TRV介導的上海青和芥菜VIGS體系的構建

doi：10.13304/j.nykjdb.2025.0124

中圖分類號：S63 文獻標志碼：A 文章編號：1008-0864（2025）08-0239-11

Constructionof TRV-mediated VIGS System in Brassica rapa subsp. chinensis and Brassica juncea

MA Yanqin ^1，2 ，ZHOU Yujie12，LONGHaicheng1，2，LI Ju1，2，WANG Haie ^1，2 ， CHANG Wei3， LI Zhi ^1，2 ， ZHONG Jian1，2， MIAO Mingjun ^1，2_. ， YANG Liang1，2*

1.VegetableGermplasmInnovationandVarietyImprovementKeyLaboratoryofSichuanProvince，KeyLaboratoryofHorticultural CropsBiologyandGermplasmEnhancementinSouthwestRegionsofMinistryofAgricultureandRuralAairs，Horticulture Research Institute，Sichuan Academyof AgriculturalSciences，Chengdu 61oo66，China;2.Sichuan Province Enginering TechnologyResearchCenterofVegetables，SichuanPengzhou611934，China; 3.Sichuan Institute of Edible Fungi，Chengdu 61Oo66，China）

Abstract：To establishan eficientvirus-induced gene silencing（VIGS）system in important Brasicaceae vegetables，Brassca rapa subsp.chinensisand Brassica juncea were chosenas the material and theendogenous phytoene desaturase （ PDS ）gene was selected as the marker gene.The pTRV2-BrPDS，pTRV2-BjuPDS- and pTRV2-BjuPDS- c vectors were constructed，and the infection efciency of Agrobacterium was optimized to construst VIGS system with high efficient.The results showed that the pTRV2-BrPDS，pTRV2-BjuPDS- _g and pTRV2-BjuPDS（204號 c vectorswere successfully constructed.The albinism phenotypeof B.rapa subsp.chinensis plants was the most obviouswith OD 600 =1.0 of Agrobacterium，while the silencing efficiency ofB.juncea wasoptimal with OD 600 =0.8of Agrobacterium.TheqRT-PCRanalysisconfirmedthattheobserved albinismphenotype wasresulted fromthesilencing of theendogenousPDSgene inplant infectedwith the TRV-basedrecombinant virus.Aboveresultsprovided theoretical basis for studing the gene functions of B.rapa subsp.chinensis and B. juncea using VIGS technology. Keywords： Brassica rapa subsp. Chinensis； Brassica juncea；VIGS；PDS gene;albinism phenotype

病毒誘導的基因沉默技術（virus-inducedgenesilencing，VIGS）是一種高效驗證植物基因功能的手段。通過VIGS可以實現對特定mRNA的選擇性結合與降解，從而導致靶基因的表達水平降低，進一步通過對沉默植株進行表型分析和生理生化分析，能夠明確靶基因在植株生長發育過程的調控作用。VIGS能夠在不同組織和器官中引發靶基因的沉默，展現出與突變體類似的表型特征。該方法無需對植物進行穩定的遺傳轉化，且不改變基因組DNA序列，被認為是一種高效解析基因功能的方法2]。

八氫番茄紅素脫氫酶（phytoenedesaturase，PDS）是類胡蘿下素合成的關鍵酶，其表達抑制會阻斷類胡蘿卜素合成，導致葉片白化，即光漂白現象[3。由于白化表型易于觀察且特異性強，PDS基因常作為VIGS體系中的報告基因，用于驗證基因沉默效果[4]。基于煙草脆裂病毒（tobaccorattlevirus，TRV）開發的VIGS系統，已在多種植物中得到應用，包括本氏煙草、番茄、樓斗菜、棉花[8-9]、月季[]、罌粟和菘藍[]等。此外，TRV-VIGS系統還成功應用于森林樹木的基因功能研究，如胡楊[13]、橡膠樹[14]、橄欖樹[15]和大棗[16]等。

上海青（Brassica rapa subsp.chinensis）和芥菜（Brassicajuncea）均隸屬于十字花科蕓臺屬，是我國常見的葉菜類蔬菜，富含多種營養成分，如抗壞血酸、硫代葡萄糖苷、蘿卜硫素等，具有利肺豁痰、消腫散結等功效，深受人們喜愛。盡管 Yu 等[17]利用蘿卜黃花葉病毒（turnipyellow mosaicvirus，TYMV成功誘導了上海青內源PDS基因的表達水平降低，并觀察到植株呈現白化表型，但目前基于TRV構建的VIGS系統在上海青和芥菜中的研究仍較為有限。因此，本研究基于TRV欲構建適用于上海青及2種芥菜栽培種的VIGS系統，通過TRV-VIGS系統對其內源PDS基因進行沉默，并進一步對農桿菌侵染水平進行優化，以實現高效基因沉默，為進一步解析上海青和芥菜的基因功能奠定基礎，也為其他十字花科蔬菜遺傳轉化體系的構建及基因功能解析提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

以十字花科植物上海青和芥菜栽培種抱子芥（Brassica juncea var.gemmifera Leeamp;Lin）及結球芥（Brassica juncea var.capitata Hort）為試驗材料;載體為pTRV1和pTRV2（圖1），購自美國擬南芥生物資源保藏中心（ArabidopsisBiologicalResourceCenter）；菌株為大腸桿菌（Escherichiacoli）DH5α和根癌農桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）GV3101，均為本實驗室保存菌株；植物總RNA提取試劑盒（RNAprep PurePlantKit）購自天根生化科技（北京）有限公司，PrimeScriptII1stStrandcDNASynthesisKit購自Takara生物公司，NcoI和SacI購自Fermentas公司。

注：Replicase—依賴于RNA的RNA聚合酶； 16KD-16kD 富半胱氨酸蛋白;MP—移動蛋白;CP—外殼蛋白;LB和RB—T-DNA左、右邊界；Rz—自剪切核酸酶；MCS—多克隆位點。

Note：Replicase—RNA-dependentRNApolymerase；16KD—16kDcysteine-rchprotein;MP—Moveprotein；CP—Coatprotein;LBandRB ——left and rightborder of T-DNA;Rz—Ribozyme；MCS—Multiple clone site.

圖1基于TRV的VIGS載體結構

Fig.1Structure of TRV-basedVIGSvector

1.2 試驗方法

1.2.1BrPDS編碼序列的擴增利用RNAprepPurePlantKit提取上海青和2種芥菜葉片的總RNA；根 據 PrimeScriptI 1st Strand cDNASynthesisKit方法，反轉錄生成cDNA第1鏈，以其作為模板，以BrPDS-F和BrPDS-R、BjuPDS- ?g -F和BjuPDS-g-R、BjuPDS-c-F和BjuPDS-c-R為上下游引物進行PCR，擴增BrPDS、BjuPDS- ?g 和BjuPDS- ?c 編碼序列，PCR程序為： 94^°C10min;94^°C15s 55^°C15s，72^°C15s，35 個循環； 72'C10min 。試驗所用引物見表1。

表1載體構建引物

Table1 Primers forvector construction

1.2.2pTRV2-BrPDS載體的構建分別以上海青、抱子芥和結球芥cDNA作為模板，以BrPDS-F1和BrPDS-R1、BjuPDS- ?g -F1和BjuPDS ?g -R1、BjuPDS ?c -F1和BjuPDS-c-R1為引物（表1），擴增帶有同源臂的BrPDSBjuPDS- ?g 和BjuPDS-c片段，電泳后回收目的條帶；然后用EcoRI和BamHI對pTRV2載體進行雙酶切，純化酶切產物；將BrPDS、BjuPDS ?g 和BjuPDS-c片段通過GibsonAssembly技術分別連接至pTRV2載體；將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞后，進行菌落PCR，將陽性克隆進行Sanger測序；對序列進行分析，將構建成功的重組質粒通過凍融法轉化至根癌農桿菌GV3101感受態細胞，進行菌落PCR，將陽性菌株于 -80°C 保存。

1.2.3VIGS體系構建 ① 將保存于 -80^°C 包含有pTRV1、pTRV2、pTRV2-BrPDS、pTRV2-BjuPDS- ?g 和pTRV2-BjuPDS-c質粒載體的GV3101菌株分別劃線于含有 0.05mg?mL^-1 卡那霉素（kanamycin，Kan） .0.05mg^?mL^-1 慶大霉素（gentamicin，Gent）和0.05mg?mL^-1 利福平（rifampicin，Rif）的抗性LB（Luria-Bertani）固體選擇培養基（ 10g?L^-1 胰蛋白陳， 5g?L^-1 酵母提取物， 10g?L^-1 氯化鈉和 15g?L^-1 瓊脂粉）上，在 30°C 暗培養 24h ② 挑取單克隆，分別接種至LB液體選擇培養基（ 10g?L^-1 胰蛋白陳， 5g?L^-1 酵母提取物和 10g?L^-1 氯化鈉），在30°C.200r?min^-1 振蕩培養至 0D₆₀₀=0.8 ③ 分別吸取上述菌液 2mL ，添加至 300mL LB液體選擇培養基中，振蕩培養至 0D₆₀₀=2.0 ④ 收集菌體，無菌水洗滌菌體； ⑤ 利用滲透液 （10mmol?L^-12 -嗎啉乙磺酸， 20μmol?L^-1 乙酰丁香酮和 10mmol?L^-1 NaCI）重懸菌體，至 0D₆₀₀=2.0 ，室溫培養 ^4h ，用滲透液稀釋重懸液至 0D₆₀₀ 值分別為 0.3、0.5、0.8 和1.0; ⑥ 試驗分為3組，每組包含20株植株。對于上海青試驗組，選用pTRV1和pTRV2-BrPDS農桿菌細胞混合液（pTRV2-BrPDS），以使用pTRV1和pTRV2農桿菌細胞混合液的為對照組（CK），同時注射上海青并觀察表型;針對抱子芥和結球芥試驗組，分別選用pTRV1、pTRV2-BjuPDS- ?g 以及pTRV1、pTRV2-BjuPDS-c農桿菌細胞混合液（pTRV2-BjuPDS- ?g 和pTRV2-BjuPDS-c），對照組（CK）依舊使用pTRV1和pTRV2農桿菌細胞混合液，分別注射抱子芥和結球芥并觀察表型； ⑦ 每株植物選擇3片葉子進行注射，并在光照充足、溫度（25±2） ℃培養； ⑧ 待試驗組植株有表型變化時，分別提取試驗組和對照組總RNA，利用隨機引物反轉錄生成cDNA，基于特異性引物（表1）檢測TRV1RNA、TRV2RNA以及內源PDS基因表達水平。

2 結果與分析

2.1克隆PDS基因

基于上海青內源BrPDS基因（BraA04g008530.3.1C）序列設計特異性引物，獲得 BrPDS 基因開放閱讀框序列（openreadingframe，ORF），長為1692bp ，編碼蛋白長度為 563aa 。同樣得到抱子芥BjuPDS ?g 基因ORF長度為 1698bp ，編碼蛋白長度為 565aa ;結球芥BjuPDS-c基因ORF長度為1692bp ，編碼蛋白長度為 563aa 。氨基酸序列比對分析（圖2）發現，上海青、抱子芥和結球芥的PDS蛋白與擬南芥AtPDS蛋白氨基酸序列的一致性分別為 93.95%，92.06% 和 92.95% 。

2.2 TRV介導的VIGS體系的構建

基于BrPDS、BjuPDS- ?g 和BjuPDS-c基因核苷酸序列，分別以上海青、抱子芥和結球芥cDNA為模板，擴增BrPDS、BjuPDS-g和BjuPDS-c片段（圖3A），連接至pTRV2線性載體，構建pTRV2-BrPDS、pTRV2-BjuPDS- ?g 和pTRV2-BjuPDS-c載體，連接產物轉化大腸桿菌 DH5α 菌株，獲得陽性克?。▓D3B），并進行Sanger測序，結果顯示，成功構建pTRV2-BrPDS、pTRV2-BjuPDS ?g 和pTRV2-BjuPDS-c重組載體。提取pTRV2-BrPDSpTRV2-BjuPDS- ?g 和pTRV2-BjuPDS-c質粒DNA轉化根癌農桿菌GV3101感受態細胞，經菌液PCR檢測得到了可以用于植物遺傳轉化試驗的陽性菌株（圖3C）。

2.3不同農桿菌水平對VIGS沉默效率的影響

將構建成功的沉默載體分別注射上海青、抱子芥和結球芥并觀察表型發現，注射16d后，試驗組植株開始呈現白化表型。由圖4可知，不同水平農桿菌對上海青、抱子芥和結球芥的VIGS效率具有顯著影響：當農桿菌菌液 OD₆₀₀= 1.0時，上海青植株的白化比例最高，為 66.7% 當農桿菌菌液 0D₆₀₀=0.5 時，抱子芥植株的白化比例最高，為 42.2% ；當農桿菌菌液 0D₆₀₀=0.8 時，結球芥植株的白化比例最高，為 51.1% 。

2.4BrPDS沉默導致上海青葉片呈白化表型

基于VIGS對上海青內源 BrPDS 基因進行靶向沉默，導致植株呈現白化表型（圖5）。值得注意的是，這些白化植株的白化程度存在差異。與對照組相比，當農桿菌 0D₆₀₀=0.3 時，其葉片下表皮出現白化表型，而上表皮并未呈現明顯的白化表型（圖5A）；當農桿菌 0D₆₀₀=0.5 和 0D₆₀₀=0.8 時，葉片上表皮呈現輕微白化，葉片下表皮則完全白化（圖5B和C）；當農桿菌 0D₆₀₀=1.0 時，葉片上、下表皮均表現出明顯的白化表型（圖5D）。此外，經pTRV2-BrPDS不同水平處理的上海青植株的葉柄均呈現白化現象（圖5）。

圖2不同PDS蛋白氨基酸序列比對

Fig.2Amino acid sequence alignment of different PDS proteins

圖3VIGS載體的構建

Fig.3Construction of VIGS vectors

A：內源PDS基因擴增片段，-表示陰性對照，1～3分別為BrPDS、BjuPDS-g和BjuPDS-c基因片段;B：重組載體轉化大腸桿菌DH5α菌落PCR檢測，1～3為pTRV2-BrPDSDH5α菌落PCR檢測，4～6為pTRV2-BjuPDS ?g DH5α菌落PCR檢測，7～9為pTRV2-BjuPDS-cDH5α菌落PCR 檢測;C：重組載體轉化根癌農桿菌GV3101菌株菌落PCR檢測，1～2為pTRV2-BrPDS GV3101菌落PCR 檢測，3～4為pTRV2-BjuPDS ?g 大GV3101菌落PCR 檢測，5～6為pTRV2-BjuPDS-c GV3101菌落PCR 檢測。M—DL2000 DNA Marker。

A：AmplificationfragmentsofEndogenousPDSgene，-indicates negativecontrol；1～3are BrPDS，BjuPDS-gand BjuPDS ?c gene fragments， respectively；B：PCRdetectioofecombinantvector-transfodEsherichiacoliDH5aolonies，～3arepV-BrD5acolosCR detection，respectively；4～6arepTRV2-BjuPDS ?g DH5αcolonies PCR detection，respectively；7～9 are pTRV2-BjuPDS-c DH5acolonies PCR detection，respectively；C：PCRdetectionofecombinantvector-transfoedAgobacteriumtumefaciensGV30lstraincoloes，e pTRV2-BrPDS GV3101 colonies PCR detection，respectively；3～4 are pTRV2-BjuPDS ?g GV3101 colonies PCR detection，respectively；5～6 are pTRV2-BjuPDS ?c GV3101 colonies PCR detection.M—DL2000 DNA Marker

2.5芥菜內源PDS沉默導致其植株呈白化表型利用pTRV2-BjuPDS- ?g 和pTRV2-BjuPDS-c分別對抱子芥和結球芥葉片進行不同水平農桿菌處理，觀察到不同程度的白化表型（圖6～8）。對于抱子芥，當農桿菌 0D₆₀₀=0.3 時，抱子芥注射葉片呈現較低的白化表型，而未注射葉片、新生葉片和莖無白化現象；當農桿菌 0D₆₀₀=0.5 和 0D₆₀₀=0.8 時，抱子芥注射葉片、未注射葉片、新生葉片和莖部均呈現明顯的白化表型；而當農桿菌 0D₆₀₀=1.0 時，注射葉片呈萎蔫狀態，未注射葉片、新生葉片僅表現為較弱的白化表型（圖6A～D）。對于結球芥，當農桿菌 0D₆₀₀=0.8 時，白化表型最明顯，而未注射葉片和新生葉片并沒有明顯的白化表型（圖6E～H）。隨著抱子芥和結球芥繼續生長，與對照組相比，試驗組植株的花序、花萼和花瓣均出現白化表型（圖7～8）。

注：不同小寫字母表示不同處理間在 Plt;0.05 水平差異顯著。

Note：Different lowercaseletters indicate significantdifferencesbetween different treatmentsat Plt;0.05 level.

圖4不同農桿菌水平下植株的白化率

Fig.4Albinism rate of plant under different Agrobacterium levels

沉默植株的白化表型

Fig.5Albinism phenotype of Chinese cabbage plant with silenced BrPDS

2.6白化植株內源PDS基因表達量分析

為了驗證觀察到的白化表型是否由TRV重組病毒侵染導致的植株內源性PDS基因沉默，基于半定量RT-PCR分析所有處理植株中TRV1和TRV2RNA的表達水平，結果（圖9）顯示，在試驗組和對照組的注射葉片中，TRV1和TRV2RNA均可被檢測到。進一步通過定量qRT-PCR對所有材料內源PDS表達水平進行分析，結果（圖10）表示，與對照組相比，BrPDS、BjuPDS-g和 BrPDS_-C"基因在試驗組注射葉片和未注射葉片中的表達水平均顯著降低。綜上表明，通過TRV介導的VIGS技術可以有效抑制上海青和芥菜內源PDS基因表達量，進而導致上海青和芥菜植株產生白化表型，即由TRV介導的VIGS技術可用于快速驗證上海青和芥菜基因的功能。

圖6芥菜 PDS 基因下調導致植株葉片白化現象

Fig.6Leaf albinism of B juncea plant with downregulation ofPDS

圖7芥菜內源PDS基因下調導致植株花序白化現象

Fig.7Inflorescence albinism of B_? juncea plant with downregulation of PDS

圖8芥菜內源 PDS 基因下調導致植株花冠白化現象

A：抱子芥;B：結球芥。標尺=1mm A：B. juncea var. gemmifera；B：B. juncea var.capitata.Scale bar τ=1mm

Fig.8Corolla albinism of B. juncea plant with downregulation of PDS

圖9葉片中TRVRNA的表達分析Fig.9 Analysis of TRVRNA expressioninleaf

A：上海青；B：抱子芥;C：結球芥。TRVI為葉片中TRVI的表達量檢測，TRV2為葉片中TRV2的表達量檢測 A：B.rapasubsp.Chinensis；B：B.junceavaremmifera；C：B.junceavar.capitata.TVisthedetectionofTVexpressoninleaves， TRV2 is the detection of TRV1 expression in leaves

A～B：上海青；C～D：抱子芥;E～F：結球芥 A～B：B.rapa subsp.Chinensis；C～D：B.juncea var.gemmifera;E～F：B.juncea var.capitata

圖10內源PDS基因的相對表達量

Fig.10Relative expression of endogenous PDS gene

3討論

隨著馬鈴薯X病毒（potatovirusX，PVX）、煙草花葉病毒（tobaccomosaic virus，TMV）和TRV等病毒基因組RNA的序列測定，VIGS技術在植物基因功能研究中的應用日漸廣泛，為遺傳轉化困難和生長周期較長的植物提供了一種簡便、快速的基因功能分析方法。TRV介導的VIGS技術在植物中具有廣泛的適用性。TRV-VIGS可以有效降低藥用植物菘藍（Isatisindigotica）MADS-box基因，導致菘藍開花時間延遲，花器官發育異常[13]。通過TRV-VIGS技術，Wang等]沉默了萵苣（Lactucasativa）LsSTPK基因，導致萵苣的抽臺過程改變并改變了類胡蘿卜素代謝產物的積累水平。Li等[19]將VIGS系統成功應用于沉默茶樹[Camelliasinensis（L.）O.Kuntze]咖啡因合成基因CsTCS1，顯著降低了茶樹的咖啡因含量。上海青和芥菜遺傳轉化體系構建困難，難以獲得轉基因植株，導致通過常規的轉基因技術研究上海青和芥菜基因功能的進展緩慢，本研究基于TRV構建VIGS系統，為十字花科重要蔬菜上海青和芥菜功能基因的分析研究提供技術支持，進而加快上海青和芥菜功能基因研究的速度。

PDS基因是類胡蘿素合成途徑的限速酶基因，主要在植物葉片、花器官和果實中表達。當PDS基因發生突變時，會導致植物呈現白化表型[20-21]。鑒于此，以植物PDS基因作為靶基因，通過VIGS系統進行沉默，使VIGS系統在植物中的作用具有可視化效果，為后續試驗樣本的表型觀察和數據分析帶來極大便利。在水稻和小麥中，VIGS可以誘導PDS基因發生沉默，使葉片呈現出白化型[22-23]。大豆 GmPDS 基因沉默后，不僅葉片出現了完全白化的表型，而且可傳遞至種子[24]。當對番茄果實中的PDS基因進行沉默處理后，會導致番茄果實呈現黃色表型[25]。本研究基于PDS基因序列的保守性，分別從上海青和芥菜中克隆獲得了PDS基因，并構建沉默表達載體，將構建好的載體注射至上海青和芥菜葉片16d后，上海青和芥菜均表現出明顯的白化表型；通過qRT-PCR分析進一步證實，這種白化表型與PDS基因表達水平的顯著降低密切相關。這一結果與在煙草和番茄中的研究一致，驗證了VIGS系統的可靠性。此外， PDS 基因的沉默表型還可作為后續試驗中評估VIGS效率的直觀指標。

農桿菌的處理水平是影響VIGS效率的關鍵因素之一。本研究發現，上海青和芥菜對農桿菌侵染的敏感度存在明顯差異，上海青在農桿菌0D₆₀₀=1.0 時表現出最佳的基因沉默效果，而芥菜在 0D₆₀₀=0.8 時白化表型最明顯。這表明不同植物對農桿菌侵染的最適水平可能不同2。此外，農桿菌侵染效率還可能受到植物生長狀態、環境條件以及病毒載體類型的影響2。因此，針對不同植物種類，優化農桿菌處理水平和侵染條件是實現高效VIGS的關鍵。為緩解病毒侵染對植物的傷害，月季等植物在注射TRV重組載體后，還需進行暗培養。在本研究中，選取6葉期的上海青和芥菜幼苗進行葉片注射，無需進行遮光處理，即可實現較好的沉默效果。

VIGS技術以其操作流程簡便、研究周期較短和成本較低等優勢，成為高通量基因功能解析的理想工具28。然而，該技術也存在一些局限性。例如，沉默效果會因植物種類差異、所選基因片段的長度以及病毒載體的不同而有所差異27。此外，由VIGS誘導的基因沉默是在mRNA水平實現的，這一特點使其在植物體內的基因敲除效果缺乏繼代性[29。因此，在使用VIGS技術進行基因功能研究時，有必要結合其他遺傳學方法，如CRISPR/Cas9基因編輯技術[30，從而進一步驗證試驗結果。

TRV-VIGS在十字花科植物中的應用主要集中于模式植物擬南芥[4和白菜[5]，而上海青和芥菜因遺傳轉化困難缺乏高效基因沉默工具。本研究首次基于TRV成功構建了pTRV2-BrPDS、pTRV2-BjuPDS-g和pTRV2-BrPDS-c沉默表達載體，并利用農桿菌滲入法將沉默表達載體導入上海青和芥菜葉片，通過VIGS技術實現了對其內源PDS基因的沉默，導致上海青和芥菜植株呈現不同程度的白化表型，并通過半定量RT-PCR和定量qRT-PCR進行了驗證。相較于 Y_u 等[使用的蘿卜黃花葉病毒（turnipyellow mosaicvirus，TYMV）載體，本研究采用的TRV載體具有更廣的宿主適應性和更高的沉默穩定性，建立的TRV病毒誘導的上海青和芥菜基因沉默體系，為研究十字花科類重要蔬菜上海青和芥菜基因功能提供了一種快速有效的方法。

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