，2495 個基因被注釋；通過antiSMASH軟件預測到與次級代謝產物合成相關的有8個基因簇。

2.6.1GO數據庫注釋結果由圖8可知，分別有2314、4931和6198個蛋白注釋到與細胞組分（cellularcomponent）分子功能（molecularfunction）和生物過程（biologicalprocess）有關。其中，生物過程中涉及細胞過程和代謝過程的蛋白數量較多；細胞組分中主要是細胞結構體和含蛋白質復合物；分子功能中主要是催化活性和結合。

圖5菌株HNYJ2209J的系統進化樹Fig.5Phylogenetic tree of strainHNYJ2209J

A：攜帶NDM1/NDM5的超級耐藥大腸桿菌；B：攜帶NDM4/NDM5 的超級耐藥大腸桿菌

A：Super-resistant E.coli carrying NDM1/NDM5 B：Super drugresistantE.coli carryingNDM4/NDM5

圖6HNYJ2209J菌株發酵液對超級耐藥大腸桿菌的抑菌效果

2.6.2KEGG數據庫注釋結果菌株HNYJ2209J在KEGG數據庫中共有2216個蛋白被注釋與細胞過程、環境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、新陳代謝和有機系統6大功能的40條通路有關（圖9）。在細胞過程中，真核細胞群落和細胞運動是主要通路；在環境信息處理過程中，膜運輸和信號轉導是主要通路；在新陳代謝過程中，碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔助因子和維生素代謝、能量代謝是主要代謝通路。

Fig.6Inhibitory effect of strain HNYJ2209Jon super drugresistantE.coli

圖7HNYJ2209J基因組圈圖

Fig.7 Genome circlemap ofHNYJ2209J

2.6.3COG數據庫注釋由圖10可知，有4749個蛋白在COG數據庫中得到注釋。其中，碳水化合物運輸和代謝的占比最高，共有527個，占11.10% ；有494個（ 10.40% 蛋白與轉錄有關；有382個（ 8.04% ）蛋白參與一般功能預測；有350個（ 7.37% ）蛋白涉及信號轉導機制。

2.6.4碳水化合物活性酶活性分析通過CAZy（carbohydrate-activeenzymes）數據庫分析發現，HNYJ2209J菌株中共有219個基因編碼碳水化合物酶（表2），其中糖苷水解酶最多，占比為57.08% ；糖基轉移酶和碳水化合物酯酶次之，占比分別為 15.07% 和 14.61% ；輔助氧化還原酶、多糖裂合酶、碳水化合物結合模塊的占比分別為11.87%.0.91%.0.46% 0

2.6.5次級代謝產物抗菌活性物質合成基因簇分析芽孢桿菌能產生多種活性物質，antiSMASH軟件預測分析（表3和圖12）表明，菌株HNYJ2209J基因組中有8個基因簇與次級代謝繁殖Reproduction[ 16 免疫系統過程Immune system process 18 行為Behavior 4 代謝過程Metabolic process 1653 碳水化合物的利用率Carbohydrateutilization 1 細胞過程Cellular process 2037 碳利用率Carbon utilization 1 病毒過程Viral process 19 氮利用率Nitrogenutilization 一 生殖過程Reproductive process 18 生物粘附Biologicaladhesion 12 信號Signaling 111 多細胞有機體過程Multicellular organismal process 110 發展過程Developmental process_ 251 15 生物學過lprocess 有節奏的過程Rhythmicprocess 1 積極調節生物過程Positiveregulationofbiological process 51 負向調節生物過程Negativeregulation of biologicalprocess 74 生物過程調控Regulation of biologicalprocess 414 刺激反應Responsetostimulus 1427 Biologicalprocessinvoedintraspecies 本地化Localization |14 1476 Clar component 多種有機物過程Multi-organismprocess 41 生物調節Biologicalregulation 1478 解毒Detoxification 19 蛋白質復合物Protein-containing complex 193 病毒粒子組件Virioncomponent- 7 細胞結構體Cellularanatomical entity 12109 分子功能 細胞骨架運動活性Cytoskeletal motor activity 5 Molecular function 催化活性Catalyticactivity 1956 結構分子活性Structural molecule activity 61 運輸活動Transporteractivity 1429 結合Binding 1827 抗氧化活性Antioxidant activity 124 翻譯調節因子活性Translationregulatoractivity |12 分子換能器活性Molecular transducer activity 145 分子接頭活性Molecularadaptoractivityl 1 分子功能調節劑Molecular function regulator 18 分子載體活性Molecularcarrier activity 17 轉錄調節劑活性Transcription regulatoractivity 265 小分子傳感器活性Smallmolecule sensor activityl 70 ATP依賴活性ATP-dependent activityl 216 0 500 1000 1500 2000 數量Number產物合成相關。這些基因簇編碼的代謝產物包括以非核糖體途徑（non-ribosomal peptidesynthetase，NRPS）合成的環脂肽類抗生素（fusaricidenB）、噻唑環肽類化合物（marthiapeptideA）、十三肽菌素（tridecaptin）脂質庚肽（paenilipoheptin）、多粘菌素B（polymyxinB）；以氨基端乙酰化的核糖體途徑合成的羊毛硫肽類化合物（lanthipeptide）細菌抗菌肽（paenibacillin）；以核糖體合成并經過翻譯后修飾的天然肽類產物（RiPPs）套索肽（lassopeptide）、拉索肽（paeninodin）；以PKS（polyketidebiosynthase，PKS）途徑合成的抗菌物質（aurantinin B/C/D）。其中，fusariciden B、tridecaptin和polymyxinB的預測合成基因簇與已知基因簇的同源性均為 100% ；而 paenibacillin、marthiapeptideA ? paeninodin ? aurantinin B/C/D和paenilipoheptin的預測合成基因簇與已知基因簇的同源性分別為 90% ） 41% ） 40% ） 35% 和 19% 。2.6.6抗菌物質合成通路分析對菌株HNYJ2209J的代謝途徑進行分析發現，存在多種抗生素的生物合成途徑、吩嗪合成途徑、非核糖體合成的抗菌物質的代謝途徑、苯丙烷類生物合成途徑、茛旁烷/哌啶/吡啶生物堿的生物合成、異喹啉生物堿的生物合成和芥子油昔生物合成。其中，抗生素的生物合成途徑包括碳青霉烯類合成、青霉素和頭孢菌素的生物合成、鏈霉素生物合成、阿卡波糖和井岡霉素的生物合成、單胺菌素生物合成、新生霉素生物合成、新霉素/卡那霉素/慶大細胞生長與死亡Cell growth and death 21 細胞運動Cell motility 72 細胞過程 真核細胞群落Cellular community prokaryotes 10 1107 Cellular processes 運輸和分解代謝Transport and catabolism[ 244 膜運輸Membrane transport 187 信號轉導Signal transduction 52 折疊、分類和降解Folding，sortingand degradation 62 復制和修復Replicationand repair 6 轉錄Transcription 188 環境信息處理 125 Environmental 翻譯Translation 15 information 癌癥：特定類aicrsif 27 processing 耐藥性：抗菌Drug resistance：antimicrobial 15 耐藥性：抗腫瘤藥Drugresistance：antineoplastic 8 內分泌代謝疾病Endocrine and metabolic disease- 1 免疫疾病Immune disease 16 感病 22 遺傳信息處理 神經退行性疾病Neurodegenerative disease 11 Genetic information 藥物依賴Substancedependence 12 processing 氨基酸代謝Aminoacid metabolism 1192 基他次生代謝物的生物合成 60 Biosynthesis of other secondary metabolites 289 碳水化合物代謝Carbohydrate metabolism 117 能量代謝Energymetabolism 172 聚糖的生物合成和代謝Glycan biosynthesis and metabolism 81 人類疾病代謝 12849 1184 Humandiseases 萜類和多酮類的代謝Metabolism of terpenoidsandpolyketides 180 核苷酸代謝Nucleotide metabolism 39 異種生物降解和代謝Xenobioticsbiodegradationandmetabolism 8 老化Aging 6 消化系統Digestive system 21 內分泌系統Endocrinesystem 9 有機系統 環境適應Environmental adaptation |1 Organismal systems 排泄系統Excretory system 16 神經系統Nervous system 15 0 100 200 300 數量Number霉素的生物合成、靈菌紅素和萬古霉素類抗生素的生物合成等。這些抗生素具有廣譜抗菌、抗病毒和抗癌活性的藥物。生物堿類的合成主要包括異喹啉生物堿的生物合成、茛蓉烷/哌啶/吡啶生物堿的生物合成。另外，還有芥子油苷生物合成、吩嗪合成、苯丙烷類生物合成以及其他各種次生代謝物的生物合成。由此說明，類芽孢桿菌HNYJ2209J具有開發新型藥物的潛能。

表2CAZy數據庫注釋結果

Table2AnnotationresultsofCAZydatabase

2.6.7耐藥基因分析使用ResFinder數據庫預測發現，菌株HNYJ2209J含有489個耐藥基因，這些基因與已知耐藥基因的相似性較小，均低于50% ，且未在可轉移的質粒等移動原件上。其中四環素類抗生素耐藥基因數量較多（ 10.89% ），其次是氟喹諾酮類抗生素、青霉烷類抗生素、大環內脂類抗生素、頭孢菌素、氯霉素類抗生素、頭霉素類、氨基糖苷類抗生素、碳青霉烯類和肽類耐藥基因，分別占 10.31%.9.05%.8.88%.6.12%.4.86% /4.44%.4.44%.4.27% 和 4.11% 。

表3菌株HNYJ2209J基因組中編碼次生代謝物的基因簇列表

Table3List of gene clusters encoding secondary metabolites inthe genome of strain HNYJ2209J

注：一表示沒有比對上。Note：- indicates no homology.

2.6.8毒力基因注釋將HNYJ2209J菌株的基因序列與VFDB數據庫進行比對，在菌株HNYJ2209J中共找到954個毒力基因，其中，與已知毒力基因的相似性大于 60% 的有14個（表4）。

表4HNYJ2209J菌株毒力基因預測

Table 4Virulence gene prediction of HNYJ22O9J strain

3討論

大腸桿菌是人畜共患病原菌，對人類和動物的生命安全造成了巨大影響，尤其是攜帶NMD基因的超級耐藥大腸桿菌，使動物臨床出現了無藥可用的困境[18]。因此，尋找新型抗感染藥物成為控制細菌耐藥性和超級耐藥細菌的重要手段之二[19]。抗生素的廣泛應用和不合理使用是導致細菌耐藥性增強的主要原因之一[20]。這種情況使得新型抗菌藥物的研發變得尤為緊迫。然而，新型抗菌藥物的研發難度大、周期長，且新型抗菌藥物投入臨床使用的速度遠跟不上細菌耐藥的速度。因此，對于抗生素的新藥研發、發現和創新提出了緊迫的需求。近年來，一些具有抑制活性的天然產物和合成化合物陸續被報道。然而，這些新型藥物面臨著一些問題，如結構類型較少、活性相對較低、成藥性較差以及作用機制研究不足等。這些問題制約了新型藥物的研發和臨床應用。抗細菌感染的藥物主要來源于天然產物，其次是化學合成物。在天然產物中，微生物的次生代謝產物占據了主要地位。因此，從藥用植物內生菌中篩選抗菌小分子越來越受到重視。這種方法有望為新型抗感染藥物開發提供新的途徑[21]。

在我國，藥用植物種類繁多，其內生菌資源豐富[22]，這些內生菌及其代謝產物的開發和應用為開發生物活性物質和新的藥源提供了廣闊空間[23]。通過深入研究和開發利用這一豐富的資源，有望為抗菌藥物領域帶來新的突破和創新。連翹是木犀科植物連翹的干燥果實，為臨床常用的清熱解毒類中藥。連翹味苦、性寒，可瀉火，入心肺二經，主要含有苯乙醇苷類、木脂素類、萜類及揮發油、黃酮類等化學成分，具有清熱解毒、消腫散結、疏散風熱的功效，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌等多種藥理作用，且安全性較高，可用于治療風熱感冒、乳癰、瘰病腫痛等疾病。劉玉珍等24從連翹枝條中分離出13株內生菌，其中有10株內生菌對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有較強的抑菌活性。楊雪25從連翹中分離篩選到1株可產連翹苷的內生菌G10。翼玉良等2從連翹中篩選出抗菌活性較高的內生真菌9株、內生細菌7株和內生放線菌4株。袁保紅等2從連翹中分離出1株內生放線菌YBL-02，從其發酵產物中鑒定出1種酰胺類化合物。

本研究從連翹植物的根、莖、葉和花中分離出1株內生細菌HNYJ2209J，通過16SrRNA基因測序鑒定為類芽孢桿菌。通過平板對峙法抑菌能力檢測和全基因組測序研究發現，HNYJ2209J對同時攜帶NMD1/NDM5和NDM4/NDM5基因的超級耐藥大腸桿菌具有較好的抑菌效果。芽孢桿菌及其代謝產物作為抗生素的替代品備受關注，因為它們能產生抗菌活性產物及其他代謝產物，且部分能夠在腸道中定植，分泌酶類活性成分，具有調理胃腸道和提高飼料利用率的效果，因此被用作飼料添加劑和替代抗生素的重要原料。本研究發現的類芽孢桿菌具有潛在的抗菌活性和益生菌功能，為開發新型抗菌藥物和飼料添加劑提供了新的可能性。

本研究通過對菌株HNYJ2209J進行全基因組測序，并利用KEGG注釋對其代謝途徑進行分析，發現了8個與次級代謝產物合成相關的基因簇，推測菌株HNYJ2209J具有抗菌功能。耐藥基因分析結果顯示，菌株HNYJ2209J基因組中含有489個耐藥基因，未發現有可移動耐藥基因，說明其傳播耐藥基因的可能性較低。毒力基因注釋發現，菌株HNYJ2209J中共有954個毒力基因，且與已知毒力基因的相似性較低。由于耐藥基因和毒力基因的序列與已報道基因的序列相似性較低，因此還需要進一步深入研究。

抗生素曾用作飼料添加劑以促進動物生長并提高動物的抗病能力，但抗生素的長期應用和濫用導致細菌耐藥性增強，動物臨床出現多重耐藥和超級耐藥菌。我國于2020年7月全面禁止在飼料中添加抗生素，因此，尋找抗生素的替代物成為當前研究熱點。類芽孢桿菌可分泌多種環脂肽[28-30]，具有抗菌、抗病毒和免疫調節等功能，且不易產生耐藥性，在飼料添加劑領域有巨大應用潛力[31-32]。研究表明，添加環脂肽能降低斷奶仔豬的腹瀉率，改善生長性能，抑制腸道有害微生物生長等[33]；飼料中添加 50mg?kg^-1 環脂肽能促進羅非魚生長，提高羅非魚腸道脂肪酶活性[34]。因此，環脂肽對動物生長和代謝等具有促進作用，可作為飼料添加劑或替代抗生素，具有廣闊的應用前景。

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