堿性木聚糖酶表達及耐熱性改造

doi：10.13304/j.nykjdb.2024.1030

中圖分類號：Q78 文獻標志碼：A 文章編號：1008-0864（2025）08-0073-07

ExpressionandThermostabilityModificationofAlkalineXylanase

ZHANG Yiyang1，2，LIU Tuoyu2，WANG Yuan3，TIAN Jian3，GUANFeifei2* （1.ColegeofLifeSciences，QingdaoAgriculturalUniversity，ShandongQingdao266oo，China；2.BiotechnologyResearch Institute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing 1Ooo81，China；3.Instituteof Animal Science， ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing1Oo193，China）

Abstract：Xylanase（EC3.2.1.8）isanimportantindustrialenzyme，which is widelyused inindustriessuchas food， fed，papermaking，textileandbiofuels.Pm10868 is derived from the genome of rumen ciliates，which could be expresedinyeast，butcouldnotbeexpressed inEscherichiacoliBL21.Inorder toincreasetheexpressonlevelof xylanase PmlO868 in Escherichiacoli and futher explore therelationshipbetweensolubleexpressionlevelandamino acid sequence in Escherichia coli，byutilizing the existing generation model MPB-MUTand expressionlevel prediction model MPB-EXPin the laboratory，the top3xylanase Pm1O868mutantswere screenedoutfor the detectionof enzymatic propertiessuchas expresionlevel，thermostabilityandcatalyticeficiency.Theresultsshowed that theexpressonlevels of 3 mutants in E .coli were significantly increased.Among them，thespecificactivityof Pm10868-117（138.9 U·mg-1） was approximately 2 folds that of the wild type expressed in yeast（62.5 U·mg^-1 ）. The k_eat/K_m of Pm10868-117 was 228.09 m L?min^-1?mg^-1 ，which was about 1.2 times that of wild type.When incubated at for ¹h ，the enzyme activity of wildtype Pm10868 was 27% of original enzyme activity，while the enzyme activity of Pm1O868-117 was 81 % of original enzymeactivity，approximately 3 times that of the wild type.When incubated at 50^°C for 20 min，the enzyme activity of the wild-type Pm10868 was only 6% oforiginal enzyme activity，while the enzyme activity of Pm1O868-117was 49% of original enzymeactivity.Inconclusion，thespecificactivity，catalyticeficiencyandthermostabilityofPm1O868-117were all greatly improved.Molecular dynamics simulationanalysis ofthewild typeandmutant foundthatthe CBM（celulosebinding motif）fluctuationofPm10868-117wassignificantlyreduced，whichhelpedtoimprovetheoverallthermostability andbindingabilitywiththesubstrate，therebyenhancingthecatalyticeficiency.Aboveresultshad greatsignificancefor clarifyingthestructure-activityrelationshipofxylanasewithdiferentenzymaticproperties，andlayedatheoretical foundation for the molecular design of xylanase to meet the requirements of different application scenarios.

Keywords：xylanase；expression level; thermostability； catalytic eficiency；mechanism analysis

木聚糖酶（EC3.2.1.8）是O-糖苷水解酶，可催化復雜植物細胞壁多糖木聚糖的骨架β-D-木糖苷鍵的水解，是微生物二甲醇分解和植物細胞壁降解酶系統的重要組成部分1。據氨基酸序列相似性，內切-β-1，4-木聚糖酶分為不同的GH家族，其中大多數屬于GH10和GH11家族。木聚糖酶在食品、動物飼料[3、紙漿和造紙4、紡織和生物精煉等多個行業具有廣泛的應用價值5。傳統蛋白工程方法有定向進化和理性設計。定向進化模仿自然選擇，無需詳細結構和功能信息，適合結構未知或功能復雜的蛋白質，但需篩選大量突變體，步驟繁瑣、耗時耗力。理性設計基于對蛋白質結構和功能的深入理解進行定點改造，高效但需清楚蛋白質結構，且難預測多突變相互作用。半理性設計是將這2種方法相結合，利用已知信息通過生物信息學算法識別突變位點，以減少突變體的篩選數量，該方法比理性設計更加靈活實用，又比定向進化更有針對性，顯著提高了篩選理想突變體的概率8]。

蛋白質工程與人工智能的交叉是一個全新的研究領域，自誕生以來發展迅速，成果豐碩。該領域將生物學的復雜性與計算機技術的先進能力相融合，創造全新的方法和工具用于挖掘和設計蛋白質[0]。其目標是利用人工智能的數據處理能力、模式識別能力及強大的計算能力，預測蛋白質的結構、功能和動態行為。開發快速和低成本的算法具有極大的實用價值。例如，深度學習方法允許從蛋白質序列數據中提取復雜的特征，且這一過程無需依賴任何經驗知識，強大的模型和算法就能自動挖掘數據中的潛在模式和信息。準確預測蛋白質結構能夠用于藥物發現、抗體設計、了解蛋白質-蛋白質相互作用以及蛋白質與其他分子的相互作用[12]。

木聚糖酶 Pm10868 序列由本實驗室保存，它源自瘤胃纖毛蟲基因組，屬于木聚糖酶的GH10家族。前期研究表明，該酶能在畢赤酵母中成功表達，然而卻無法在大腸桿菌中表達。為了提高木聚糖酶 Pm10868 在大腸桿菌中的表達量，并深入探究在大腸桿菌中可溶性表達量與氨基酸序列之間的關系，借助實驗室已有蛋白質表達量預測模型MPB-EXP[13]和蛋白多點突變體生成模型MPB-MUT[3]對木聚糖酶 Pm10868 進行可溶性表達量與其耐熱性改造，旨在驗證蛋白質序列與表達的關聯及改造設計的可行性，為酶性能改良提供新方向。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌種 Pm10868 野生型菌株及質粒由本實驗室保存。木聚糖酶 Pm10868-117 基因委托通用生物（安徽）股份有限公司進行密碼子優化后合成。

1.1.2培養基及相關試劑試驗所用硫酸卡那霉素（kana）、PremixedProteinMarker、異丙基- _?β -D-硫代半乳糖苷（isopropyl β -d-1-thiogalactopyrano-side，IPTG）購自Solarbio公司； ExBlue 蛋白超快染色液購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；30% （質量體積分數）Acrylamide、 5× Tris-GlycineBuffer以及 5× SDS-PAGELoadingBuffer等藥品和試劑購自國內外公司。

LB（Luria-Bertani）培養基：胰蛋白脈 10g 酵母提取物 5g，NaCl 10g ，加雙蒸水至 1000mL ，攪勻，在 121^°C 滅菌 30min ，常溫保存備用。

1mol?L^-1 Tris-HCl緩沖溶液：在 800mL 蒸餾水中加人 121.1g Tris，用濃鹽酸調節 pH 至7后，定容至 1000mL 。

DNS（2，4-dinitrosalicylicacid）試劑：首先在4L的純水中加入 50g 的3.5-二硝基水楊酸，控制水浴溫度在 50°C 以下輕加熱，直至固體完全溶解；

然后向溶液中分別加入 80gNaOH 和 1500g 酒石酸鉀鈉，持續攪拌，確保所有組分充分溶解。最后將溶液定容至5L，避光保存。

1% 櫸木木聚糖：稱取1g櫸木木聚糖，加入80mL （204號 ddH₂O ，微波爐加熱至完全溶解，定容至100mL，4^°C 保存備用。

1.1.3儀器水浴鍋，上海恒科技術有限公司；超凈臺，北京亞泰科隆儀器技術有限公司；生化培養箱，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；HITACHI日立離心機，妙生科技；搖床，上海知楚儀器有限公司；超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.2 重組蛋白的表達及純化

將測序正確的質粒轉入大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，選取陽性克隆子培養種子液；隨后，以 1% （體積分數）接種量將種子液接人含卡那霉素抗性的培養基中，在 37^°C 培養至細菌處于對數生長期（ 為0.6～0.8）；添加異丙基 ?{β -D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）至 0.1mmol^?L^-1 ，于 16°C 、200r?min^-1 下繼續培養 18～20h ;離心收集菌體，按相應菌液體積的1/10加入 20mmol?L^-1 Tris-HCl重懸菌體，利用超聲波破碎儀進行細胞破碎；離心后的上清液用鎳柱進行蛋白純化，純化后的蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。BCA（bicinchoninicacid）蛋白定量按照試劑盒說明書進行。

1.3重組木聚糖酶酶學性質及動力學參數測定

1.3.1重組酶的最適反應條件及穩定性測定使用DNS測定還原糖產物法測定酶活力。適當稀釋待測酶液，確保在 540mm 下吸光度為0.5～2.0。

最適溫度測定：分別在40、45、50、55、60℃測定酶活力，將最適溫度下的酶活力定為 100% ，計算其他溫度下的相對酶活力。

最適 pH 測定：通過BR（Britton-Robinson）緩沖液配制 pH 分別為 5、6、7、8、9、10、11、12 的10.0mg?mL^-1 的櫸木木聚糖底物，在最適溫度條件下反應后測酶活力，把最適 pH 下的酶活力定為100% ，計算其他 pH 下的相對酶活力。

熱穩定性測定：將 0.5mg?mL^-1 的酶液分別在45和 50°C 水浴保溫，每隔 20min 測定酶活力，將初始酶活力定為 100% ，計算熱處理不同時間下的酶活力。

pH穩定性測定：將 0.5mg?mL^-1 的酶液在最適溫度下，分別在 pH5.6.7.8.9.10.11.12 中孵育1h，測定酶活力，將最高酶活力定為 100% ，計算不同pH下的酶活力。

1.3.2重組酶的反應動力學參數測定分別以不同質量濃度 （1.0～50.0mg^?mL^-1） 的木聚糖溶液（ pH 10） 為底物，在酶的最適反應溫度下測定酶活性，利用Graphpadprism軟件作圖，計算重組酶酶促反應速度為最大速度一半時的底物質量濃度（K_m） 和酶完全被底物飽和時的反應速度（ V_max） 。

2 結果與分析

2.1 木聚糖酶 Pm10868 可溶性表達改造與檢測

利用生成模型生成 Pm10868 多點突變體，并利用表達量預測模型篩選排名前3的突變體進行試驗驗證（表1）。首先，將其分別按照大腸桿菌密碼子優化，連接到pET-28（a）載體上，隨后轉化至BL21（DE3）菌株進行異源表達。SDS-PAGE電泳結果（圖1A）表明，野生型 Pm10868 在大腸桿菌中完全不表達，而 Pm10868–14.Pm10868–117 和 Pm10868- 153在大腸桿菌中的可溶性表達量依次遞增。酶活檢測結果（圖1B）顯示， Pm10868-117 的活性最高，達到 80778.88U?L^-1;Pm10868-153 的可溶性表達量最高，但酶活較低，僅為 10 431.99U?L^-1 Pm10868-14的酶活為 2235.61U?L^-1 。由此表明，結合MPB-MUT模型設計突變，并利用MPB-EXP模型進行預測，可以有效地提升木聚糖酶Pm10868 在大腸桿菌內的可溶性表達量。鑒于此，后續選擇酶活性最高的 Pm10868-117 進行深人研究。

表1野生型及其突變體蛋白的篩選指標與突變位點

Table1Screening criteria and mutation sites for wild-type and its mutant proteins

圖1 Pm10868 及其突變體在大腸桿菌中表達與粗酶液活性

Fig.1Expression and crude enzyme activity of Pm10868 anditsmutantsinEscherichiacoli

Fig.2DeterminationofexpresionofpurificationandrelativeactivityofPm1O868-117underdifferent temperaturesandpH

2.2木聚糖酶 Pm10868–117 的最適溫度和最適pH分析

為進一步研究木聚糖酶 Pm10868-117 的功能與性質，將其在大腸桿菌中進行誘導表達，結果（圖2A）表明，經過鎳親和柱純化后，獲得條帶單一的酶液， Pm10868-117 分子量為 57kD ，與理論相對分子量一致。隨后，在 40～60^°C 范圍內，以Pm10868 在畢赤酵母中表達獲得的凍干粉為對照，對 Pm10868-117 的最適反應溫度和pH進行檢測，結果（圖2B和C）顯示，在相同環境條件下，野生型 Pm10868 與 Pm10868-117 的最適溫度均為50°C ，最適 pH 均為10。

2.3木聚糖酶Pm10868-117的熱穩定性和 pH 穩定性分析

進一步評估 Pm10868 與突變體Pm10868-117的穩定性，結果（圖3）表明，在 45°C 孵育1h，野生型 Pm10868 的酶活為原始酶活的 27% ，而Pm10868-117的酶活為原始酶活的 81% ，約為野生型的3倍；在 50°C 孵育 20min ，野生型 Pm10868 的酶活僅為原始酶活的 6% ，而 Pm10868-117 的酶活為原始酶活的 49% （圖3B）。以上結果表明，Pm10868-117在45和 50°C 下的熱穩定性優于野生型。 Pm10868 和 Pm10868-117 的 T_m 分別為55.13與 55.49^°C 。進一步分析pH穩定性，結果（圖3C）表明，在 pH 為6～10時，野生型 Pm10868 與Pm10868-117均呈現出良好的活性，差異較小。

2.4木聚糖酶Pm10868-117的酶比活和動力學參數分析

為了進一步比較 Pm10868 和 Pm10868-117 的活性，在最適反應條件下，對其酶比活進行檢測，以在畢赤酵母中表達的 Pm10868 作為對照，結果（圖4A）顯示，野生型 Pm10868 和 Pm10868-117 的酶比活分別為62.5和 138.9U?mg^-1 ，即 Pm10868- （20117的酶比活明顯升高，約為野生型的2倍。通過Pm10868 和 Pm10868-117 動力學參數擬合曲線（圖4B和C）得出， Pm10868 和 Pm10868-117 的 K_m 分別為3.48和 3.63mg?mL^-1 （表2），說明 Pm10868 與 Pm10868-117 親和力相似；另外， Pm10868-117 的 k_cat 和 k_cat/K_m 分別為 828.33min^-1 和228.09mL?mg^-1?min^-1 ，較野生型均提高了約1.2倍。綜上表明，在底物結合能力相似的情況下，木聚糖酶Pm10868-117 能更有效地將底物轉化為產物。

表2 Pm10868 和Pm10868-117的動力學參數Table 2Kinetic parameters of Pm10868 and Pm10868-117

2.5木聚糖酶 Pm10868–117 催化效率和熱穩定 性提高的分子機制解析

為了全面了解 Pm10868 和Pm10868-117的催化效率和熱穩定性提升的分子機制，利用AlphaFold2模擬其高級結構，結果（圖5A）發現，Pm10868 包括催化結構域和B型底物結合結構域CBM（cellulose-bindingmotif）[4]。隨后對其進行200ns 的分子動力學模擬分析，均方根偏差（root-mean-squaredeviation，RMSD）結果（圖5B）表明，隨時間延長， Pm10868 和 Pm10868-117 蛋白質結構的波動逐漸減小，說明均從初始構象過渡到更穩定的狀態。均方根波動（root mean square fluctuation，RMSF）結果（圖5C）表明，木聚糖酶Pm10868-117在N端CBM結構域（氨基酸21～134）的波動明顯減小，說明其穩定性增強，有助于增強蛋白的整體熱穩定性及其與底物的結合能力，從而提升催化效率[15]，而第51位氨基酸所在的loop區由野生型的蘇氨酸（T）突變成谷氨酸（E）后，波動增強，此氨基酸位于底物結合凹槽附近，該區域柔性增強，可能更便于底物的進出，從而增強催化效率[5]，且突變使得第437位的天冬酰胺轉變為絲氨酸，該位點處于結合口袋附近的loop區，突變后此區域附近的波動顯著減弱，穩定性增強，這有助于整體蛋白熱穩定性和活性的提升[]。

圖5結構信息圖與動態模擬分析

Fig.5 Structural information and dynamic simulation analysis

3討論

木聚糖酶作為一種重要的工業酶，在多個行業中具有重要作用。本研究組發現，木聚糖酶Pm10868 能在酵母中表達，卻無法在大腸桿菌BL21中表達。因此，借助實驗室已有模型MPB-MUT[13]和表達量預測模型MPB-EXP[13]篩選出Pm10868-117，Pm10868-14 和Pm10868-153共3條Pm10868 多點突變體，它們在大腸桿菌中的表達量顯著提升。其中， Pm1086888-117 表現最為突出，其酶比活、催化效率和耐熱性相較于野生型均有不同程度的提高。

通過對3個突變體的突變位點進行分析發現，突變氨基酸中超過 55% 的不帶電氨基酸突變為帶電氨基酸。在 Pm10868-117 中，T51E、S124E、A300E、T493K突變使不帶電的蘇氨酸、絲氨酸和丙氨酸突變為帶電的谷氨酸和賴氨酸。其中T51E、S124E和A300E這3個位點突變后，氨基酸所帶電荷轉變為負電荷，這種負電荷可能與周圍帶正電的氨基酸發生靜電相互作用。同樣，T493K突變后，氨基酸帶正電荷，可能與周圍帶負電的氨基酸發生靜電相互作用。這些靜電相互作用的增強可能引導蛋白質形成更穩定的三維結構，進而有利于蛋白質的正確折疊[18]。正確折疊的蛋白質有利于被細胞的蛋白質合成機制識別和加工，從而提高表達量[19]。 Pm10868 的催化活性中心為2個帶負電的谷氨酸，將其周圍原本不帶電的氨基酸突變為帶正電的賴氨酸，可有效增強靜電相互作用。并且，底物分子木聚糖帶負電，這使得底物更容易靠近活性中心，從而提升催化活性。谷氨酸和天冬氨酸的側鏈均帶有負電荷，這些負電荷可以與帶正電荷的賴氨酸形成靜電相互作用2，有助于形成三維結構，引導蛋白質正確折疊，從而增加可溶性。且這些側鏈還可以與水分子形成氫鍵，調節蛋白質分子表面的水化層，在一定程度上防止蛋白質因高溫而聚集。因此，蛋白親水性增加，從而增加了蛋白的溶解度。在木聚糖酶 Pm10868-117 中，V107Q、A300E氨基酸均從非極性變成極性狀態，根據相似相溶原理，更易于增加蛋白質溶解度[21]。

本研究通過計算模型優化蛋白質表達的新策略，成功提升了木聚糖酶 Pm10868 在大腸桿菌中的可溶性表達量，同時提高了該酶的催化效率和熱穩定性。研究結果不僅證明了氨基酸序列與高效表達之間存在聯系，也證實了通過設計改造蛋白質序列來提高表達水平、熱穩定性和催化效率的可行性，為滿足木聚糖酶在不同行業的特定需求提供了可能[22]。

參考文獻

[1]MENDONCA M， BARROCA M， COLLINS T. Endo-1，4-β- xylanase-containing glycoside hydrolase families：characteristics， singularitiesand similarities [J/OL].Biotechnol.Adv.，2O23，65： 108148 [2024-11-20]. https：//doi.org/10.1016/j.biotechadv.2023. 108148.

[2]ZARAFETA D，GALANOPOULOU AP，LENI ME，et al.. XynDZ5：a new thermostable GH1O xylanase [J/OL]. Front. Microbiol.，2020，11： 545 [2024-11-20].https：//doi.org/10.3389/ fmicb.2020.00545.

[3]GUPTAGK，DIXIT M，KAPOOR R K，et al..Xylanolytic enzymesin pulp and paper industry：new technologies and perspectives [J]. Mol.Biotechnol.，2022，64（2）： 130-143.

[4]BASIT A，LIU J，RAHIM K， et al. Thermophilic xylanases： from bench to botle[J].Crit.Rev.Biotechnol.，2018，38（7）：989-1002.

[5]MALHOTRA G，CHAPADGAONKAR S S. Thermo-alkali stablebacterial xylanase fordeinking of copierpaper[J/OL].J. Genet.Eng.Biotechnol.，2023，21（1）：107 [2024-11-20]. https：// doi.org/10.1186/s43141-023-00563-0.

[6]XING H， ZOU G，LIU C， et al.Improving the thermostability ofa GH11 xylanase by directed evolution and rational design guided byB-factor analysis[J/OL].EnzymeMicrob.Technol.， 2021， 143： 109720 [2024-11-20]. https：//oi.org/10.1016/j.enzmictec. 2020.109720.

[7]LI G， ZHOU X，LI Z，et al.. Significantly improving the thermostability ofahyperthermophilic GH1Ofamilyxylanase XynAF1 by semi-rational design[J].Appl.Microbiol. Biotechnol.，2021，105（11）： 4561-4576.

[8]CHENQ，XIAOY，SHAKHNOVICHEI，etal..Semi-rational design and molecular dynamics simulations study of the thermostability enhancement of cellobiose 2-epimerases [J]. Int.J.Biol.Macromol.，2020，154：1356-1365.

[9] KHAKZAD H， IGASHOVI，SCHNEUING A， et al..A new age 2023，14（11）： 925-939.

[10]QIU Y，WEIG W.Artificial intelligence-aided protein engineering：from topological data analysis todeep protein language models [J]. ArXiv，2023，23（7）：14587-14596.

[11]CHOWDHURY R，BOUATTAN，BISWASS，et al..Singlesequence protein structure prediction using a language model and deep learning [J]. Nat.Biotechnol.，2022，40（11）： 1617-1623.

[12]JISNA V A，JAYARAJ P B.Protein structure prediction： conventional and deep learning perspectives [J].Protein J.， 2021，40（4）： 522-544.

[13]LIU T， ZHANG Y，LI Y，et al.. Effective gene expression prediction and optimization from protein sequences [J/OL]. Adv.Sci.（Weinh），2025，12（8）：e2407664[2024-11-20p// doi.org/10.1002/advs.202407664.

[14］李恒，唐雙焱.碳水化合物結合結構域研究進展[J].微生物 學報，2017，57（8）：1160-1167. LI H，TANG S Y.Carbohydrate-binding modules：assisted polysaccharide recognition [J]. Acta Microbiol. Sin.，2017， 57（8）： 1160-1167.

[15]MEHMOOD A，NAWAB S， JINY，et al..Mutational impacts on the N and C terminal domains of the MUC5B protein： a transcriptomicsand structural biology study [J]. ACS Omega， 2023，8（4）：3726-3735.

[16]DEVILLARD E，BERA-MAILLET C，FLINT HJ，et al. Characterization of XYN1OB，a modular xylanase from the ruminal protozoan Polyplastron multivesiculatum，with a family 22carbohydrate-binding module that binds tocellulose[J]. Biochem.J.，2003，373（Pt 2）： 495-503.

[17］杜坤，甘一如，黃鶴.活性位點鄰近的？-loop對胰蛋白酶熱穩定 性和活性的影響[J].高校化學工程學報，2017，31（3）：657-662. DU K， GAN Y R， HUANG H. Effects of ？-loop near active sites onthe stability and activityof trypsin [J].J. Chem.Eng. Chin. Univ.，2017，31（3）： 657-662.

[18]FURUITAK，JEEJ，FUKADA H，etal..Electrostatic interaction between oxysterol-binding protein and VAMPassociated protein A revealed by NMR and mutagenesis studies[J].J. Biol. Chem.，2010，285（17）：12961-12970.

[19]HETZ C. The unfolded protein response： controlling cellfate decisions under ER stress and beyond [J].Nat.Rev. Mol.Cell Biol.，2012，13（2）： 89-102.

[20]HOUQ，BOURGEAS R，PUCCI F，et al..Computational analysis of the amino acid interactions thatpromote or decrease protein solubility[J/OL]. Sci.Rep.，2018，8（1）： 14661 [2024-11-20]. htps：//doi.org/10.1038/s41598-018-32988- ΔW ：

[21]TRETYACHENKO V，VYMETAL J，NEUWIRTHOVAT， etal..Modern and prebiotic amino acids support distinct structural profiles in proteins [J/OL]. Open Biol.，2022，12（6）： 220040 [2024-11-20]. https：//doi.org/10.1098/rsob.220040.

[22]RAJ A，KUMAR S，SINGH S K.A highly thermostable xylanase from Stenotrophomonas maltophilia： purification and partial characterization [J/OL]. Enzyme Res.，2013，2013： 429305[2024-11-20]. https：//doi.org/10.1155/2013/429305.