高效液相色譜法測定口香糖維生素E方法的優化

Optimization of High Performance Liquid Chromatography for Determination of Vitamin E in Chewing Gum

CHEN Yongju （Guangzhou Inspection， Testing and Certification Group Co.，Ltd.， Guangzhou 511447， China）

Abstract： This article uses HPLC to determine the content of vitamin E in chewing gum，and studies the optimization of the detection method. Using a C₃₀ chromatographic column for separation， methanol water was used as the mobile phase， with a flow rate of 0.5mL?min^-1 and a column temperature of 25^°C .Fluorescence detection was performed at a wavelength of 294nm using an external standard method for quantitative analysis. The results showed thatvitamin E exhibited good linearity in the range of 0.25～10.00μg?mL^-1 ，with a correlation coefficient of R²gt;0.999 . The detection limit was 14.0μg/100g ， the quantification limit was 48.0μg/100g ， the recovery rate was between 86.6% and 101.2% ，and the relative standard deviation not exceed 4.96% . This method is simple to test， highly sensitive，and suitable for the determination of vitamin E in chewing gum.

Keywords： chewing gum; vitamin E; high performance liquid chromatography

維生素E主要有 a 1 β 、 γ 和δ這4種形式，在促進人體生長發育、增強機體免疫力等方面發揮著重要作用[1-3]。口香糖是一種休閑食品，在口香糖中添加維生素E，能夠賦予產品一定保健功能[4。高效液相色譜法檢測速度快、靈敏度高，在檢測食品中維生素E方面具有重要的應用價值[5-8]。但現有研究關于高效液相色譜法檢測口香糖中維生素E的研究較少?；诖?，本研究建立高效液相色譜法測定口香糖維生素E的檢測方法，為相關檢測工作提供技術支撐。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

1.1.1材料與試劑口香糖食品，市售商品；乙酸乙酯、正己烷、甲醇、乙醇均為色譜純，上海安譜公司； a- 生育酚、β- 生育酚、 γ- 生育酚、δ-生育酚標準品，純度均大于 95% ，美國Chromadex公司。

1.1.2 儀器與設備

Allegra64R型離心機，美國貝克曼庫爾特公司；AB104型電子天平（ 0.01g ），梅特勒公司；LC-20AD型高效液相色譜儀，日本島津公司；RF-20A型熒光檢測器，日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

分別稱取維生素E（ a- 生育酚、 β- 生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚） 20.0mg （精度至 0.1mg ），用無水乙醇溶解后轉移至 20mL 容量瓶中，定容至刻度，配成 1.0mg?mL^-1 的標準儲備液；分別量取維生素E標準儲備液 5.0mL ，將其轉移至 50mL 容量瓶中，定容至刻度，制備成 100μg?mL^-1 的標準中間液；分別量取0.25、0.50、1.00、2.00、 5.00mL 和10.00mL 的標準中間液，稀釋并定容至 100mL ，配制成 0.25，0.50，1.00，2.00，5.00μg?mL^-1 和10.00μg?mL^-1 的維生素E標準工作液。

1.2.2 樣品前處理

將口香糖試樣剪成細條狀，稱取 5g ，將其放人 50mL 離心管中，加入一定量的正己烷-乙酸乙酯混合溶液（體積比為 1：1 ），振蕩混勻 1min 超聲提取 25min ；提取后對溶液進行離心處理（ 3500r?min^-1 ， 5min ），取上層氮吹干，甲醇定容至 1mL ，溶液過 0.45μm 濾膜，用高效液相色譜儀檢測。

1.2.3 儀器條件

色譜柱：Inertsil C₃₀ （ 150mm×4.6mm ， 5μm ）；柱溫： 25^°C ；進樣量： 10μm ；流速： 0.5mL?min^-1 ；流動相：甲醇（流動相A）與純水（流動相B）的體積比為 9：1 ，等度洗脫；檢測波長： 294nm ；外標法定量。

1.3維生素E含量計算

樣品中維生素E含量參照陶文兵等[的方法進行計算。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 色譜柱的優化

由圖1可知， C₁₈ 色譜柱的分離效果不理想，不能實現 β- 維生素E和 γ- 維生素E基線分離； C₃₀ 色譜柱的分離效果較好。與 C₁₈ 色譜柱相比， C₃₀ 色譜柱鍵合的碳鏈更長，疏水性和親脂性更好，在分離維生素E這類非極性、脂溶性較強的化合物時分離效果更好。因此，本研究最終確定選用 C₃₀ 色譜柱。

圖1檢測色譜圖

2.1.2 檢測波長的優化

當激發波長設定為 294nm 、發射波長設定為325nm 時，維生素E能夠產生較強的熒光信號，明顯優于在傳統紫外檢測波長 294nm 條件下所獲得的信號響應，見圖2，該結果與相關文獻報道吻合[10]。基于此，本研究選用熒光檢測器法，波長為 294nm 。

2.2 樣品前處理的優化

2.2.1 提取試劑的優化

本研究對提取試劑進行優化，分別比較了乙醚、石油醚－乙醚（體積比為 和正己烷－乙酸乙酯（體積比為 1：1 ）這3種提取試劑的提取效果。結果表明，采用石油醚－乙醚（體積比為 1：2 ）為提取試劑， a- 生育酚、 β- 生育酚、 γ- 生育酚和8-生育酚回收率分別為 82.1% 小 83.5% ！ 84.7% 和81.6% ；采用正己烷-乙酸乙酯（體積比為 1：1 ）為提取劑時， a- 生育酚、 β_- 生育酚、 γ- 生育酚和8-生育酚回收率分別為 94.1% 、 92.3% 一 94.5% 和93.3% ；采用乙醚為提取試劑時， a- 生育酚、 β- 生育酚、 γ- 生育酚和8-生育酚回收率分別為 92.5% /93.7% 、 94.8% 和 95.6% 。由此可見，采用石油醚-乙醚（體積比為 1：2 ）為提取劑時，回收率最低，而分別采用乙醚和正己烷-乙酸乙酯混合液為提取劑時，回收率相差不大。考慮到乙醚溶劑的毒性較大，最終選擇正已烷-乙酸乙酯（體積比為 λ₁：1 ）為提取劑，在保證提取效果的同時，讓整個實驗過程更加環保。

2.2.2 提取時間的優化

本研究對提取時間進行優化，提取時間分別設定為5、10、15、20、 25min 和 30min ，重復測試3次，通過計算樣品回收率來確定提取效果。結果表明，在提取時間為 5～20min 時，樣品回收率為75%～85% ，在提取時間為 25min 和 30min 時，回收率均在 95% 以上，兩者相差不大，考慮到提取時間長，能耗高，本實驗確定最佳提取時間為 25min 。

2.3方法學考察

2.3.1線性范圍、檢出限和定量限

由表1可知，在 0.25～10.00μg?mL^-1 時，維生素E的線性關系良好，相關系數 R²gt;0.999 ，檢出限為 14.0μg/100g ，定量限為 48.0μg/100g 。

2.3.2 回收率和精密度

由表2可知，當添加水平為 40μg/l00g 時，維生素E回收率在 87.9%～ 101.2% ，相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）在 2.56%～3.09% ！當添加水平為 100μg/100g 時，維生素E回收率在 86.6%～ 100.3% ，RSD 在 2.10%～4.96% ；當添加水平為 200μg/100g 時，維生素E回收率在87.5%～ 100.6% ，RSD在 2.85%～ 4.07% ?？梢姡訕嘶厥章屎途芏攘己谩?/p>

圖2檢測色譜圖

2.4口香糖樣品測定

選擇市場上銷售的3種口香糖產品作為實際樣品，對每種樣品分別進行2次平行測定。由表3可知，測定結果與樣品標示值進行對比，相對偏差均低于5.10% ，表明本方法測量準確性好，可應用于口香糖樣品中維生素E的含量檢測。

表1維生素E的線性關系、檢出限和定量限

表3液相色譜法測定口香糖樣品中維生素E的結果

表2維生素E回收率和精密度 （n=6）

3結論

本文建立了一種液相色譜法測定口香糖中維生素E的檢測方法，對提取試劑、提取時間、色譜條件進行優化。采用正己烷-乙酸乙酯溶液（體積比為 1：1 ）為提取劑，避免了應用傳統的乙醚溶劑，提升了檢測過程的環保性。建立的方法線性關系較好，相關系數 R²gt;0.999 ，加標回收率在86.6%～101.2% ；檢出限為 14.0μg/100g ，定量限為 48.0μg/100g ： RSD?4.96% （ n=6 ），適用于檢測日?？谙闾菢悠分械木S生素 E 。

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