高效液相色譜法同時測定不同品種菊花中4種活性成分的含量

Determination of Four Active Components in Different Chrysanthemum Varieties by High Performance Liquid Chromatography

DANG Yuxia （Traditional Chinese Medicine， Gulang County People's Hospitale， Gulang 733100， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the simultaneous determination of the contents of four active components in chrysanthemums by high performance liquid chromatography， which isused to detect thecontents of the four active components in diferent varieties of chrysanthemums.Method： The gradient elution method is adopted. The flow rate is 1.0mL?min^-1 ，the column temperature is 35^°C ，the detection wavelength is 348nm ，and quantification was performed by the external standard method.Result： The four components were well separated within 25min ，witharecoveryrateof 85.50% to 100.38% ，arelative standard deviationof 1.3% to 4.6% and the detection limit and quantification limit met the requirements.The contents of chlorogenic acid，luteolin， isochlorogenic acid B and isochlorogenic acid A in the five kinds of chrysanthemums were 0.304% to 0.775% 0.089% （2號 to 0.789% 0.088% to 0.341% and 0.621% to 1.981% ，respectively. Conclusion： This method is accurate and stable， and can provide a reference for evaluating the quality of different varieties of chrysanthemums.

Keywords： high performance liquid chromatography; chrysanthemum; active ingredient

1材料與方法

菊花作為常用的藥食同源食品，具有清熱去火、消炎解毒、平肝明目、抗炎抗病毒、抗氧化、降血糖血脂的功效，通常用于泡茶飲用或作為藥用輔助，以改善口腔潰瘍引起的疼痛、眼晴干澀紅腫等不適癥狀[1-5]。菊花中含有多種活性成分，主要活性成分為木犀草苷等黃酮類、綠原酸等有機酸、多酚類化合物、多糖類、揮發(fā)油類[6-9]。菊花在菜肴、糕點、飲料、牙膏、藥物以及保健食品中都有廣泛的應用。本試驗同時測定不同批次菊花中綠原酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A含量的方法，以期為評價其質(zhì)量提供參考。

1.1材料與試劑

實驗用菊花品種為貢菊、杭白菊、胎菊、毫菊、金絲黃菊，市售。

綠原酸（批號為110753-202119，純度為 96.3% ），木犀草苷（批號為111720-202312，純度為 98.1% ），異綠原酸A（批號為111782-202208，純度為 98.85% ），異綠原酸B（批號112111-202401，純度不低于 98% ），均購于中國食品藥品檢定研究院。

1.2儀器與設備

1290液相色譜儀，美國安捷倫公司；電子天平，德國賽多利斯公司。

1.3 樣品處理

將菊花樣品研細，分別精密稱取 0.25g 于磨口錐形瓶中，加入 25mL70% 甲醇-水溶液 （ν/ν ），稱定質(zhì)量，水浴加熱同時冷凝反流萃取 30min ，放置冷卻，用 70% 甲醇水溶液 （ν/ν ）稱重補量，過濾上清液，待測。

1.4標準系列溶液的制備

精密稱取各標準品綠原酸 2.443lmg 、木犀草苷 2.0563mg 、異綠原酸 B2.9345mg 、異綠原酸A3.4121mg ，分別用 70%（ν/ν） 甲醇溶液定容至 10mL 。精密吸取以上4種標準品溶液配制成混合儲備液。分別吸取混合儲備液0.1、0.2、0.4、0.5、0.8、 1.0mL 配制成相應濃度的標準系列溶液。

1.5色譜條件

C₁₈ 色譜柱（ 250mm×4.6mm ！ 5μm ）。流動相A為乙腈，流動相B為 0.1% 磷酸。洗脫方式：梯度洗脫。洗脫程序： 0～10min ， 10%20%A ； 10～ 11min ， 20%A ， 11～25min ， 20%30%A 。流速：1.0mLmin^-1 。柱溫： 35^°C 。檢測波長： 348nm 進樣量： 10μL 。在此條件下4種活性物質(zhì)的色譜圖見圖1。

圖14種活性物質(zhì)標準品的色譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1提取條件的優(yōu)化

考察供試樣品加熱回流和超聲提取兩種提取方式對目標物質(zhì)回收率的影響。結(jié)果顯示，兩種提取方式下無顯著性差異?？紤]到煎煮沖泡的方式較為常用，因此采用加熱回流方法進行提取。同時，考察樣品提取加熱回流的時間（15、30、 60min ）對回收率的影響，結(jié)果顯示 30min 回流提取充分，提取效率高，因此試驗供試品制樣選用 70% 甲醇為提取溶劑，回流 30min 。

2.2 線性關(guān)系

以系列標準溶液的濃度為橫坐標，以其對應的色譜峰峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。4種組分的線性方程、相關(guān)系數(shù)等見表1。4種組分在對應線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù) （r） 均大于0.998，滿足分析要求。

表14種活性物質(zhì)的線性方程

2.3 檢出限和定量限

根據(jù)3倍信噪比（ S/N=3 ）計算方法檢出限，根據(jù)10倍信噪比（ S/N=10 ）計算定量限。結(jié)果顯示，綠原酸的檢出限為 0.009 8μg?kg^-1 ，定量限為（204號 0.0195μg?kg^-1 ；木犀草苷的檢出限為 0.0082μg?kg^-1 ，定量限為 0.0165μg?kg^-1 ；異綠原酸B的檢出限為 ，定量限為 0.023 5μg?kg^-1 ；異綠原酸A的檢出限為 0.013 6μg?kg^-1 ，定量限為0.0273μg?kg^-1 。

2.4重復性試驗

取同一批菊花樣品，平行稱取6份，按1.3項方法制備，使用高效液相色譜儀進行分析，計算得到綠原酸含量的相對標準偏差為 4.6% 、木犀草昔為3.7% 、異綠原酸B為 3.2% 、異綠原酸A為 2.0% 表明方法重復性較好。

2.5 回收率和精密度試驗

精密稱取已知4種組分含量的菊花樣品，分別添加低、中、高3個水平的標準溶液進行加標回收實驗，每份樣品重復測定6次，計算加標回收率和相對標準偏差，結(jié)果見表2。加標回收率為85.50%～100.38% ，相對標準偏差為 1.3%～4.6% 符合相關(guān)要求。

表2加標回收實驗結(jié)果（ ?_n=6 0

2.6 實際樣品測定

取12批次菊花樣品檢測4種活性物質(zhì)的含量，結(jié)果見表3。綠原酸的含量為 0.304%～0.775% 、木犀草苷的含量為 0.089%～0.789% 、異綠原酸B的含量為 0.088%～ 0.341% 、異綠原酸A的含量為0.621%～1.981% 。其中，綠原酸在毫菊中含量最高（ 0.621% ），金絲皇菊中最低（ 0.304% ）；木犀草苷在金絲皇菊中最高（ 0.789% ），胎菊中最低（ 0.089% ）；異綠原酸B在杭菊在中最高（ 0.341% ），胎菊中最低（ 0.088% ）；異綠原酸A在毫菊中最高（ 1.981% ），胎菊中最低（ 0.621% ）。參考《中華人民共和國藥典（2020年版）》四部要求[10]，結(jié)果均合格。

表3樣品含量測定結(jié)果 單位：%

3結(jié)論

本文建立高效液相色譜法同時測定菊花中4種活性成分含量的方法。結(jié)果顯示，4種活性成分在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限、定量限、回收率及精密度均滿足要求。該方法簡單穩(wěn)定、結(jié)果準確，適用于菊花中綠原酸、木犀草苷、異綠原酸B和異綠原酸A的定量檢測。

參考文獻

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