高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中O-丙基伐地那非和O-丙基羥基伐地那非

Determination of O-Propyl Vardenafil and O-Hydroxypropyl Vardenafil in Foods by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Sisi， ZHOU Xueyun （GuangdongHongke Testing Technology Co.，Ltd.，Huizhou 516ooo， China）

Abstract： To establish a method for the simultaneous determination of O-propyl vardenafil and O-hydroxypropyl vardenafil in food by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Method： After ultrasonic extraction and constant volume with methanol aqueous solution， O-propyl vardenafil and O-hydroxypropyl vardenafil were separated under gradient elution conditions using 0.1% formic acid aqueous solution-acetonitrile as the mobile phase，and determined by mass spectrometry scanning with multiple reaction ion monitoring.Result： The two compounds had good linear relationships in the mass concentration range of 1ng?mL^-1 to 100ng?mL^-1 and 2ng?mL^-1 （2 to 200ng?mL^-1 ， and the correlation coefficient was greater than 0.990; the detection limit of O-propyl vardenafil was （20 0.05mg?kg^-1 ，and the quantification limit was 0.10mg^.kg^-1 ; the detection limit of O-hydroxypropyl vardenafil was 0.10mg^.kg^-1 ，and the quantification limit was 0.20mg^.kg^-1 ；the recoveries at different addition levels were 83.4% to 103.0% ，and the relative standard deviation was less than 10% .All key indicators met the requirements for trace detection ofillegal aditives. Conclusion： The detection method constructed in this studyhas the advantages of simple operation，accuratequantitativedetermination and high sensitivity.It can simultaneously complete the determination of two new types of banned aditives，and can efectively meet the needs of screening，confirmation and quantitative analysis of banned additives in food.

Keywords： O-propyl vardenafil; O-hydroxypropyl vardenafil; illegal additives; foods

近年來，隨著工作壓力的不斷增加，性功能障礙的發(fā)病率逐年上升，患者人數(shù)日益增多。目前，國內(nèi)用于治療勃起功能障礙的相關(guān)中西藥物大多數(shù)屬于磷酸二酯酶5型（Phosphodiesterase Type5，PDE-5）抑制劑[1]。它能夠抑制PDE-5酶的活性，使陰莖海綿體內(nèi)的環(huán)磷酸鳥苷（CyclicGuanosineMonophosphate，cGMP）水平升高，從而增加血液流量，改善勃起功能。然而，隨著市場需求的不斷擴(kuò)大，部分不法商家為了追求利潤、規(guī)避監(jiān)管，常將多種非法添加物混合后加人食品中[2，給消費(fèi)者帶來健康隱患。有研究發(fā)現(xiàn)，在固體飲料、壓片糖果等食品基質(zhì)中檢測出單種或多種新型PDE-5抑制劑及其衍生物，典型代表包括N-苯基丙氧苯基卡巴地那非、那非乙酰酸[3]、O-丙羥基伐地那非[4等。此類化合物均為基于PDE-5通過化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾獲得的抑制類藥物，因未被納入現(xiàn)行國家檢測標(biāo)準(zhǔn)體系且缺乏配套檢測規(guī)范，對監(jiān)管執(zhí)法工作構(gòu)成了現(xiàn)實(shí)挑戰(zhàn)。

O-丙基伐地那非和O-丙基羥基伐地那非同屬于PDE-5抑制劑，藥理作用具有相似性，也存在被不法商家添加到食品中的風(fēng)險(xiǎn)。由于這類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且含量往往較低，傳統(tǒng)的檢測方法如薄層色譜法、液相色譜法等難以滿足對其準(zhǔn)確、靈敏檢測的需求。目前，已報(bào)道的O-丙基伐地那非或O-丙基羥基伐地那非的非靶向性篩查、確證、定量方法均為單一測定方法，尚未見兩者同步測定的研究。因此，開發(fā)一種高效、準(zhǔn)確，可同時(shí)測定上述兩種目標(biāo)化合物的方法，對于保障食品安全至關(guān)重要。本研究運(yùn)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對O-丙基伐地那非與O-丙基羥基伐地那非的同步測定，為高效、準(zhǔn)確檢測食品中非法添加的新型PDE-5抑制劑及結(jié)構(gòu)類似物提供了可靠手段。

1材料與方法

1.1材料與試劑

食品樣品均為網(wǎng)絡(luò)平臺購買。

標(biāo)準(zhǔn)品O-丙基伐地那非、O-丙基羥基伐地那非（純度分別為 99.3% 、 95.7% ，上海安譜璀世公司）;乙晴、甲醇（均為色譜純，德國Merck公司）；甲酸（LC-MS級，上海安譜實(shí)驗(yàn)公司）；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水；微孔濾膜（ 0.22μm 有機(jī)相，上海安譜實(shí)驗(yàn)公司）。

1.2儀器與設(shè)備

ABTripleQuad4500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國SCIEX公司）；MS105DU型分析天平（精度0.01mg ，瑞士梅特勒公司）；PX223ZH/E型電子天平（精度 1mg ，美國奧豪斯公司）；IKAMS3basic旋渦混合器（德國IKA公司）；3K15離心機(jī)（德國SIGMA公司）；Q-Piterl0-DVX純水機(jī)（湖南啟沁環(huán)保科技有限公司）；SB25-12DT超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；數(shù)字可調(diào)移液器（德國BRAND公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：精密稱取O-丙基伐地那非標(biāo)準(zhǔn)品約 1mg 、O-丙基羥基伐地那非標(biāo)準(zhǔn)品約 5mg 分別置于 10mL 、 50mL 容量瓶中，用適量甲醇溶解并定容至刻度線，搖勻，配制成質(zhì)量濃度約為0.1mg?mL^-1 的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，儲存在 -18°C 的冰箱中，備用。

標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液 1mL 于100mL 容量瓶中，用甲醇水溶液（ 1：1 ，V/V定容至刻度線，混勻，配制成質(zhì)量濃度為 1μg?mL^-1 的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，儲存在 -18°C 的冰箱中，備用。

系列標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用甲醇水溶液（ 1：1 ，V/V稀釋定容至容量瓶中，搖勻，配制成適宜濃度的O-丙基伐地那非、O-丙基羥基伐地那非混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，臨用時(shí)現(xiàn)配。

1.3.2樣品溶液制備

液態(tài)樣品：取適量試樣，搖勻，稱取 1g （精確至 0.001g ）試樣置于 50mL 容量瓶中，加甲醇水溶液（ 1：1 ，V/V）約 40mL ，超聲提取 15min ，放冷至室溫，用甲醇水溶液定容至刻度，經(jīng) 0.22μm 微孔濾膜（有機(jī)相）過濾，取續(xù)濾液待測。

固態(tài)或半固態(tài)試樣：取適量固態(tài)試樣混勻，研細(xì)，或適量取半固態(tài)試樣混勻，稱取 1g 試樣（精確至0.001g ）加入 50mL 容量瓶中，加甲醇水溶液（ 1：1 V/V ）約 40mL ，超聲提取 15min ，放冷至室溫，用甲醇水溶液（ 1：1 ，V/V）定容至刻度；將上述提取液全部轉(zhuǎn)移至 50mL 離心管中， 4000r?min^-1 離心5min ，取上清液經(jīng) 0.22μm 微孔濾膜（有機(jī)相）過濾，續(xù)濾液待測。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：CORTECS UPLC C₁₈ （ 100mm×2.1mm ， 1.6μm ）；流動(dòng)相： 0.1% 甲酸-水溶液（A）和乙晴（B）；流速： 0.3mL?min^-1 ；進(jìn)樣體積： 2μL ；柱溫 40% 。梯度洗脫程序： 0～1.1min 10%B . 1.1～1.6min ， 10%50%B ， 1.6～2.5min 50%B ： 2.5～3.3min ， 50%90%B ; 3.3～4.5min 90%B ， 4.5～5.0min ， 90%10%B 5～7min 10%B 。

（2）質(zhì)譜條件。離子源電噴霧離子源;掃描方式正離子模式；檢測方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測；電離電壓：

5.5kV ；氣簾氣壓力： ；霧化氣壓力： 379.21kPa（55psi） ；輔助氣壓力： 344.74kPa （ 50psi ）；離子源溫度： 350°C 。

1.3.4檢出限和定量限

向固體飲料、壓片糖果、配制酒和果凍的空白基質(zhì)中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液制成陽性樣品，按1.3.2項(xiàng)方法處理，1.3.3項(xiàng)方法檢測，以3倍信噪比（S/N）對應(yīng)的濃度作為兩種目標(biāo)化合物的檢出限（LimitsofDetection，LOD），以10倍信噪比對應(yīng)的濃度確定其定量限（Limits ofQuantification，LOQ）[5]

1.3.5 精密度和準(zhǔn)確度

在固體飲料、壓片糖果、配制酒和果凍4種空白基質(zhì)樣品中，分別添加1倍、2倍、10倍定量限水平的O-丙基伐地那非、O-丙基羥基伐地那非，每個(gè)水平平行制備樣品7份，按1.3.3項(xiàng)方法檢測，對方法的回收率及精密度進(jìn)行考察。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

以針泵恒流進(jìn)樣的方式注入適量濃度的O-丙基伐地那非、O-丙基羥基伐地那非，在正離子模式下進(jìn)行一級掃描確定目標(biāo)化合物的母離子，確定母離子后進(jìn)一步掃描碎片離子。通過母離子、特征碎片離子掃描，確定O-丙基伐地那非、O-丙基羥基伐地那非的定性離子及定量離子。2種目標(biāo)化合物的具體質(zhì)譜檢測參數(shù)如表1所示。

2.2色譜條件優(yōu)化

目標(biāo)化合物采用正離子模式進(jìn)行掃描，實(shí)驗(yàn)選擇在水－甲醇、水－乙腈2種流動(dòng)相體系中添加甲酸、不添加甲酸、添加 0.1% 甲酸系列不同流動(dòng)相組合進(jìn)行對比，觀察色譜峰峰形、靈敏度等相關(guān)參數(shù)。結(jié)果表明，采用甲酸水溶液-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)， O- 丙基伐地那非、O-丙基羥基伐地那非離子化效果最好且峰形最佳。結(jié)合化學(xué)結(jié)構(gòu)分析可知，這兩種目標(biāo)化合物適合采用正離子模式采集，而在流動(dòng)相中加入甲酸會促進(jìn)目標(biāo)物電離，進(jìn)而顯著提升離子化效率[]

2.3方法線性范圍、檢出限和定量限

采用外標(biāo)法定量，以峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。O-丙基伐地那非、O-丙基羥基伐地那非在 和 2～200ng?mL^-1 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.99，說明線性關(guān)系良好，可用于定量檢測分析。以“果凍”基質(zhì)為例，其相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限結(jié)果如表2所示。

2.4方法精密度及準(zhǔn)確度

采用已優(yōu)化好的液相色譜、質(zhì)譜條件對固體飲料、配制酒、果凍和壓片糖果4種基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收測定，平行測定7次，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RelativeStandardDeviation，RSD）。結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確度高、精確度好，可滿足定量檢測要求。相關(guān)數(shù)據(jù)見表3。

2.5保留時(shí)間及離子豐度比比較結(jié)果

將O-丙基伐地那非、O-丙基羥基伐地那非標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間及離子豐度比，與樣品中目標(biāo)化合物的保留時(shí)間及離子豐度比進(jìn)行比較。結(jié)果表明，樣品中目標(biāo)物的保留時(shí)間相對標(biāo)準(zhǔn)溶液變化范圍小于2.5% ，離子豐度比小于 20% ，方法滿足定性檢測要求。

2.6 實(shí)際樣品檢測結(jié)果

采用本研究建立的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對網(wǎng)絡(luò)平臺購買的10批次食品樣品進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，所有樣品中均未檢出O-丙基伐地那非和O-丙基羥基伐地那非。

表1目標(biāo)化合物的質(zhì)譜信息

注： * 為定量離子。

表22種化合物的線性關(guān)系、檢出限及定量限

表34種食品基質(zhì)中0-丙基伐地那非、0-丙基羥基伐地那非的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 （n=7

3結(jié)論

本研究建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定食品中O-丙基伐地那非、O-丙基羥基伐地那非的分析方法。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法前處理操作簡便、定量準(zhǔn)確、靈敏度高，能夠滿足食品中上述兩種目標(biāo)化合物的快速測定、準(zhǔn)確定量需求。該方法不僅適用于同時(shí)測定食品中O-丙基伐地那非、O-丙基羥基伐地那非，也為其他PDE-5抑制劑或那非類似物質(zhì)的檢測提供了技術(shù)參考。

參考文獻(xiàn)

[1]饒雅琨，王苑桃，孫曉，等.食品中一種新型非法添加物O-丙基伐地那非的快速篩查和定量測定[J]食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2024，15（6）：228-235.

[2]夏金濤，吳婉琴，江豐，等.壓片糖果中一種新型伐地那非衍生物的發(fā)現(xiàn)和確證[J].分析試驗(yàn)室，2024，43（7）：1004-1010.

[3]任靜，董培智，趙麗紅.DART-MS/MS快速檢測食品中非法添加的N-芐基他達(dá)拉非等7種新型PDE-5型抑制劑[J].食品與藥品，2023，25（4）：329-333.

[4]夏金濤，張莉，吳婉琴，等.保健食品中O-丙基羥基伐地那非的快速篩查、確證和定量測定[J]食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2024，15（21）：13-21.

[5]劉雅婷，郭予昕，劉振強(qiáng)，等.食品中一種新型伐地那非結(jié)構(gòu)類似物的篩查與定量測定[J.分析測試學(xué)報(bào)，2023，42（11）：1488-1494.

[6]馬俊美，王敬，孫文毅，等.超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定保健食品中90種那非類藥物[J].食品科學(xué)，2020，41（14）：307-313.