水稻生長調節因子GRF基因家族的鑒定及生物信息學分析

doi：10.13304/j.nykjdb.2024.0328

中圖分類號：S511，Q781 文獻標志碼：A 文章編號：1008-0864（2025）08-0018-10

Identification and Bioinformatics Analysis of Growth Regulating FactorGRFGeneFamily inRice

LIU Zhien，HEYong，WANG Zhicheng，ZHANXiaokang，WANG Tingbao， LIU Yaowei，TIAN Zhihong （College of Life Science，Yangtze University，Hubei Jingzhou 434025，China）

Abstract：Asa plant-specific transcription factor，growth regulatingfactor（GRF）plays an important rolein plant growth and development.ToidentifythemembersofthericeGRFgene family，proteinphysicochemical properties，sequence comparison，secondaryand tertiarystructureprediction，subcellularlocalisation，genestructure，cis-acting elements， chromosomallocalisation，evolutionary treeconstructionand covariance were analyzedusing the bioinformatics methods.The results showedthat12GRF genes were identified.Thelengthofrice GRFproteins was 211～456aa，the molecularweight was 22.3～49.3 kD，theisoelectric point was 4.7～9.85，and the subcelularlocalisation was mainly located inthenucleus.The rice GRF genes contained 2～5 exons，and the promoter elements were mainly relatedto hormone regulation，stress response and light response.12 GRF genes were unevenly distributed on chromosomes 2，3，4，6，7，11 and12.GRFgenes in rice werecloselyrelatedtomaize，andhadlowhomologywithtomatoandArabidopsis.There wereno tandemduplicationevents in the rice GRF genes，and large segmental duplications were the main expansion modes.Above results provided a theoretical basis for the in-depth study of rice GRF gene function.

Keywords：rice；growth regulating factor;GRF gene family;bioinformatics

轉錄因子（transcriptionfactor，TF）也叫反式作用因子，是一種特殊的蛋白質，其能與基因上游的啟動子序列結合，在其他蛋白的共同參與下能夠抑制或激活轉錄，在植物生長發育、果實成熟、衰老、應答和適應各種脅迫以及防御反應中起重要作用[2-3]。生長調節因子（growth regulating factor，GRF）是一種植物特有的轉錄因子，Vanderknaap等4從水稻中鑒定出了首個生長調節因子OsGRF1，其受赤霉素調控能影響水稻莖的伸長。GRF在N端含有QLQ（谷氨酸、亮氨酸、谷氨酸）和WRC（色氨酸、精氨酸、半胱氨酸）2種結構域。QLQ結構域是一個復雜的疏水結構域，可能與蛋白互作相關，其與酵母SWI2/SNF2蛋白的N端尾部結構相似，SWI2/SNF2蛋白結構在酵母中參與染色質重塑復合物的形成，推測QLQ結構域也可能具有此功能。WRC結構域與DNA結合相關，包含1個核定位信號（nuclearlocalizationsignalNLS）區域和1個鋅指結構。GRF的C端與N端相比保守性較低，存在TQL、GGPL等保守結構域，這些保守結構域只存在于特定的植物中，C端結構的多樣性可能導致生物學功能的差異。

研究發現，GRF轉錄因子存在于多種植物中，如擬南芥、油菜、葡萄、玉米、小麥、白菜及番茄，在調控植物生長發育過程中起重要作用[0-14]。在擬南芥中，GRF轉錄因子能通過表達量的增減來調控葉片和子葉組織細胞的大小，進而影響葉片和子葉性狀，此外還參與脅迫響應。油菜BnGRF2a基因的過表達能夠增大葉片，提高其葉綠素含量，增加籽油產量。在白菜中，BrGRF8基因的過表達能夠明顯促進細胞的增殖[13]。玉米ZmGRF10基因過表達導致葉片減小和植株變矮[4]。綜上所述，GRF轉錄因子對植物生長可能有雙向調控作用。

目前，對GRF基因的研究已經十分深入，關于水稻GRF基因功能的研究已有報道，但缺少對水稻GRF基因家族的生物信息學分析，因此，本研究利用生物信息學方法對水稻GRF基因家族進行鑒定，并對其編碼蛋白的基本理化性質和結構進行分析，構建系統進化樹，同時對GRF基因的結構、染色體定位、啟動子元件和共線性進行分析，以期為進一步研究水稻GRF基因功能奠定基礎。

1材料與方法

1.1水稻 GRF 基因的鑒定和理化性質分析

從Ensembl Plants （https：//plants.ensembl.org/ index.html）網站下載水稻粳稻（Oryza sativa subsp. japonica）基因組文件和基因注釋文件，通過Pfam 數據庫下載植物GRF蛋白QLQ（PF08880）和 WRC（PF08879）隱馬爾可夫模型數據[15]，利用 hmmsearch篩選水稻GRF基因，通過NCBI-CDD[16] （https：//www.ncbi. nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行確認。利用EXPASY網站的ProtParamtool（https：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件分析GRF蛋白的氨基酸數目、分子質量、等電點、平均親水系數和脂肪族氨基酸指數。通過GeneDoc軟件對水稻GRF氨基酸序列進行比對。

1.2水稻GRF蛋白的二級結構和三級結構預測

利用SOPMA二級結構在線預測軟件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page ：=/ NPSA/npsa_sopma.html）對水稻GRF蛋白二級結構進行分析。使用PHYRE2軟件（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/）預測蛋白三級結構，選取置信度高于 90% 的模型[18]。

1.3水稻GRF蛋白保守基序和基因結構分析

使用MEME 5.5.5 （https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）在線軟件分析水稻GRF蛋白的保守基序（motif）[9]，motif搜索數目設定為10。利用MEGA11進行系統進化樹分析，使用TBtools軟件對結果進行可視化[20]。

1.4水稻 GRF 基因的染色體定位和共線性分析

使用MG20 Σ（http：//mg2c.iask.in/mg2c_-v2.1/） 軟件繪制水稻GRF基因染色體定位圖2。通過MCScanX構建水稻GRF基因的種內共線性分析圖，使用TBtools對結果進行可視化。

1.5水稻 GRF 基因的系統進化分析

從PlantTFDB（https：//planttfdb.gao-lab.org/）選取擬南芥、番茄、玉米和水稻釉稻（Oryza sativa subsp.indica）GRF蛋白的氨基酸序列，在MEGA11軟件上進行ClustalW多重比對22]，再對結果使用鄰位連接法（neighbor-joining，NJ）構建種間系統進化樹，自展系數（bootstrap）設置為 1000 。

1.6水稻 GRF 基因家族順式作用元件預測

通過TBtools軟件提取水稻GRF基因啟動子上游 2 000bp 序列，利用PlantCARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行啟動子區域的順式作用元件分析[23]。

2 結果與分析

2.1水稻 GRF 基因的鑒定和基本理化性質分析

水稻基因組中共鑒定出12個GRF基因。對水稻GRF基因編碼蛋白的基本理化性質進行分析，結果（表1）顯示，水稻GRF蛋白的氨基酸數目為211～456aa，分子量為22310.32～49 361.83 Da;理論等電點為4.78～9.85，除 0s04g0600900 、0s03g0729500，0s07g0467500 為酸性蛋白外，其他GRF蛋白均為堿性蛋白；平均親水性系數均為負值，即均為親水蛋白；不穩定指數均大于40，即為不穩定蛋白。脂肪酸指數為45.21～75.30。

2.2水稻GRF蛋白的氨基酸序列比對分析

水稻GRF蛋白的氨基酸序列比對結果（圖1）表明，蛋白總體呈較強的保守性，蛋白成員間存在一定差異，其中 0s04g0574500，0s02g0678800 0s07g0467500 這3個成員與其余9個成員相比在C端區域存在缺失，表明這些蛋白在進化過程中功能可能發生改變。

2.3水稻GRF蛋白二級和三級結構分析

對水稻GRF蛋白二級結構進行預測，結果（圖2和表2）表明，該蛋白家族成員的二級結構相似度較高，主要包含 ∝ 螺旋和無規則卷曲及少量延伸鏈和β轉角。亞細胞定位（表2）顯示， 0s07g0467500 定位于葉綠體和細胞核， 0s04g0574500 定位于葉綠體和線粒體，其他均定位于細胞核。

由圖3可知，水稻GRF蛋白的三級結構較為復雜，其中 0s02g0678800 與其他蛋白存在差異，該蛋白的三級結構大致分為2個區域，較大的N端和較小的C端。

表1水稻GRF基因編碼蛋白的理化性質

Table1 Physicochemical properties of proteins encoded by the GRF genes in rice

表2水稻GRF蛋白二級結構和亞細胞定位

Table 2Secondary structure analysis and subcellular localization of GRF proteins in rice

注：藍色一α螺旋；紅色一延伸鏈；綠色一β轉角;紫色一無規則卷曲。

2.4水稻GRF基因結構及蛋白保守基序分析

對水稻GRF基因的結構進行分析，結果（圖4）顯示， 0s11g0551900 含有2個外顯子， 0s02g0776900 Os06g0204800、Os03g0729500、Os02g0678800、Os07g0467500、Os04g0574500含有3個外顯子；Os06g0116200、Os12g0484900、Os03g0674700含有4個外顯子； 0s04g0600900，0s02g0701300 含有5個外顯子。進一步分析其編碼蛋白的保守基序（圖4）發現，水稻GRF蛋白具有一定的保守性，12個蛋白均存在motif1和motif2，分別對應WRC和QLQ結構域；motif6存在于除 0s02g0678800 0s07g0467500，0s04g0574500 外的其余成員中，且多數按照motif2、motif1、motif6的順序排列，推測該結構原本可能存在于所有水稻GRF成員中，部分成員在進化過程中遺失了該結構。

圖3水稻GRF蛋白的三級結構預測

注：圖中蛋白質三級結構按照氨基端-羧基端進行著色。

te：Theprotein tertiary structureinthefigure iscoloredintheorderofamino terminus tocarboxylterminu

Fig.3Tertiarystructureprediction ofGRF proteinsin rice

圖4水稻GRF基因編碼蛋白的保守基序分析和基因結構分析

Fig.4Analysis of conserved motif and gene structure of GRF genes and coden proteins in rice

2.5水稻 GRF 基因的順式作用元件分析

由圖5可知，水稻GRF基因啟動子區存在多種順式作用元件，大多與激素響應、脅迫響應、生長發育和光響應有關。激素響應元件最多，包括脫落酸反應元件（ABRE）茉莉酸甲酯反應元件（CGTCA-motif、TGACG-motif）、生長素響應元件（AUxRRcore、TGA-element）、赤霉素響應元件（GARE-motif、P-box、TATC-box）和水楊酸反應元件（TCA-element），其中茉莉酸甲酯反應元件存在于所有成員中且數量較多，推測水稻GRF基因與茉莉酸甲酯激素調控密切相關。脅迫響應元件包括厭氧、低溫、干旱、熱等，其中只有 0s02g0776900 同時含有低溫和干旱響應元件，此外大部分水稻GRF基因都含有厭氧和熱響應元件。生長發育元件主要包含分生組織反應元件（as-1），還有少量的晝夜節律（circadian）、種子發育調控（RY-element）等元件。光響應元件在水稻GRF基因中廣泛存在，G-box和Box-4是主要的反應元件，每個成員至少含有1種光反應元件。

2.6水稻GRF蛋白系統進化樹的構建

擬南芥、番茄、玉米、粘稻和粳稻GRF蛋白的系統發育樹結果（圖6顯示，62個GRF蛋白可劃分為3大類，類群1中含有22個成員；類群2中含有13個成員，類群3中含有27個成員，其中粳稻GRF蛋白與燦稻和玉米的親緣關系較近。

2.7水稻 GRF 基因的染色體定位和共線性分析

由圖7可知，12個GRF基因分布在水稻7條染色體上，每條染色體上的基因數目也不相同，多數基因分布在染色體兩端。其中 0s02g0776900 、0s12g0484900 位于12號染色體； 0s07g0467500 位于7號染色體； 0s11g0551900 位于11號染色體。

種內共線性分析（圖8）表明，水稻GRF基因不存在串聯重復事件區，但包含 0s02g0701300/ Os04g0600900、Os02g0678800/Os04g0574500、Os02g0776900/Os06g0204800大片段復制。

圖6不同物種GRF蛋白的系統進化樹Fig.6Phylogenetic tree of GRF proteins from different species

注：Os—粳稻;GRMZM—玉米；AT—擬南芥;Solyc—番茄;BG—稻。

Note：Os-Oryzasatiasubsp.japonica;GRMZM—Zeamays；AtArabidopsis thaliana;Solyc—olanumlycopersicum；BG—Oryatia subsp.indica.

圖7水稻GRF基因在染色體上的分布

Fig.7 Chromosomal distribution of GRF genes inrice

注：右側藍色到紅色刻度表示 Note：Theblue tored scaleon the right indicates the number of geneswithin O.1 Mb.

圖8水稻GRF基因的共線性分析

Fig.8Collinearity analysis of GRF genes in rice

3討論

目前在諸多植物中已鑒定出GRF基因家族成員，擬南芥中有9個，油菜中有34個[24]，高粱中有10個[25]，谷子中有10個[2]，毛竹中有13個[27]，大麥中有12個[28]。本研究共鑒定出12個水稻GRF基因。對水稻GRF蛋白理化性質分析顯示，Os02g0678800、Os04g0574500、Os07g0467500的蛋白序氨基酸數目均小于300，等電點、平均親水系數、不穩定系數等在不同成員之間存在差異。進一步對水稻GRF蛋白的二級結構和三級結構預測表明， 0s02g0678800 的結構與其他成員差異較大，由于蛋白結構與功能密切相關，因此推測該蛋白可能擁有特殊功能。

染色體定位顯示，12個GRF基因不均勻地分布于水稻7條染色體上，且主要分布在染色體的兩端。水稻GRF基因含有2～5個外顯子，多數有3個外顯子，其中 0s11g0551900 只含有2個外顯子。所有水稻GRF蛋白都含有motif1和motif2，有9個GRF蛋白同時含有motif ^1， motif2和motif6，總體呈現出較強的保守性。系統發育分析對研究物種進化關系的研究具有重要意義[29]，本研究構建了粳稻、擬南芥、玉米、番茄和粘稻5個物種間GRF蛋白的系統進化樹，結果表明，粳稻和粘稻間的親緣關系較近，且與玉米同源性較高。

對水稻GRF基因啟動子的順式作用元件進行預測顯示，包含激素誘導、低溫、干旱、熱、分生組織生長、晝夜節律調控等響應元件。其中與激素響應相關的元件數量最多，尤以脫落酸和茉莉酸甲酯響應元件最多，它們對植物非生物脅迫和抗病有著重要作用[30-31]。物種內共線性結果顯示，水稻GRF基因家族中有3對基因存在共線性，表明水稻GRF基因家族存在基因復制現象，推測其通過基因復制來擴張。綜上所述，本研究利用生物信息學方法對水稻GRF基因進行鑒定和初步分析，為進一步探究其基因功能以及非生物脅迫分子機制提供了理論參考。

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