基于高通量測序技術解析蘭州百合酒醪自然發酵過程中細菌菌群變化

Analysis of Bacterial Community Changes During Natural Fermentation ofLanzhou Lily Wine Mash Based on HighThroughput Sequencing Technology

YANG Taoliwei'， GU Chunhua2*， FAN Pengfei2， ZHU Shuqiang2， ZHU Yu2.3 （1.Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences of CAAS，Lanzhou 730ooo， China; 2.GansuProvincial Food Inspection Research Institute，Lanzhou 730oo， China; 3.Gansu Provincial Engineering TechnologyResearch Center for Nutrition and Safety Evaluation of Geographical Indication Products，Lanzhou 73ooo， China）

Abstract： This study employed for the first time high-throughput sequencing technology to analyze bacterialcommunity structure and dynamics of lanzhou lily wine fermentation mash during the fermentation process.Theresults revealed 8phyla，11classes，30orders，43 families and 52 genera from the fermentation mash samples.Threedominant bacterial phyla were found，namely Proteobacteria，Firmicutes，and Bacteroidetes.Firmicutes exhibitedhigher relative abundance in the prophase and metaphase，and wasconcentrated in the middle and lower layers ofthe fermentation mash.Proteobacteria also had higher relative abudance in the prophase and metaphase，but wasconcentrated in the middle and upper layers of the fermentation mash in the metaphase.Seven dominant bacterialgeneraweredid，lycocter，tobcillusssella，cia，ooccs，gtaebeClostridium sensu stricto. Among them， Lactobacilus and Acetobacter exhibited higher relative abudance during fermentation，and Lactobacilus relative abudance showed a consistently increasing trend.Pediococcus demonstrated higher relative abundance in the anaphase， while Weissell relative abudance showed a tendencyof first decreasing， followed by increasing and then decreasing during the fermentation process. β diversity analysis results show that significant diferences in the bacterial communities in both upper and middle layer mash samples by metaphase to anaphase compared to prophase.The lower layer mash samples presented significant diferences in bacterial communities in the prophase compared to the metaphaseand anaphase.This indicates thatthe similarityof bacterial communities in lily wine mash at diferent fermentation periods shows a phased characteristic.This study provides theoretical basis andnew insights for the researchoffermentationand metabolism mechanism of lilywine and strain screening.

Keywords： Lanzhou lily wine; high-throughput sequencing; bacterial community change

蘭州百合為我國地理標志產品[1，屬川百合的變種[2-3]。其主要產區位于平均海拔 2 000m 的七里河區西果園鎮，該產區具有光照充足、晝夜溫差較大、土層肥厚無污染等獨特的地理環境優勢。蘭州百合肉厚、色白香甜，富含碳水化合物、蛋白質、氨基酸、B族維生素、多種微量元素等營養物質，還含有秋水仙堿、總皂苷、黃酮、磷脂等多種活性成分[4-5]。百合為原衛生部首批批準的藥食同源植物[，具有止咳潤肺和抗腫瘤等功效[7-8]，2014年“蘭州百合”被原國家工商總局認定為“中國馳名商標”[9]，2020年被列為中歐地理標志協定保護清單，這是“蘭州百合”享譽全國、走向世界的重要名片。

蘭州百合酒是一種以蘭州百合為主要原料自然發酵釀造而成的百合深加工產品，該酒香氣清新雅致，酒體純凈爽口、風味獨特。目前，有關蘭州百合酒醪在自然發酵過程中細菌菌群結構分析的研究鮮見。大量研究表明，自然發酵過程中菌群的復雜多樣性對釀造產生積極作用[10-13]。楊旭及其團隊[14]在研究中揭示，大曲中的細菌菌群結構差異是造成白酒品質多樣化的主要因素之一。范錦琳等[15]對菌草酒發酵過程中細菌菌群變化的研究發現不同發酵時期細菌菌群相似度具有階段性。王春艷等[在研究中揭示，隨著窖齡時間的延長，宋河濃香型白酒中的細菌菌群結構愈發復雜。可見，對百合酒醪發酵過程中細菌菌群的研究具有現實意義。

在微生物的分類描述中，傳統研究方法多集中于傳統培養、菌落形態特征、培養特征及生理生化特征等方面。與傳統的研究方法相比，高通量測序技術具有顯著優勢，它能夠一次性對樣本中高至百萬條的DNA分子進行序列測定，從而實現對樣本中微生物種類及其豐度的高效、快速鑒定[17-19]。這一技術特性促使高通量測序技術在微生物多樣性研究領域的應用與發展持續深化，如濃香白酒[20]、豆豉[21]豆醬[22-23]、酸湯[24]、腐乳[25-26]以及傳統發酵食品中微生物群落宏基因組研究[19]等。因此，本研究采用高通量測序技術剖析自然發酵階段的百合酒gt;中的細菌群落組成，旨在為優化發酵條件、提升百合酒品質等提供科學依據，并為蘭州百合的深加工產品的開發和百合產業資源的綜合利用提供參考和思路。

1材料與方法

1.1材料與試劑

百合酒醪樣本均由甘肅龍飲生態科技有限責任公司提供；MagPureSoilDNALQKit（用于DNA提取），廣州美基生物科技有限公司；TksGflexDNAPolymerase（用于核酸擴增），TakaraBio株式會社；QubitdsDNAAssayKit（用于熒光定量），賽默飛世爾。

1.2 儀器與設備

5418高速臺式離心機，艾本德；580BR10905PCR儀，伯樂；HE120電泳儀，上海天能科技有限公司；2500凝膠成像儀，上海天能科技有限公司；MiseqPE250高通量測序儀，因美納；NanoDrop2000，賽默飛。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集

結合翻醪時間確定采樣時間，收集發酵7、10、19d和37d同批次發酵缸的上層、中層和低層百合酒醪，每個樣品設置3個重復，共計36個樣本，使用 50mL 離心管進行分裝，確保樣本完整無污染。取樣完成后置于 -80°C 冰箱保存。

1.3.2 DNA提取、PCR擴增及高通量測序

嚴格遵照試劑盒操作指南執行樣本基因組DNA的提取流程。通過分光光度儀及瓊脂糖凝膠電泳方法，對提取得到的DNA進行濃度與純度的評估。在確保DNA樣品質量達標后，將其置于 -20^°C 妥善保存。以提取的DNA作為模板，選擇附有Barcode的特異性引物與TakaraExTaq高保真酶，針對細菌16SrRNA基因實施聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction，PCR）擴增。在此過程中，使用通用引物343F（序列：5’-TACGGRAGGCAGCAG-3’）與798R（序列：5’-AGGGTATCTAATCCT-3’）對16SrRNA基因的 V3～V4 變異區域進行定點擴增，以進行細菌多樣性的分析。

PCR擴增后的產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，隨后利用AMPureXPbeads磁珠進行純化，以獲得的純化產物作為第二輪PCR的模板，執行二次擴增。二次擴增產生的產物同樣經過磁珠純化步驟，然后通過Qubit熒光定量儀進行精確的定量分析，并根據需要調整其濃度以進行測序操作。測序工作委托上海歐易生物技術有限公司采用IlluminaNovaSeq平臺開展。

1.3.3 數據分析

構建數據庫并進行測序及數據分析工作由上海歐易生物醫學科技有限公司執行。原始數據以FASTQ格式保存，使用Cutadapt軟件進行引物序列剪切，利用DADA2軟件基于QIIME2（2020.11）的默認設置，對經過初步篩選的雙端原始數據進行質量過濾、降噪、拼接以及去除嵌合體等質量控制分析步驟，最終生成擴增子序列變異（AmpliconSequenceVariant，ASV）的代表性序列和相應的豐度矩陣。

通過QIIME2軟件包篩選出各ASV的代表性序列，再與Silva138版數據庫進行比對注釋，采用執行q2-feature-classifier插件的默認參數對物種注釋分析。

采用QIIME2軟件進行 α_a ！ β 多樣性分析，利用chao1豐富度指數和shannon多樣性指數評估樣本的 α_a 多樣性。基于Bray-Curtis相異系數，通過非度量多維尺度分析（Non-metricMultidimensionalScaling，NMDS）揭示樣本間 β 多樣性差異，從而全面解析細菌群落結構特征。

2 結果與分析

2.1 a 多樣性分析

稀釋曲線用來評價試驗測序量是否足以覆蓋所有類群。若稀釋曲線走勢逐步趨于平緩，這表明當前的樣本采集量處于科學合理區間，測序數據量已充分覆蓋樣本中的物種[27]。百合酒醪在不同發酵時期及不同發酵部位樣品的稀釋曲線見圖1。由圖1可知，所有百合酒醪樣本（共計36個）的稀釋曲線末端均變平緩，表明測序深度較為理想。不同發酵階段和不同發酵位置的樣本測序數據量足夠，有效獲得并涵蓋了樣本內大多數微生物種類。通過對這些樣本進行分析，以微生物分類單元共注釋到8個門、11個綱、30個目、43個科以及52個屬。

圖1不同發酵部位在不同發酵時期的稀釋曲線

表1顯示，36個百合酒醪樣本文庫的覆蓋率均高于 99.98% ，這說明測序結果可以真實反映物種豐度和多樣性。由表1可知，自然發酵進程中，百合酒醪細菌菌群的 α_a 多樣性指數并非保持恒定，而是隨發酵時間持續呈現出動態起伏的變化態勢。隨著發酵的不斷進行，PDwholetree、chaol、shannon與simpson指數均呈現先降低后上升的趨勢，且上升后趨于穩定。在發酵的第10天，chao1指數達到最低值，這可能與發酵初期顯著升高的乙醇濃度有關，即在發酵10d時乙醇含量達到峰值，由于許多微生物對乙醇的耐受能力偏弱[28]，從而引起這些指標下降。而在發酵中后期（19d和37d時），chao1指數等呈現上升后趨于穩定，這表明樣本中部分微生物已逐漸適應發酵和生長環境，細菌菌群在不斷地進行調整和平衡。

表2顯示，在發酵中后期，百合酒醪上層、中層和下層中的PDwholetree、chaol、shannon和simpson指數整體依次為下層 gt; 中層 gt; 上層，而發酵前期（10d）則整體表現為中層 gt; 下層 gt; 上層，這說明在發酵過程中百合酒醪下層的細菌菌群豐富度和多樣性整體高于百合酒醪的中上層，且隨著發酵時間的延長趨勢越來越明顯。

2.2自然發酵過程中百合酒醪細菌菌群的結構分析

2.2.1 基于門水平的百合酒醪細菌菌群結構分析

從百合酒醪樣本中一共注釋到8個細菌門，由圖2可知，3個優勢菌門依次為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）以及擬桿菌門（Bacteroidetes）。且在門水平上，百合酒醪在不同的發酵階段展現出較為穩定的細菌群落結構。

百合酒醪不同部位中的厚壁菌門在發酵初期（7d）和中期的相對豐度較高，并且在酒醪中、下層的相對豐度高于上層。變形菌門在酒醪上層發酵初期和前期的相對豐度較高，而后隨著發酵進行整體呈現下降再上升的趨勢，在發酵中期下層的相對豐度最低。在發酵中期酒醪的上層、中層和下層中，該菌門相對豐度由高到低依次為上層（ 48.37% ）gt;中層（ 41.93% ） gt; 下層（ 9.86% ）。這說明變形菌門在發酵中期多集中在酵缸的中上層，這可能是由于變形菌門中一部分細菌為好氧菌，并且這些好氧菌對百合酒醪發酵過程中缺氧、產醇、產酸的環境耐受力較弱[19]，這或許也是導致發酵中期變形菌門平均相對豐度最低的原因。擬桿菌門相對豐度在發酵初期最高（ 0.27% ），伴隨發酵的進行小幅降低后趨于穩定。

圖2基于門水平不同發酵部位的樣本在發酵各時期的細菌菌群結構

門（Proteobacteria），其他門水平幾乎不顯示。

2.2.2 基于屬水平的百合酒醪細菌菌群結構分析

百合酒醪樣本中一共注釋到43個細菌屬。由圖3可知，7個優勢細菌屬（平均相對豐度 gt;1.00% ）分別為醋酸桿菌屬（Acetobacter）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、八疊球菌屬（Sarcina）、片球菌屬（Pediococcus）、駒形氏桿菌屬（Komagataeibacter）狹義梭菌屬（Clostridiumsensustricto）。在發酵過程中乳酸桿菌屬和醋酸桿菌屬相對豐度較高，與LIU等[29]對瀘香型酒醅在長期發酵過程中細菌菌群主要是乳酸桿菌和醋酸桿菌的研究結論一致。根據王海燕[3的研究，在發酵環境中乳酸菌展現出較強的適應性，在發酵過程中的主導地位尤為顯著。范錦琳等[15]研究發現菌草酒發酵過程中乳酸桿菌屬相對豐度在發酵中后期呈上升趨勢，王群[31研究發現乳酸桿菌屬在發酵中后期相對豐度較高，這些均與本研究結果一致。另有研究發現，乳酸桿菌屬對有機酸有一定的耐受力，它與乳酸乙酯的合成過程聯系極為密切。在糖類代謝過程，乳酸桿菌將糖類轉化為乳酸，再將以乳酸轉化得到的乙酸、丙酸、琥珀酸等其他種類的有機酸通過酯化反應生成乙酯類化合物[32]，這有利于發酵有益菌的生長，增加酒醪風味物質，還能減弱酵母菌的好氧代謝速度，延長發酵期[19]。李瑩瑩等[33]的研究揭示了乳酸桿菌在葡萄酒乳酸菌發酵劑中對風味形成的積極作用。張煜晨等[34進一步探討了乳酸菌對葡萄酒香氣成分的影響，結果表明乳酸菌能夠顯著提升香氣物質的含量和多樣性，從而為葡萄酒增添了果香和玫瑰香等風味特質。這些發現共同指向了乳酸桿菌屬在酒類發酵風味形成中的關鍵角色。隨著發酵進程的推進，酸度與乙醇濃度上升，而含氧量則下降，這導致部分乳酸菌的生長受到限制并逐漸衰亡。在此之后，更耐酸、耐受高濃度乙醇以及適應低含氧環境的乳酸菌接替完成發酵 [35]。

魏斯氏菌屬在發酵進程中整體呈先降低后升高再降低的趨勢，這與邱顯平等[3對濃香型白酒在新、老窖池發酵過程中酒醅微生物群落結構的差異分析一致。GAN等[7]研究發現，魏斯氏菌屬、片球菌屬和乳桿菌屬是白酒中的產酸微生物，可以為酯的形成提供重要前體物質，也有利于芳香醇的形成。研究表明，乳桿菌屬在發酵后期對細菌群落演替具有顯著主導作用[38]。具體而言，窖池發酵初期活躍的魏斯氏菌屬、片球菌屬以及某些乳桿菌屬菌株能夠迅速生成乳酸、乙酸等有機酸，導致發酵體系的pH值明顯降低，從而有效抑制雜菌的增殖。同時，產生的二氧化碳有助于保持厭氧環境的穩定[39]。這或許是屬于兼性厭氧菌的片球菌屬在發酵前期到中期相對豐度均較低，而到發酵末期相對豐度升高的原因。上述結果與范錦琳等[15]和邢敏鈺等[35]對不同酒醅發酵過程中細菌菌群變化的研究結論一致。

圖3基于屬水平不同發酵部位的樣本在發酵各時期的細菌菌群結構

各樣本色塊排布順序與右側圖例一致，其中當前數據柱最下方深色區域代表醋酸桿菌屬（Acetobacter），略淺色區域代表乳酸桿菌屬（Lactobacillus），其他屬水平依次按顏色區分。

2.3 β多樣性分析

利用β多樣性分析方法探究百合酒醪發酵過程中細菌群落組成差異，并采用Bray-Curtis距離算法對百合酒gt;樣本實施NMDS分析，以直觀展示樣本間微生物群落的差異程度。具體而言，樣本間的距離越顯著，代表該兩組樣本中的微生物群落結構差異越明顯。如圖4所示，通過對百合酒醪中細菌群落的測序結果的排序分析可知，得到的stress值均小于0.05，說明結果有代表性。從圖4（a）可知，上層百合酒醪樣本在發酵末期分布在獨立的象限，說明上層酒醪樣本中細菌群落至發酵后期產生明顯差異。圖4（b）顯示，中層百合酒醪樣本在發酵中期和末期分布在獨立的象限，說明中層酒醪樣本中后期細菌群落較其他時期具有明顯差異。圖4（c）顯示，下層百合酒醪樣本在發酵初期和中期均分布在獨立象限，說明下層酒醪樣本中細菌群落差異具有明顯的階段性。

圖4細菌群落NMDS分析

通過 a ！ β 多樣性分析發現這些差異來自于細菌群落相對豐度的變化，各階段的細菌群落相似程度并非恒定不變，而是隨著發酵的推進呈現出明顯的階段性特征。

3結論

采用高通量測序解析百合酒醪在自然發酵過程中細菌菌群結構，共注釋到8個門、11個綱、30個目、43個科和52個屬。優勢菌門有變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）。其中，厚壁菌門在發酵初期（7d）和中期（19d）不同部位的酒醪中均呈現較高的相對豐度，并在發酵各個時期均集中在酵缸的中下層。變形菌門在酒醪上層發酵初期（7d）和前期（10d）的相對豐度較高，而后隨著發酵進行整體呈現下降再上升的趨勢，在發酵中期（19d）集中在酵缸的中上層。

在屬水平上，優勢菌屬依次為醋酸桿菌屬（Acetobacter）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、八疊球菌屬（Sarcina）、片球菌屬（Pediococcus）、駒形氏桿菌屬（Komagataeibacter）、狹義梭菌屬（Clostridiumsensustricto）。乳酸桿菌屬和醋酸桿菌屬相對豐度較高，且乳酸桿菌屬相對豐度呈現持續上升的趨勢，片球菌屬在發酵前中期相對豐度較低而在發酵后期相對豐度較高，魏斯氏菌屬相對豐度在發酵進程中呈先降低后升高再降低的趨勢。八疊球菌屬、片球菌屬、駒形氏桿菌屬、狹義梭菌屬等菌種在其他酒糟的研究文獻中相對少見，這表明發酵原料、工藝、地理環境以及生產環境等其他因素會影響發酵酒醪中微生物的多樣性。

綜上，百合酒醪在自然發酵中各階段的細菌群落存在差異性，不同發酵時期百合酒醪中細菌菌群的相似性呈現階段性特征。本研究為深入探究百合酒醪的發酵代謝機理及篩選合適的菌株提供了一定科學依據，為實現百合酒的大規模、標準化生產提供了理論基礎。

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