分子生物學技術在食品微生物檢測中的應用研究

Research on the Application of Molecular Biology Techniques in Food Microbiological Detection

KONGLiyan，SUNXiaoyan， SUNXue，ZHANGJinxia， ZHANGYawei （Shenyang Food andDrug Inspection Institute，Shenyangl1oooo， China）

Abstract： Due to problems such as poor timelinessand insuffcient sensitivity，traditional microbial detection methods are diffcult to met the analytical requirements ofcomplex food matrices. Molecular biotechnology has been widely applied inthe fieldoffood microbiological detection due toits advantages suchas rapidity，sensitivity，high eficiency and strong specificity. This paper systematically reviews the application of molecular biology techniques such as Polymerase Chain Reaction （PCR），real-time fluorescent quantitative PCR，isothermal amplification，gene chips and high-throughput sequencing in the detection of food microorganisms，and discusses the challnges and future development trends faced bythese techniques in practical applications，toprovide atheoretical basis forfurther promoting the application of molecular biology techniques and improving the level of food microbiological detection.

Keywords： molecular biology techniques; food microbiological testing; Polymerase Chain Reaction（PCR）; isothermal amplification; gene chip

食源性疾病是全球嚴重的公共健康問題。世界衛生組織數據顯示，全球每年發病約6億例，其中微生物污染是主要誘因[1]。傳統食品微生物檢測主要使用培養和生化鑒定方法，雖然結果可靠，但是檢測時間長、靈敏度低且無法檢測不可培養的微生物。隨著科技進步，分子生物學技術為食品微生物快速檢測提供了新途徑。該技術不僅能快速、準確鑒定食品中的微生物，而且可實現致病微生物的高通量與實時檢測，顯著提升檢測效率和準確性。本文將系統綜述分子生物學技術在食品微生物檢測中的應用及存在的問題，為提高食品微生物檢測水平提供理論依據。

1分子生物學技術在食品微生物檢測中的重要性

食品安全關乎公眾健康與社會穩定，微生物污染是導致食源性疾病和食物中毒的主要因素，對人們健康構成了嚴重威脅。目前，我國主要采用傳統培養法結合生化鑒定進行食品微生物檢測，如《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》（GB4789.4—2014）和《食品安全國家標準食品微生物學檢驗志賀氏菌檢驗》（GB4789.5—2012）等標準方法。然而，隨著食品工業的快速發展和檢測需求的不斷提升，傳統檢測方法的局限性日益凸顯。例如，檢測周期過長，以沙門氏菌檢測為例，需經歷預增菌、選擇性增菌、分離培養和生化鑒定等多個環節，整個過程耗時 4～7d ，難以滿足現代食品安全快速檢測的迫切需求；對于低載量但高活性的微生物，傳統培養法存在富集效率低下的問題；對于新型微生物或復雜樣本，基于生化反應或血清學分型的鑒定方法準確性和可靠性較低。

相較于傳統培養方法，分子生物學技術檢測速度更快、靈敏度更高，可以檢測微量微生物。以核酸擴增技術為例，聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction，PCR）可靶向識別目標微生物的DNA序列;而實時熒光定量PCR通過動態監測熒光信號，同步完成微生物污染的定性與定量分析，能夠為食品安全風險評估提供重要依據。近年來，以基因芯片和高通量測序為代表的組學技術的快速發展進一步拓展了檢測維度。基因芯片通過固相探針矩陣可同步檢測多種食源性病原菌；高通量測序技術可從復雜樣本中解析微生物群落組成，實現對細菌、真菌及病毒的多靶標同時鑒定[2]。

2分子生物學技術在食品微生物檢測中的應用

2.1 PCR技術

PCR技術是現代分子生物學領域的重要檢測技術。其通過特異性引物擴增DNA，能在 2～3h 內實現目標DNA數量指數級擴增。在食源性致病微生物檢測領域，利用該技術成功建立了大腸埃希氏菌、沙門氏菌及單核細胞增生李斯特菌等典型病原體的快速鑒定體系[3]。隨著技術的不斷迭代，傳統PCR技術已衍生出多重PCR與數字PCR兩大技術分支。

多重PCR通過設計多組引物，可以同時檢測多個目標。LEE等[針對即食食品構建了多重PCR體系，能同步檢出大腸桿菌O157：H7、蠟樣芽孢桿菌、副溶血性弧菌等6種常見致病菌，檢測限低至100CFU?mL^-1 ，顯著提升了食源性病原體的檢測效率。相比之下，數字PCR將樣本分割成數萬份納升級微滴，每個微滴獨立擴增，靈敏度較常規PCR提高百余倍，并能精確計算DNA的絕對拷貝數。李恩靜等[5]以rplK基因為靶標，建立了適用于嬰幼兒配方乳粉中乳桿菌的數字PCR絕對定量方法。魏詠新等[則以hlyA為靶標，利用數字PCR在人工污染的三文魚中檢出大腸桿菌O157：H7，靈敏度達到110 CFU- g^-1 。

2.2 實時熒光定量PCR技術

實時熒光定量PCR技術通過監測擴增體系中熒光信號的變化，實現核酸擴增與定量分析的同步進行。與傳統PCR技術相比，實時熒光定量PCR不僅檢測靈敏度更高，而且閉管檢測方式有效避免了產物污染。目前，實時熒光定量PCR已在基因表達、病原鑒定等諸多領域得到廣泛應用。在食源性致病菌檢測方面，實時熒光定量PCR技術不斷推陳出新，衍生出多種檢測體系。例如，DEMIRCI等開發的TaqMan探針法能夠同步檢測乳制品中的沙門氏菌和志賀氏菌。王建昌等[8設計的rfbE和flic基因雙靶標實時熒光定量PCR體系，實現了對大腸桿菌0157：H7的特異性識別。

2.3 等溫擴增技術

等溫擴增技術作為一種在恒定溫度下開展核酸擴增的手段，憑借其操作簡便、快速高效、靈敏度高等諸多優勢，在食源性病原菌檢測方面得到了極為廣泛的應用。

2.3.1環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增技術是等溫擴增技術中應用最廣泛的技術之一。該技術的原理是借助BstDNA聚合酶，通過精心設計4～6條特異性引物來識別6～8個靶序列區域，在 60～65‰ 的恒溫條件下，實現快速且高效的核酸擴增目標[9。在食品檢測領域，環介導等溫擴增技術已成功應用于沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157：H7、金黃色葡萄球菌等常見食源性病原菌的檢測工作[10]

2.3.2重組酶聚合酶擴增技術

重組酶聚合酶擴增技術借助重組酶與引物的結合，精準識別模板DNA中的同源序列，置換出單鏈DNA，隨后鏈置換DNA聚合酶在該單鏈上高效合成互補鏈，從而實現核酸的快速等溫擴增。重組酶聚合酶擴增在 37～42°C 的恒溫條件下進行，整個反應過程約 30min 。重組酶聚合酶擴增技術與側向層析生物測定聯用，能夠迅速檢測出食物或水中的大腸桿菌 O157?H7^[11] ；重組酶聚合酶擴增技術結合PfAgo核酸內切酶，可快速鑒定食品中的沙門氏菌[12]

2.3.3 滾環擴增技術

滾環擴增技術以環狀DNA模板和具有鏈置換活性的DNA聚合酶為核心，在等溫條件下實現DNA的高效擴增。苑寧等[3]和張蘊哲等[4]分別以hlyA基因和 stn 基因為靶標，構建了可視化跨越式滾環擴增體系，實現了對人工污染食品中單增李斯特菌和沙門氏菌的快速檢測，靈敏度較PCR提升100倍，檢出限分別低至 2.8CFU?g^-1 和 3.8CFU?g^-1 ，實現了致病菌的超靈敏、便捷檢測。

2.4 基因芯片技術

基因芯片技術是一種高通量的分子生物學技術，通過在固相載體表面實施寡核苷酸探針的并行雜交反應，能夠在單次實驗中對數以千計的微生物特異性基因標記物進行同步檢測。該技術的核心優勢在于探針與靶標序列的特異性結合、熒光信號的空間分辨率。這使其特別適用于食品微生物組的大規模譜系分析[5]。SARENGAOWA等[開發的一種原位合成的基因芯片，能夠同步識別新鮮果蔬中沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌及大腸桿菌O157：H7的特異性毒力基因。為了滿足復雜樣本中多病原檢測的需求，SHIN等[1開發了一種基于16SrRNA基因的衍生芯片，通過保守區與可變區探針的組合設計，實現了對志賀氏菌屬、弧菌屬等16類食源性致病菌的同步鑒定。

2.5 高通量測序技術

高通量測序技術憑借其高通量、高靈敏度及快速檢測的顯著優勢，革新了食品微生物檢測的傳統模式。該技術通過對樣本微生物基因組信息進行全面、深人的解析，有效克服了傳統培養方法的諸多局限性。在食源性病原體的研究領域，美國疾控中心利用高通量測序技術成功識別了多起與李斯特菌污染相關的疫情，顯著提升了公共衛生響應效率[18]。與此同時，宏基因組學和擴增子測序等方法也被廣泛應用于食品樣品中復雜微生物群落的整體分析。例如，LEONARD等[19通過宏基因組測序在菠菜樣品中直接檢測并分型產志賀毒素的大腸桿菌。

3分子生物學技術在食品微生物檢測中應用面臨的挑戰與展望

分子生物學技術在食品微生物檢測領域展現出了巨大的應用潛力，但在實際應用中面臨一些挑戰。① 技術本身的局限性。例如，盡管PCR技術靈敏度和特異性較高，但聚合酶活性易受食品基質中抑制劑的影響，從而導致出現假陰性或假陽性結果；實時熒光定量PCR雖可實現定量分析，但標準曲線建立需精確控制擴增效率，并且跨實驗室數據可比性有待提升；等溫擴增技術操作簡便、快速，但多重檢測體系開發受引物間交叉反應限制，影響結果準確性，目前多用于單靶標檢測；基因芯片技術的高通量優勢與檢測成本密切相關，同時探針設計依賴已知基因組信息，難以檢測新型變異株；高通量測序技術雖可全面解析微生物群落，但測序成本高，而且難以滿足現場快速檢測需求。 ② 不同技術之間的協同性與標準化問題亟待解決。現階段，各種分子生物學技術在食品微生物檢測中的應用較為分散，缺乏統一的標準和規范，不同實驗室方法的可比性較低。這在很大程度上限制了其在全球食品貿易監管中的有效應用。

未來，食品微生物檢測技術的發展應聚焦于突破現有技術瓶頸并實現多技術協同創新。在技術優化方面，針對PCR技術易受抑制劑干擾的問題，可通過開發耐抑制劑型DNA聚合酶或優化核酸提取流程來提升檢測穩定性；對于實時熒光定量PCR技術，可通過建立標準化的操作流程和制備穩定的微生物核酸標準品，以增強實驗室間數據的可比性；對于等溫擴增技術，可通過多序列比對設計反應溫度一致的保守引物，并優化反應條件，以實現多病原體的同步檢測；對于基因芯片技術，需要結合生物信息學工具動態更新探針庫，以應對新型變異株的檢測需求；對于高通量測序技術，可通過開發智能化的自動化分析平臺，結合人工智能算法，在保留其高通量優勢的基礎上提升檢測速度，同時降低其使用成本和操作復雜度。此外，應重點開發便攜式檢測設備，加強檢測人員的專業培訓，推進標準化體系建設。這些措施將共同推動食品微生物檢測技術的創新發展，為食品安全監管提供更可靠的技術支持。

4結語

食品微生物檢測正經歷從培養法到分子生物學技術的轉變。PCR、實時熒光定量PCR、等溫擴增、基因芯片和高通量測序等技術各具特點，在食品微生物檢測中都發揮著獨特作用。盡管這些技術在食品微生物檢測中的應用面臨一些挑戰，但隨著技術的不斷進步和創新，分子生物學技術必將在食品微生物檢測領域發揮更大的作用。

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