棉花GhDMT7基因對5-氮雜胞嘧啶核苷的響應機制

doi：10.13304/j.nykjdb.2024.0522

中圖分類號：S56 文獻標志碼：A 文章編號：1008-0864（2025）08-0028-08

Response Mechanism of Cotton GhDMT7 Gene to 5-azacytidine

YANG Zhining1，2，LUXuke ^2，3 ，FANYapeng2，SUNYuping2，YUXin2，WANGLiang4， GAO Yongjian4，Gulijiayinashen Habuli4，Gulishaxi Nasiyi4，Wumuer Abudu4，HUANG Hui2，

ZHANG Menghao ² ，WANGLidong2，CHENXiao2，XIAO Lei2，ZHANG Xinrui2，WANG Shuai ^2，3 CHEN Xiugui ^2，3 ，WANG Junjuan2，GUO Lixue2，GAO Wenweil*，YE Wuwei1，2.3*

（1.CotonEngineeingResearch CenterofMinistryofEducation，CollgeofAgriculture，XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi

830052，China；StateKeyLaboratoryofotoBbreeingandIntegratedUtlzation，InstituteofCottonResearchCine

AcademyofAgriculturalSciences，HenanAnang4o，China；3.NationalCenterofTechnologyInnovationforComprsive UtilizationofSaline-alkaliLand，ShandongDongying257ooo，China;4.AgriculturalTechnologyExtensionCenterof Shawan City，Xinjiang Shawan 8321OO，China）

Abstract：To investigate the effects of 5-azacytidine（5-azaC）onthe expresson of the GhDMT7 gene andseed germinationofcotton（Gossypium hirsutum L.），this paper analyzed the expression level of GhDMT7and the growth traits of coton seed.TheGhDMT7genewas clonedand performedcomprehensivebioinformaticsanalysis.Theresults showed that GhDMT7 protein was astable hydrophilic protein with no signal peptide and transmembrane domains. Undersalt stress conditions，the malondialdehyde content incotton leaves increased，indicating exacerbated membrane damage.5-azaC exhibited a dosage efect on GhDMT7 expression with slightly up-regulated expression at low dosage and down-regulated expression at high dosage，and decreased 5-methylcytosine （ ^5mC ）content.

Furthermore，the treatment with 50μmol?L^-1 5-azaC significantly enhanced seed germination potential and growth parameters，which promoted seed germination.Above results laid a foundation for further studying the function of GhDMT7 on coton growthand development，and provided genetic resources forbreeding new varieties of salineresistant cotton.

Keywords：Gossypium hirsutum; DNA methyl transferase；gene cloning; bioinformatics analysis；qRT-PCR

棉花（Gossypiumhirsutum L. ）是重要的經濟和纖維作物，也是鹽漬地的先鋒作物。隨著我國人口數量不斷增加，耕地面積逐年減少，糧棉爭地矛盾日益凸顯，棉花生產受到嚴重影響，而面積廣闊的鹽堿地為棉花生產提供了巨大的種植空間。雖然棉花是鹽堿地的先鋒作物，但其在發芽、開花、結鈴等一些關鍵階段對鹽脅迫較敏感2。鹽堿地土壤中鹽分含量過高導致離子脅迫，土壤堿化引起根系氧化應激反應，進而影響棉花種子萌發、根系生長、葉片展開、生殖器官形成等，最終導致棉花產量和品質下降。近年來土壤鹽堿化加劇、土壤退化問題日益突出，將給作物生產帶來嚴重影響。

表觀遺傳是在DNA序列不變的前提下，基因表達發生可遺傳改變的生物學現象，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、RNA修飾、染色質重塑和非編碼RNA調控5]。5-甲基胞嘧啶 ^′5mC） 是重要的DNA修飾之一，具有多種生物學作用。研究發現，小麥（Triticumaestivum）幼苗葉片和根中 ^5mC 含量隨著鎘水平的增加呈先升高后降低趨勢，說明在不同脅迫條件下小麥幼苗體內的甲基化水平存在差異。此外， ^5mC 含量及整體DNA甲基化水平與表觀遺傳變化有關，在脅迫條件下，苜蓿（LactucasativaL.）葉和根中的 ^5mC 含量增加。研究發現，生物或非生物脅迫會影響DNA甲基化，從而調控應激反應基因的表達。DNA甲基化通過調控基因的表達影響植物對鹽堿脅迫等逆境的耐受能力。DNA甲基轉移酶是催化DNA甲基化的關鍵酶，能夠識別特定的DNA序列，催化甲基從輔因子S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）轉移到胞嘧啶殘基的5位碳原子上[0]。許多植物中均鑒定出了DNA甲基轉移酶基因，如擬南芥[、小麥[]、水稻[3]、番茄[4]和玉米[15]等。DNA甲基化在響應環境刺激方面發揮著重要作用[]在棉花D基因組中發現了8個DNA甲基轉移酶，根據其在染色體上的位置將其命名為GaDMT1～GaDMT8；在棉花A基因組鑒別出了9個基因，根據其在染色體上的位置將其命名為GrDMT1～GrDMT9；在AD1組鑒定出16個基因，根據其在染色體上的位置將其命名為GhDMT1～GhDMT16;在AD2組鑒定出18個基因，根據其在染色體上的位置將其命名為GbDMT1～GbDMT18，4個棉種中的DNA甲基轉移酶基因共有39個被定位于染色體[]，其中GhDMT7（GH_D09G0322）屬于陸地棉DNA甲基轉移酶家族成員之一。

鹽堿脅迫下棉花的抗逆機制研究已經取得了一些進展：植物可能通過調節滲透調節物質的合成和積累，以應對鹽分脅迫；同時，也可能通過活性氧清除系統來緩解氧化應激[8]。但在表觀遺傳調控方面，尤其是對DNA甲基化在逆境響應中的作用、對特定DNA甲基化抑制劑如5-氮雜胞嘧啶（5-azacytidine，5-azaC）作用的研究較少。因此，本研究探索不同水平的5-azaC對棉花種子萌發的影響，以及對DNA甲基轉移酶基因GhDMT7表達量的調控作用，分析5-azaC處理下種子的生長表現和GhDMT7表達水平，為進一步研究DNA甲基化在種子萌發中的調控機制奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料及處理方法

以9807棉花品種為研究對象，由保存和提供。該種質為多年自交純系材料、耐鹽鑒定對照材料。將種子播種在土壤混合物（蛭石：腐殖質 的花盆（ 340mL 中，置于生長室中培養，生長室溫度 20～25°C ，光照16h、黑暗 8h ，光照強度 13000lx ，相對濕度 80% 。待幼苗長至3葉1心期利用 200mmol?L^-1Na（ l進行處理，以清水為對照（CK），每處理重復3次。分別于處理0、6、12和 24h 采集葉片樣品，一部分用于丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量的測定，一部分用于GhDMT7基因的表達分析。

利用5-氮雜胞苷（5-azaC）作為DNA甲基化抑制劑研究DNA甲基化對種子萌發的影響，分別采用0、25、50、100和 200μmol?L^-1 的5-azaC處理種子，測定發芽勢及幼苗根長、鮮重。

1.2 主要試劑

基因克隆p505-d1高保真酶、基因克隆試劑盒C112-02、普通PCR酶p213-03、RNA提取試劑盒RC411-01、定量分析的反轉錄試劑盒R223-01和熒光定量試劑盒Q711-02購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；反轉錄試劑盒AH321-01購自北京全式金生物技術有限公司；DNA甲基化抑制劑5-azaC（A8790）和丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒（BC0025）購自北京Solarbio有限公司；植物5-甲基胞嘧啶（ 5mC ）ELISA試劑盒購自上海酶聯生物技術有限公司。

1.3RNA的提取和cDNA的制備

使用RNA提取試劑盒提取RNA；采用TransScriptIAll-in-OneFirst-StrandcDNASynthesis SuperMix for qPCR （One-Step gDNARemoval）試劑盒將RNA反轉錄為cDNA;使用HIScriptIIRTSuperMixforqPCR試劑盒制備用于熒光定量的cDNA。所有試驗步驟均按照試劑盒說明書執行。

1.4GhDMT7基因克隆

從cottonFGD數據庫（https：//cottonfgd.net/）獲取GhDMT7基因的序列信息，并基于該序列設計引物GhDMT7-F（5'-ATGGATCAAAATGGTTCTGGTGG-3'）和GhDMT7-R 5^° -TCATTGGTTCCTTTGCATGCATC-3'），以cDNA為模板進行PCR。PCR體系總量為50μL ，包括 dH₂O 18μL，2×F PhantaMaxMasterMix26μL， 引物 （10μmol?L^-1， 各 2μL，cDNA2μL PCR擴增產物通過 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將目標條帶使用膠回收試劑盒進行純化。采用pEASY-BluntZeroCloningKit連接片段，并將重組質粒轉化至 DH5α 感受態細胞。為篩選陽性克隆，將菌液均勻涂布于含 50mg?mL^-1 卡那霉素的LB培養基，并在培養箱中 37°C 過夜培養；挑選單個菌落進行PCR鑒定；將陽性克隆進行測序驗證，以確保序列的準確性。

1.5 qRT-PCR

采用Trans Start Top Green qPCR SuperMix熒 光定量試劑盒進行實時熒光定量PCR （quantitativerealtimePCR，RT-qPCR），熒光定量 引物序列為F：5'-AGGTCGACACAGTGGCTTAT3';R：5'-ATTCGTTTGCTCCCACCAAC-3'。每個反應包含 100ng cDNA，上下游引物各 0.4μL SuperMix 10μL ，加 至 20μL 。擴增程序：95°C5min;95°C15s，58°C20s，72^°C30s，34 個循環。每組試驗包括3個生物學重復和3個技術重復，以 基因作為內參。

1.6GhDMT7基因的生物信息學分析

利用Expasy 的 Protparam工具（https：//web.expasy.org/protparam/）分析GhDMT7蛋白親疏水性和基本理化性質;使用NetPhos-3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetPhos-3.1）預測GhDMT7蛋白的潛在磷酸化位點；使用YinOYang-1.2（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？YinOYang-1.2）預測糖基化位點；通過SignalP-5.O（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）檢測信號肽；使用TMHMM-2.0（https：//services. healthtech. dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）預測跨膜結構域；利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）分析GhDMT7蛋白的二級結構；使用SwissModel （https：//swissmodel.expasy.org/）預測GhDMT7蛋白的三級結構。

2 結果與分析

2.1陸地棉GhDMT7蛋白理化性質分析

PCR擴增成功獲得了預期大小為1911bp的GhDMT7基因。進一步分析GhDMT7蛋白，其分子式為 C₃₁₂₂H₄₈₄₉N₈₅₃O₉₈₄S₂₅ ，相對分子質量為70.884kD ，理論等電點為4.78。該蛋白具有97個天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）殘基，總負電荷，含有63個精氨酸（Arg）和賴氨酸（Lys）殘基，預測其為一種堿性蛋白。不穩定系數為39.83，屬于穩定蛋白，脂肪系數為 80.20 。亮氨酸（Leu）含量最高，占 10.2% ，其次是絲氨酸（Ser），占比為 8.2% ，色氨酸 （Trp） ）含量最低，僅 1.6% （表1）。經預測，該蛋白在哺乳動物體外紅細胞中的半衰期為 30h ，在酵母體內大于 20h ，在大腸桿菌體內大于 10h ，顯示該蛋白相對較穩定。ProScale預測表明，GhDMT7蛋白中的第518位氨基酸顯示出最高的疏水性值（1.811），而第257和258位氨基酸則展示最低的親水性值（-2.878）。由此推測，GhDMT7序列中親水性氨基酸的數量顯著多于疏水性氨基酸，可能屬于親水性蛋白。SignalP在線網站預測結果顯示，GhDMT7蛋白不含有信號肽，推測該蛋白屬于非分泌型蛋白。通過TMHMM網站對其跨膜結構域進行分析顯示，該蛋白不含跨膜螺旋，跨膜螺旋氨基酸殘基數量的期望值為0.22201；在蛋白的前60個氨基酸中，預測的跨膜螺旋氨基酸數量期望值為0，總體位于膜內側的概率為0.00063。因此，推斷該蛋白為胞外蛋白。

表1各氨基酸占比

Table1 Proportion of amino acid

2.2 GhDMT7蛋白的磷酸化位點和糖基化位點分析

蛋白磷酸化是一種非常普遍的翻譯后修飾類型，通過酶促反應將磷酸基團轉移到蛋白質組氨基酸殘基上。這一過程在生物體內廣泛存在，蛋白磷酸化與去磷酸化相互作用，幾乎涉及生命活動的所有過程，且與信號傳導、細胞周期、生長發育以及癌癥的發生和發展密切相關。利用NetPhos3.1Server進行預測，結果（圖1）顯示，GhDMT7蛋白具有64個磷酸化位點，其中包括43個絲氨酸（Ser）、15個蘇氨酸（Thr）和6個酪氨酸（Tyr）磷酸化位點。此外，通過YinOYang-1.2的預測分析發現，該蛋白中沒有N-糖基化位點，但包含80個0-糖基化位點。

2.3蛋白質的二級結構和三級結構預測

蛋白質的二級結構是指多肽主鏈骨架原子在空間特定的盤旋或折疊排列方式，獨立于氨基酸殘基的側鏈構象，主要形式包括 ∝ -螺旋、 .β -折疊、β-轉角和無規卷曲[9]。GhDMT7蛋白二級結構包括250個 ∝ 螺旋（ 39.31% ） ，53 條延伸鏈（ 8.33% ）、29個β -轉角 4.56% 和304個無規卷曲 （47.80% （圖2）。

圖1GhDMT7蛋白磷酸化位點預測

Fig.1Prediction of phosphorylation sites of GhDMT7 protein

三級結構（圖3）預測表明，GhDMT7蛋白質由多個螺旋和折疊區域組成，這些區域通過氫鍵、疏水作用和其他非共價相互作用緊密地連接在一起。這種結構特征有利于GhDMT7在DNA甲基化過程中識別和結合特定的DNA序列，并催化甲基轉移到DNA上。

Fig.2Prediction of secondarystructureofGhDMT7protein

圖2GhDMT7蛋白二級結構預測

圖3GhDMT7蛋白三級結構預測

Fig.3Prediction of tertiary structure of GhDMT7 protein

2.4鹽脅迫引發棉花葉片膜脂質過氧化反應及MDA積累的動態分析

由圖4可知，隨著鹽脅迫時間的延長，棉花幼苗葉片出現明顯的萎蔫，包括脫落、葉脈變黑和失水等現象。由圖5可知，葉片中的MDA含量呈先升再降再升的變化趨勢。與CK相比，在脅迫處理6和 24h 時葉片MDA含量顯著增加，其中在鹽脅迫處理 24h 時MDA含量最高；在脅迫處理 ^12h 時與CK差異不顯著。這可能是 6h 時細胞剛開始響應鹽脅迫，導致MDA含量較高。到 12h 時，細胞可能啟動了抗氧化防御機制，使MDA含量暫時下降。但隨著處理時間的延長，抗氧化機制可能逐漸衰減或不足以應對持續的鹽脅迫，從而在 24h 時MDA含量再次上升。

2.55-azaC處理對GhDMT7基因表達及棉花種子萌發的影響

由圖6可知，隨著5-azaC劑量的增加，GhDMT7基因的相對表達量呈下降趨勢。在低水平的5-azaC處理下，GhDMT7基因的表達略有上調；隨著5-azaC劑量的增加，GhDMT7基因的表達量逐漸下降。對 ^5mC 含量測定結果（圖6）顯示，隨著5-azaC劑量的增加， ^5mC 含量先降低而升高。進一步研究不同5-azaC處理對棉花種子萌發的影響，結果（圖7）顯示，萌發3d時，與CK相比，5-azaC處理能促進棉花種子的萌發， 50μmol?L^-1 5-azaC處理表現最優，其發芽勢和根長顯著高于其他處理（圖8），綜上所述，不同水平5-azaC處理對GhDMT7基因的表達影響顯著， 50μmol?L^-1 5-azaC處理能顯著促進棉花種子的萌發和生長。

Fig.4Phenotype of seedlingunder salt stress

圖4鹽脅迫處理下的幼苗表型

圖5不同處理幼苗葉片的丙二醛含量

注：不同小寫字母表示不同處理間在 Plt;0.05 水平差異顯著。Note：Different lowercase letters indicate significant differencesbetweendifferent treatmentsat Plt;0.05 level.

3討論

本研究對GhDMT7蛋白的序列特征、親水性質、磷酸化位點預測、信號肽和跨膜結構等特征進行了分析，為深入研究GhDMT7基因的功能及其在棉花逆境響應中的作用奠定了基礎。植物遭受逆境脅迫時會產生大量的超氧自由基、MDA等，加劇膜脂過氧化程度。MDA的過量積累會引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯聚合，導致細胞膜的結構和功能發生改變。因此，脂質過氧化反應是植物細胞膜受損的重要標志，MDA含量的多少能直接反映細胞質膜過氧化水平[20]DNA甲基化在基因表達調控中扮演著關鍵的角色。研究發現，去甲基化對棉花耐鹽性有正向貢獻，高甲基化對棉花耐鹽性有負向影響2。5-azaC作為一種廣泛應用的DNA甲基轉移酶抑制劑，可降低植物基因組總體甲基化水平，被用來探究甲基化對基因表達的影響[22-23]。本研究表明，在 50μmol?L^-1 5-azaC處理下，棉花種子的發芽勢和根長高于CK，這表明適宜水平的5-azaC可促進棉花種子萌發。研究發現，適宜劑量的5-azaC處理能夠促進小麥種子較快且整齊地出苗，而高劑量的5-azaC處理則對小麥種子發芽產生抑制作用，并影響其根長和苗長等生長指標[24；1mmol?L^-1 5-azaC處理不僅推遲了早熟番茄果實成熟，還抑制了果實中種子的萌發25；外施5-azaC可有效調控三七果實成熟、種子后熟萌發和幼苗生長2。5-azaC對植物的DNA甲基化具有抑制作用，可以有效調控植物基因的表達27]。綜上所述，外源施用5-azaC可有效調控植物種子的 萌發、幼苗生長及植物基因組的甲基化水平。

Fig.5MDA content in leaves of seedling under salt stress

圖6不同5-azaC處理下GhDMT7基因的表達量及 ^5mC 含量 Fig.6Expression level of GhDMT7 gene and ^5mC content under different 5-azaC treatments

注：不同小寫字母表示不同處理間在 Plt;0.05 水平差異顯著。

Note：Diferent lowercase letters indicate significant differences between different treatments at Plt;0.05 level.

圖7不同5-azaC處理下棉花種子萌發的表型

Fig.7Germination phenotype of cotton seed under different 5-azaC treatments

圖8不同5-azaC處理下棉花種子的發芽勢、根長和鮮重

Fig.8Germination potential，root length and fresh weight of coton seed underdiferent 5-azaC treatments

注：不同小寫字母表示不同處理間在 Plt;0.05 水平差異顯著。

DNA甲基化在基因表達調控中起重要作用。本研究發現，GhDMT7基因的表達對5-azaC處理呈現出劑量效應， 50μmol?L^-1 的5-azaC處理能夠促進棉花種子的萌發和生長。5-azaC被隨機摻入新合成的DNA鏈而不是胞嘧啶中，因此，DNA甲基轉移酶活性對劑量和時間依賴性降低，隨后是隨機序列的基因組低甲基化[28]。本研究發現，不同劑量的5-azaC處理對植物體內 ^5mC 含量的影響存在差異，在低水平處理下， ^5mC 含量降低，這表明5-azaC促進低甲基化；隨著5-azaC劑量的增加，^5mC 含量上升，這表明植物對5-azaC可能產生抗性，導致體內 ^5mC 水平恢復平衡狀態。在較高劑量的5-azaC處理下，植物細胞可能通過調整自身的甲基化模式來適應這種化學壓力，最終達到一種新的甲基化平衡狀態[29]。5-azaC處理會影響GhDMT7的表達，進而改變棉花細胞內的甲基化水平，影響相關基因的表達，最終表現為提高棉花對鹽脅迫的耐受性，并促進其生長。

本研究對GhDMT7基因的功能和調控機制進行了初步研究，不僅有助于揭示GhDMT7基因在棉花生長發育中的作用機制，還為進一步探討植物基因表達調控和甲基化修飾的關系提供了重要參考。未來可進一步探討GhDMT7基因與其他相關基因的相互作用，以及其在棉花抗逆性和生長發育調控中的作用機制，從而為棉花抗性改良和培育抗鹽新品種提供理論和實踐基礎。

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