板栗R2R3-MYB基因家族的鑒定及表達(dá)分析

doi：10.13304/j.nykjdb.2024.0477

中圖分類號(hào)：S664.2，Q344+.13 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-0864（2025）08-0047-13

Identification and Expression Analysisof R2R3-MYB Gene Family in Chinese Chestnut

LIU Yaming§，YANG Yong§，KANG Xiaoxiao，WANG Meng，WANG Dongsheng， ZHANG Haie*

（Hebei ProvinceChestnutIndustryCollborative InovationCenter，Engineering Research CenterofChineseChestnutIndustry TechnologyofMinistryofEducation，Colegeof HorticulturalScienceand Technology，HebeiNormal Universityof Science and Technology，Hebei Qinhuangdao O66Oo4，China）

Abstract：R2R3-MYB transcription factorsare the largest MYB subfamily inplantsandare widelyinvolved inregulating plant growth and development and stress response.R2R3-MYB gene family of Chinese chestnut was genome-widely identified，andthe chromosomedistributionof these genes，subcelular localization prediction，phylogeneticrelationships， proteinmotif，gene structureandsequencealignmentofconserved domains wereanalyzed.Finally，the expresionof the CmR2R3-MYB gene familyunder drought stresswas analyzed by transcriptomeand RT-qPCR.The results showed thattotal 141 CmR2R3-MYB genes were unequall distributed on12chromosomes and1 contig fragment.And the phylogenetic tree divided theminto6groups.There were7CmR2R3-MYB genes diferentiallyexpressedunderdroughtstress.Among them， CmMYB89 was upregulated，while CmMYB32，CmMYB95，CmMYB91，CmMYB119，CmMYB131andCmMYB104 were downregulated，which indicatedthatthese7genescouldbe involvedindroughtresistanceofChinesechestnut.Aboveresults provided theoretical foundationsfor furtherexploring theroleoftheR2R3-MYBgenefamilyinresponse todroughtstresof Chinese chestnut.

Keywords：Chinese chestnut；drought；R2R3-MYB gene family

轉(zhuǎn)錄因子是一類能夠與啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)分子，具有調(diào)節(jié)mRNA表達(dá)的功能，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[2-3]。MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中家族成員最多的轉(zhuǎn)錄因子，因其結(jié)構(gòu)包含不同數(shù)量長(zhǎng)度為52個(gè)氨基酸殘基組成的R保守結(jié)構(gòu)域，又被分為4種類型：1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB4]。其中數(shù)量最多的是R2R3-MYB蛋白，已在多種植物中被鑒定，藜麥中共鑒定出103個(gè)5，梨樹(shù)中共鑒定出122個(gè)，核桃中共鑒定出136個(gè)，木麻黃中共鑒定出107個(gè)[8。R2R3-MYB基因廣泛參與植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)，水稻RRS1被敲除后，可促進(jìn)水稻根發(fā)育，提高水稻抗旱性；谷子SiMYB56基因過(guò)表達(dá)可促進(jìn)木質(zhì)素的生物合成及ABA信號(hào)通路基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)植株抗旱性[；楊樹(shù)PtrMYB94基因過(guò)表達(dá)可提高植株的ABA含量，從而增強(qiáng)抗旱性[1]。

板栗（Castaneamollissima）屬于殼斗科（Fagaceae）栗屬（Castanea），是我國(guó)重要的木本糧食之一，其果實(shí)富含淀粉和糖，深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者喜愛(ài)。近年隨著經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展，板栗的產(chǎn)量已無(wú)法滿足國(guó)內(nèi)與國(guó)際市場(chǎng)需求，高產(chǎn)成為當(dāng)前板栗生產(chǎn)的主要任務(wù)。我國(guó)板栗主要生長(zhǎng)在山坡地帶，由于山區(qū)土壤水分貧瘠，所以常常面臨干旱脅迫[12]。板栗基因組序列被公布以來(lái)，大量轉(zhuǎn)錄因子家族被鑒定[13-14]，但板栗R2R3-MYB基因家族尚未被鑒定。因此，本研究基于板栗基因組數(shù)據(jù)，對(duì) CmR2R3–MYB 基因家族成員進(jìn)行鑒定，分析其在染色體上分布、亞細(xì)胞定位、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、蛋白基序、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域等，最后通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和RT-qPCR分析CmR2R3-MYB基因家族在干旱脅迫下的表達(dá)，為進(jìn)一步探究R2R3-MYB基因家族在板栗干旱脅迫響應(yīng)中的作用奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料與處理

以板栗‘燕寶'實(shí)生苗為試驗(yàn)材料，在營(yíng)養(yǎng)土中盆栽，每隔7d澆水（正常澆水）管理4個(gè)月后停止?jié)菜M(jìn)行干旱脅迫處理（D），以正常澆水為對(duì)照（CK）。處理60d，至干旱處理組葉片明顯失綠時(shí)，對(duì)其進(jìn)行葉片采樣，同時(shí)采樣對(duì)照組葉片，用液氮冷凍，送樣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

使用RNA提取試劑盒提取RNA（SEON，張家口）；然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（SEON，張家口）將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，引物如表1所示。qRT-PCR試劑盒為TBGreenPremix Ex Taq （TaKaRa，大連）。以Actin作為內(nèi)源參照基因，使用 2^-ΔΔG 法[15]計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1試驗(yàn)所用引物序列

Table1 Primer sequencesused in the study

1.2CmR2R3-MYB基因家族成員的鑒定

從國(guó)家生物信息中心（https：//ngdc.cncb.ac.cn/gwh）下載板栗基因組文件與注釋文件，從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam.xfam.org/）下載R2R3-MYB蛋白保守結(jié)構(gòu)域文件（PF00249）。利用TBtools軟件[16]在SimpleHMMSearch界面下搜索含有2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的所有蛋白序列，取其交集，按照搜索結(jié)果手動(dòng)去除結(jié)構(gòu)域不完整的蛋白序列，上傳至NCBI-CDD 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和SMART數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//smart.embl-heidelberg.de/），進(jìn)一步確認(rèn)是否包含保守結(jié)構(gòu)域，最終保留下來(lái)的即為CmR2R3-MYB基因。

1.3 CmR2R3-MYB基因染色體定位

使用TBtools軟件從板栗基因組注釋文件中提取CmR2R3-MYB基因的染色體位置信息，按照位置排序?qū)ζ溥M(jìn)行命名，最終繪制CmR2R3-MYB基因在染色體上的分布圖[]。使用BUSCA在線網(wǎng)站（https：//busca.biocomp.unibo.it/）預(yù)測(cè) CmR2R3-MYB蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.4CmR2R3-MYB基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用MEGA7對(duì)141條CmR2R3-MYB蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)；然后利用TBtools軟件的TrimAL對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)后修剪，去除高度不一致的部分;接著利用IQ-TREE軟件中最大似然法構(gòu)建基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[16-17]；最后利用ChiPlot在線網(wǎng)站（https：//www.chiplot.online）對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行美化。

1.5CmR2R3-MYB基因家族保守基序與基因結(jié)構(gòu)分析以及保守結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)

利用MEME在線網(wǎng)站（https：//meme-suite.org/）對(duì)CmR2R3-MYB基因的保守序列進(jìn)行分析，獲得保守基序。利用TBtools軟件對(duì)保守基序進(jìn)行展示，同時(shí)根據(jù)板栗基因組注釋文件對(duì)基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行展示。將保守基序上傳至InterProScan在線網(wǎng)站（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/about/interproscan/）并對(duì)其進(jìn)行注釋。利用MEGA7對(duì)141條CmR2R3-MYB蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，獲得保守的R2及R3結(jié)構(gòu)域序列；再利用WEBLOGO在線網(wǎng)站（https：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）對(duì)R2及R3結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行可視化。

1.6板栗CmR2R3-MYB基因家族以及與其他物種間共線性分析

在Ensembl Plants數(shù) 據(jù)庫(kù)（https：//plants.ensembl.org/下載擬南芥和水稻基因組序列與注釋文件；在Plant GenomePortal數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//plantgarden.jp/en/index）下載日本栗基因組序列與注釋文件；在Phytozomel3數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//phytozome-next. jgi.doe.gov/info/cdentata_v1_1.）下載美洲栗基因組序列與注釋文件。利用MCScanX軟件對(duì)板栗與擬南芥、水稻、美洲栗、日本栗的基因組進(jìn)行共線性分析[18]，并采用TBtools軟件、OmicsSuite軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化[18-19]。進(jìn)一步通過(guò)DupGenfinder分析 CmR2R3–MYB 基因的復(fù)制類型[20]。通過(guò)TBtools軟件計(jì)算不同復(fù)制類型的基因?qū)Φ姆峭x替換率同義替換率（nonsynonymous substitution rate/synonymoussubstitution rate， K_a/K_s ）[16]。

1.7 CmR2R3-MYB基因家族啟動(dòng)子上順式作用元件分析

通過(guò)PlantCARE在線網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/）對(duì)CmR2R3-MYB基因 2000bp 啟動(dòng)子序列順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.8CmR2R3-MYB基因家族密碼子偏好性分析

利用軟件 CodonW1.4.2 與EMBOSS軟件計(jì)算CmR2R3-MYB基因的同義密碼子相對(duì)使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）、有效密碼子數(shù)（effectivenumberofcodon，ENC）、密碼子第1、2、3位堿基的GC含量（GC1、GC2、GC3）、同義密碼子第3位堿基GC含量（GC3s）。根據(jù)CmR2R3-MYB基因編碼各氨基酸密碼子的RSCU值繪制熱圖，當(dāng)RSCUgt;1時(shí)，代表密碼子使用頻率相對(duì)較高；當(dāng)RSCUlt;1時(shí)，代表密碼子使用頻率相對(duì)較低[2]。

中性繪圖是以密碼子GC1和GC2的平均值（GC12）為縱坐標(biāo)，GC3為橫坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖并進(jìn)行直線擬合。當(dāng)回歸系數(shù)接近1時(shí)表示GC12與GC3相關(guān)性高，密碼子3個(gè)位置的堿基變異模式相似，表明影響CmR2R3-MYB基因密碼子使用偏好性的主要因素是突變壓力，反之則是自然選擇的影響更大[22]。

ENC-plot分析是以GC3s為橫坐標(biāo)，以理論ENC值（ENCexp）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)實(shí)際ENC值與ENCexp接近時(shí)，說(shuō)明基因的密碼子使用偏好性主要受到突變影響；當(dāng)實(shí)際ENC值與ENCexp遠(yuǎn)離時(shí)，說(shuō)明基因的密碼子使用偏好性主要受到自然選擇壓力影響；當(dāng)ENC值超過(guò)35表明基因密碼子偏好性較弱[23]。

利用MEGA7軟件計(jì)算密碼子第3位堿基的A、G、C、T/U含量（記作A3、G3、C3、T/U3）。以G3/中 G3+C3 作為橫坐標(biāo)， A3/（A3+T3） 作為縱坐標(biāo)，繪制PR2-plot。中心點(diǎn)位置表示A和TG和C的使用頻率相同，表明密碼子使用偏好性主要受突變影響，而分散在除中心處以外的點(diǎn)，表示密碼子使用偏好性除受突變影響外，還受自然選擇壓力和其他因素的影響[21]

1.9CmR2R3-MYB基因在干旱脅迫下的表達(dá)模式分析

利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析干旱脅迫下CmR2R3-MYB基因的表達(dá)量。樣品由武漢邁特維爾生物科技有限公司經(jīng)RNA抽提、純化、建庫(kù)之后，采用二代測(cè)序技術(shù)，基于Illumina測(cè)序平臺(tái)，對(duì)文庫(kù)進(jìn)行雙端測(cè)序。利用HISAT2軟件（http：//ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml）將過(guò)濾過(guò)后的Reads比對(duì)到板栗參考基因組上；然后采用FPKM（fragments per kilobase of transcript per millionfragmentsmapped）作為基因表達(dá)量的指標(biāo)，將基因表達(dá)差異倍數(shù)（foldchange， FC）gt;2 倍且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（1 discovery rate，F(xiàn)DR） lt;0.05 的基因定義為差異表達(dá)基因。通過(guò)TBtools軟件繪制CmR2R3-MYB基因家族成員中差異表達(dá)基因的表達(dá)量熱圖[1]。

2 結(jié)果與分析

2.1CmR2R3-MYB基因家族成員的鑒定、染色體分布、亞細(xì)胞定位分析

共鑒定出141個(gè)CmR2R3-MYB基因家族成員，它們不均等地分布在板栗12條染色體上及1條contig片段上（圖1）。其中，1號(hào)染色體上的CmR2R3-MYB基因家族成員最多，共34個(gè)；3號(hào)染色體的CmR2R3-MYB基因最少，僅5個(gè)。進(jìn)一步預(yù)測(cè)CmR2R3-MYB基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位，141個(gè)成員均定位于細(xì)胞核中。

2.2 CmR2R3-MYB基因家族成員的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

基于141個(gè)CmR2R3-MYB基因編碼蛋白的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果（圖2）表明，將141個(gè)家族成員劃分為6個(gè)類群，其中Group1包含5個(gè)成員；Group2中包含17個(gè)成員；Group3中包含30個(gè)成員;Group4中包含38個(gè)成員；Group5中包含26個(gè)成員；Group6中包含35個(gè)成員。

圖1基因在染色體上的分布情況

Fig.1 Distribution of the genes on the chromosome

注：1～12為染色體；13為contig片段。 Note：1～12 are chromosomes；13 is contig fragment.

2.3CmR2R3-MYB基因家族成員保守基序、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域分析

對(duì)CmR2R3-MYB基因排名前10的保守基序（圖3）進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，多數(shù)成員均包含motif4，其MYB或MYB-like結(jié)構(gòu)域的保守序列；一些motif為個(gè)別類群所特有，如僅Group5中包含motif9（表2）；基因結(jié)構(gòu)顯示，有129個(gè)基因家族成員的內(nèi)含子數(shù)量少于3；僅有12個(gè)基因家族成員的內(nèi)含子數(shù)量大于3。其中，CmMYB24、CmMYB67CmMYB32、CmMYB128、CmMYB33和CmMYB95基因的內(nèi)含子數(shù)為 0，CmMYB58 基因的內(nèi)含子數(shù)最多，為11個(gè)。多序列比對(duì)分析R2、R3結(jié)構(gòu)域序列，結(jié)果（圖4）表明，R2結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)極其保守的色氨酸（W）殘基；在R3結(jié)構(gòu)域中第1個(gè)W被苯丙氨酸（F）或異亮氨酸（I）取代，另外2個(gè)W殘基極其保守。

2.4CmR2R3-MYB基因家族成員順式作用元件

對(duì)CmR2R3-MYB基因家族啟動(dòng)子上游的順式作用元件進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)218個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)元件、804個(gè)激素響應(yīng)元件以及432個(gè)脅迫響應(yīng)元件（圖5）。其中，與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的順式作用元件主要包括玉米蛋白代謝調(diào)節(jié)元件、胚乳表達(dá)元件、分生組織表達(dá)元件、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)元件、類黃酮合成元件一級(jí)晝夜調(diào)控元件；激素響應(yīng)元件主要包括生長(zhǎng)素響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件和應(yīng)元件（圖5）。

圖2CmR2R3-MYB蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2Phylogenetic tree of CmR2R3-MYB proteins

表2不同類群的Motif

Table 2Motifs of different groups

2.5 CmR2R3-MYB基因家族成員的共線性分析

共線性分析（圖6A）表明，共檢測(cè)到28對(duì)CmR2R3-MYB基因家族成員呈共線性基因?qū)ΑＲ罁?jù)共線性進(jìn)一步分析CmR2R3-MYB基因家族成員的復(fù)制類型，結(jié)果（圖6B）表明，相較整個(gè)板栗基因組所有基因?qū)Φ膹?fù)制類型，分散復(fù)制（dispersedduplication，DSD）在CmR2R3-MYB基因家族中占比明顯減少，而全基因組復(fù)制（wholegenomeduplication，WGD）與串聯(lián)復(fù)制（tandemduplication，TD）在CmR2R3-MYB基因家族中占比明顯增加，近端復(fù)制（proximalduplication，PD）與轉(zhuǎn)座子復(fù)制（transposedduplication，TRD）在CmR2R3-MYB基因家族中占比變化不明顯。計(jì)算全部復(fù)制類型基因?qū)Φ?K_a，K_s 值，結(jié)果（圖6C）發(fā)現(xiàn)，全部基因?qū)Φ?K_a/K_s 值都小于1，并且多數(shù)PD和TD的 K_s 值小于WGD、DSD和TRD。

進(jìn)一步對(duì)板栗與擬南芥、水稻、美洲栗、日本栗進(jìn)行共線性分析（圖7）發(fā)現(xiàn)，CmR2R3-MYB基因家族成員中有47個(gè)與擬南芥存在共線性；有27個(gè)與水稻存在共線性；有108個(gè)與美洲栗存在共線性；有108個(gè)與日本栗存在共線性。

2.6CmR2R3-MYB基因家族密碼子偏好性分析

對(duì) CmR2R3-MYB 基因的密碼子RSCU值（圖8）進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，除去3個(gè)終止密碼子外，有32個(gè)密碼子的RSCU值lt;1，有27個(gè)密碼子RSCU值gt;1。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，RSCU值 _lt;1 的密碼子中有6個(gè)以A結(jié)尾、1個(gè)以U結(jié)尾、9個(gè)以G結(jié)尾、16個(gè)以C結(jié)尾；RSCU值 gt;1 的密碼子有8個(gè)以A結(jié)尾、15個(gè)以U結(jié)尾、4個(gè)以G結(jié)尾。

中性繪圖分析（圖9A）發(fā)現(xiàn)，GC12與GC3相關(guān)性較低。ENC-plot繪圖分析（圖9B）發(fā)現(xiàn)，多數(shù)基因的ENC值位于ENCexp值下方，少數(shù)基因的ENC值在ENCexp標(biāo)準(zhǔn)曲線上，且ENC值均超過(guò)35。PR2-plot繪圖分析（圖9C）發(fā)現(xiàn)，多數(shù)位于中心點(diǎn)右側(cè)，少數(shù)位于中心點(diǎn)處。

2.7 CmR2R3-MYB基因家族成員在干旱脅迫下的表達(dá)情況

為探究干旱脅迫對(duì)CmR2R3-MYB基因表達(dá)的影響，對(duì)干旱脅迫下的板栗幼苗葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果（圖10A）顯示，共有1249個(gè)基因差異表達(dá)，其中293個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，956個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，有7個(gè)CmR2R3-MYB基因家族成員在干旱脅迫下差異表達(dá)，其中CmMYB89表達(dá)量上調(diào)，而CmMYB32、CmMYB95CmMYB91、CmMYB119、CmMYB131和CmMYB104表達(dá)量下調(diào)（圖10B）。RT-qPCR結(jié)果（圖11）進(jìn)一步證實(shí)，CmMYB89在干旱脅迫處理后表達(dá)量極顯著上調(diào)，而CmMYB32、CmMYB95、CmMYB91、CmMYB119、CmMYB131和CmMYB104在干旱脅迫處理后表達(dá)量極顯著下調(diào)。

3討論

MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中成員數(shù)量較多的基因家族之一，其N端包含高度保守的MYB結(jié)構(gòu)域[24]。R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的MYB亞家族，它們通過(guò)特異性結(jié)合靶基因啟動(dòng)子的關(guān)鍵序列來(lái)激活或抑制轉(zhuǎn)錄[24]。研究表明，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)[9-10.24]。本研究基于板栗基因組數(shù)據(jù)，共鑒定到141個(gè)CmR2R3-MYB基因家族成員，它們不均等地分布在12條染色體及1個(gè)contig片段上；亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，CmR2R3-MYB蛋白都位于細(xì)胞核中；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)將其分為了6個(gè)類群，類群內(nèi)成員擁有更為相似的motif；多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，保守的R3結(jié)構(gòu)域中第1個(gè)色氨酸（W）被F或I取代，另外2個(gè)W殘基非常保守，R2結(jié)構(gòu)域包含了3個(gè)非常保守的W殘基。這些保守的氨基酸殘基可能對(duì)維持MYB結(jié)構(gòu)域和功能起重要作用，與核桃中的研究結(jié)果一致。順式作用元件分析顯示，CmR2R3-MYB基因家族成員在生長(zhǎng)發(fā)育、激素響應(yīng)與逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用，這與前人研究結(jié)果一致5-，表明CmR2R3-MYB基因家族在板栗生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

圖5基因家族成員順式作用元件數(shù)量及其在啟動(dòng)子上的分布

Fig.5Cis-acting elements of gene family members and distribution on promoters

A：基因組內(nèi)共線性；B：基因家族復(fù)制類型；C：替換率

A；Collinearityin genome；B：Type of genefamily duplications；C：Replacement rateneamollisimawithArabidopsisthaliana，Oryzasativa;B：CastaneamollssimawithCastaneadentataandCastaneacren

圖6CmR2R3-MYB基因家族成員的共線性及復(fù)制類型

Fig.6Collnearity analysis among CmR2R3-MYB gene family members and duplication types

圖7板栗與其他種間R2R3-MYB基因家族的共線性分析

Fig.7Collinearity analysis of R2R3-MYB gene family between chestnut and other species

圖8CmR2R3-MYB基因密碼子的RSCU值

Fig.8RSCU values of codon of CmR2R3-MYB genes

圖9CmR2R3-MYB基因家族密碼子偏好性分析 Fig.9 Codonbiasanalysisof CmR2R3-MYB genefamily

基因復(fù)制是產(chǎn)生新基因并最終產(chǎn)生新生物學(xué)功能的主要機(jī)制，對(duì)植物進(jìn)化及適應(yīng)能力至關(guān)重要[25]。因此，本研究對(duì)CmR2R3-MYB基因家族在全基因組的共線性及復(fù)制類型進(jìn)行分析，結(jié)果表明，基于板栗全基因組共發(fā)現(xiàn)了28對(duì)共線性CmR2R3-MYB基因?qū)Γ瑫r(shí)基于共線性數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，WGD產(chǎn)生的CmR2R3-MYB基因?qū)τ?8對(duì)；DSD產(chǎn)生的有43對(duì)；PD產(chǎn)生的有7對(duì)；TD產(chǎn)生有17對(duì)；TRD產(chǎn)生的有15對(duì)。相較整個(gè)板栗基因組所有基因?qū)Φ膹?fù)制類型，DSD在CmR2R3-MYB基因家族中占比明顯減少，而WGD和TD的占比明顯增加，PD和DSD的占比變化較小，表明WGD與TD對(duì)CmR2R3-MYB基因家族擴(kuò)增起到了非常重要的作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，所有復(fù)制類型基因?qū)Φ?K_a/K_s"都小于1，表明CmR2R3-MYB基因家族正在經(jīng)歷明顯的純化選擇壓力[2。多數(shù)PD和TD的Ks值小于WGD、DSD、TRD，表明這PD和TD的基因?qū)Ξa(chǎn)生于近期[27]。

A：干旱脅迫后轉(zhuǎn)錄組分析的火山圖;B：CmR2R3-MYB基因家族中差異表達(dá)基因的表達(dá)熱圖 A：Volcanomapof transcriptomeanalysisafterdroughtstress；B：HeatmapofdiferentiallyexpressedCmR2R3-MYB genes

圖10干旱脅迫下CmR2R3-MYB轉(zhuǎn)錄組分析

Fig.10TranscriptomeanalysisofCmR2R3-MYBunderdroughtstress

圖11CmR2R3-MYB差異表達(dá)基因在不同處理的相對(duì)表達(dá)量

Fig.11Relative expressions of differentially CmR2R3-MYBexpressed genes underdifferent treatments

注：**和***分別表示與對(duì)照相比在 Plt;0.01 和 Plt;0.001 水平差異顯著。

Note ：**and ??? indicate significant differences compared with CK at Plt;0.01 and Plt;0.001 levels，respectively.

CmR2R3-MYB基因家族密碼子偏好性分析發(fā)現(xiàn)，有27個(gè)密碼子的RSCU值高于1，其中，8個(gè)以A結(jié)尾、15個(gè)以U結(jié)尾、4個(gè)以G結(jié)尾，表明密碼子使用頻率較高的密碼子偏好以A/U結(jié)尾；141個(gè)CmR2R3-MYB基因家族成員的ENC值都大于35，說(shuō)明CmR2R3-MYB基因家族的密碼子偏好性較弱。中性繪圖、ENC-plot及PR2-plot分析均表明，CmR2R3-MYB基因家族的密碼子偏好性受自然選擇與突變壓力共同影響，但主要受自然選擇影響[21]。

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和RT-qPCR分析CmR2R3-MYB基因家族成員在干旱脅迫下的表達(dá)，均發(fā)現(xiàn)CmMYB89在干旱脅迫下表達(dá)量極顯著上調(diào)，而CmMYB32、CmMYB95、CmMYB91、CmMYB119、CmMYB131及CmMYB104在干旱脅迫下表達(dá)量極顯著下調(diào)，表明這7個(gè)CmR2R3-MYB基因在干旱脅迫過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用，為后期探究R2R3-MYB基因家族在板栗響應(yīng)干旱脅迫方面的作用奠定了理論基礎(chǔ)。

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