高效液相色譜法測(cè)定食品中酚類防腐劑與抗氧化劑

Determination of Phenolic Preservatives and Antioxidants in Food by High Performance Liquid Chromatography

ZHANGWei

（Tianjin Beichen District Center for Disease Control and Prevention （Tianjin Beichen District Health Supervision Institute）， Tianjin 300400， China）

Abstract： In order to establish an efcient and accurate detection method for phenolic preservatives and antioxidants infood，commercially available soybean oil is taken as thedetection object，five target compounds， namely dimethylfumarate，propylgallate，2，6-di-tert-butyl-p-methylphenol，tert-butyl-p-hydroxyphenolandtertbutylhydroquinone，are systematically detected by high performance liquid chromatography.The results show that the linear relationship of the target compound is good within the mass concentration range from 0.5mg^.L^-1 to 100.0mgL^-1 （correlation coefficient greater than O.996）， the minimum detection limit is from 0.3mgL^-1 to 1.5mgkg^-1 the spiked recovery rate is from 89.12% to 97.45% ，and the relative standard deviation is less than 6% . The actual sample test only detected trace amounts of 2，6-di-tert-butyl-p-methylphenol （0.18mg^.kg^-1 to 0.25mg^.kg^-1 ，which conformed to the national standard.This method isapplicable to the precisedeterminationof trace phenolic aditives in complex lipid matrices， providing reliable technical support for food safety supervision.

Keywords： high performance liquid chromatography; phenolic preservatives; antioxidant; soybean oil; solid phase extraction

食品添加劑的安全性一直是公眾極為關(guān)注的重點(diǎn)，其中酚類防腐劑、抗氧化劑在油脂制品中有著廣泛的應(yīng)用，目的是防止油脂制品出現(xiàn)氧化變質(zhì)。然而，過(guò)量使用或者違規(guī)使用這些物質(zhì)，會(huì)給人體健康帶來(lái)潛在的風(fēng)險(xiǎn)。因此，建立高效且準(zhǔn)確的食品中酚類防腐劑與抗氧化劑檢測(cè)方法至關(guān)重要[1]。高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）憑借其高靈敏度、良好的分離能力及穩(wěn)定性等特性，成為食品添加劑檢測(cè)領(lǐng)域的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)[2-4]。該研究以市售大豆油為對(duì)象，對(duì)HPLC在食品中酚類防腐劑及抗氧化劑檢測(cè)方面的應(yīng)用效果展開(kāi)系統(tǒng)性評(píng)估，以期為食品安全監(jiān)管提供可靠的技術(shù)支持。

測(cè)

1材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

大豆油，購(gòu)自某大型超市。

1.2儀器與試劑

高效液相色譜儀、高速離心機(jī)、去離子水發(fā)生器、電子天平（精度為 0.000lg ）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、超聲波清洗機(jī)及 C₁₈ 固相萃取柱等。

乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純），富馬酸二甲酯（DMF，純度 99.0% ）、沒(méi)食子酸丙酯（PG，純度 99.8% ）、2，6-二叔丁基對(duì)甲基苯酚（BHT，純度99.3% ）、叔丁基對(duì)羥基苯酚（BHA，純度 99.5% ）及叔丁基對(duì)苯二酚（TBHQ，純度 99.3% ）標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 制備標(biāo)準(zhǔn)溶液

準(zhǔn)確稱取DMF、PG、BHT、BHA及TBHQ標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈將其溶解后定容至 100mL ，配制 2000mg?L^-1 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液[5]。然后采用逐級(jí)稀釋的方法，用乙腈將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、 50.0mg?L^-1 和 100.0mg^-L-1 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，混合均勻后備用。

1.3.2 樣品預(yù)處理

精確稱取 0.1g 大豆油樣品，加入 10mL 乙腈渦旋振蕩 2min ，隨后超聲提取 30min ，之后離心，取上層清液[。然后用 C₁₈ 固相萃取柱進(jìn)行凈化處理（依次用 5mL 甲醇、 5mL 水活化），用 15mL 甲醇洗脫。將收集的洗脫液于 40°C 旋蒸近干，再用乙腈定容至2mL ，最后過(guò) 0.22μm 濾膜，以待檢測(cè)。

1.3.3 液相色譜條件

選用 C₁₈ 固相萃取柱（ 250mm×4.6mm ， 5μm ），柱溫設(shè)定為 35°C ，檢測(cè)波長(zhǎng)確定為 230nm ，進(jìn)樣量為 10μL ，流動(dòng)相采用水和甲醇，進(jìn)行梯度洗脫，初始時(shí)甲醇占比 50% ，在 5min 內(nèi)甲醇占比升至 90% ， 6min 時(shí)切換至 100% ！ 8min 時(shí)恢復(fù)到初始條件，流速為 1.0mL?min^-1[7] 。分析時(shí)間為15min ，在此期間目標(biāo)物實(shí)現(xiàn)了良好的分離效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 凈化效果

對(duì)比經(jīng)過(guò) C₁₈ 固相萃取柱處理和不經(jīng)過(guò) C₁₈ 固相萃取柱處理的色譜相對(duì)響應(yīng)度變化，評(píng)估 C₁₈ 固相萃取柱對(duì)大豆油基質(zhì)的凈化效果，結(jié)果見(jiàn)表1。

從表1可以看出，當(dāng)保留時(shí)間處于 0～34min 時(shí)，經(jīng)過(guò) C₁₈ 固相萃取柱處理的色譜相對(duì)響應(yīng)度比未經(jīng)過(guò) C₁₈ 固相萃取柱處理的色譜相對(duì)響應(yīng)度高。其中，保留時(shí)間為 6min 時(shí)，經(jīng)過(guò) C₁₈ 固相萃取柱處理的色譜相對(duì)響應(yīng)度為 91.4% ，而未經(jīng)過(guò) C₁₈ 固相萃取柱處理的僅為 33.5% ；保留時(shí)間為 20min 時(shí)，經(jīng)過(guò) C₁₈ 固相萃取柱處理的色譜相對(duì)響應(yīng)度為 99.1% ，而未經(jīng)過(guò)C₁₈ 固相萃取柱處理的為 98.3% 。這表明 C₁₈ 固相萃取柱可有效去除大豆油中的干擾物質(zhì)，提高目標(biāo)化合物的檢測(cè)靈敏度。

表1結(jié)果顯示，當(dāng)保留時(shí)間較短（ 0～10min ）時(shí)，未經(jīng)過(guò) C₁₈ 固相萃取柱處理的色譜相對(duì)響應(yīng)度較低，可能歸因于油脂等干擾物質(zhì)的存在抑制了目標(biāo)化合物的信號(hào)，而經(jīng)過(guò) C₁₈ 固相萃取柱處理之后，這些干擾物質(zhì)被有效去除，目標(biāo)化合物的響應(yīng)度有所提升。保留時(shí)間較長(zhǎng)（ 12～34min ）時(shí)，經(jīng)過(guò) C₁₈ 固相萃取柱處理的色譜相對(duì)響應(yīng)度接近 100% ，凈化過(guò)程對(duì)自標(biāo)化合物的回收率影響不大，并且可有效減少背景干擾。

表1凈化處理對(duì)色譜相對(duì)響應(yīng)度的影響

2.2 線性范圍和檢出限

本研究通過(guò)配制 0.5～100.0mg?L^-1 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，建立各目標(biāo)物質(zhì)的校準(zhǔn)曲線，并采用信噪比法（ S/N=3 ）確定檢出限，結(jié)果如表2所示。各目標(biāo)物質(zhì)在質(zhì)量濃度為 0.5～100.0mg?L^-1 時(shí)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99；各目標(biāo)物質(zhì)的回歸方程斜率數(shù)值較高，表明檢測(cè)方法對(duì)目標(biāo)物質(zhì)有靈敏的響應(yīng)能力。各物質(zhì)的最低檢出限處于 0.3～ 1.5mg^.kg^-1 ，可滿足實(shí)際檢測(cè)需求。其中，DMF的最低檢出限處于最低水平，為 0.3mg^.kg^-1 ；PG的最低檢出限略高一些，為 1.5mg^.kg^-1 ，這可能與其自身的分子結(jié)構(gòu)及響應(yīng)特性有關(guān)。

2.3 回收率和精密度

選取空白大豆油樣品，分別添加5、50、100mg?kg^-1 的DMF、PG、BHT、BHA及TBHQ混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，開(kāi)展加標(biāo)回收試驗(yàn)評(píng)估不同加標(biāo)水平下目標(biāo)化合物的回收率和檢測(cè)方法的精密度，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次，結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，各目標(biāo)化合物的平均回收率為 89.12%～97.45% ，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 2.83%～5.67% ，表明本文方法有較高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。其中，PG的平均回收率最高，達(dá)到了 97.45% ，這可能與其在乙晴中有良好的溶解性相關(guān)；BHA的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差略高，為 5.67% ，這可能與樣品基質(zhì)中油脂的干擾存在關(guān)聯(lián)，但仍處于可接受范圍之內(nèi)。

所有目標(biāo)物質(zhì)在不同加標(biāo)水平下的回收率都接近 100% ，并且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于 6% ，符合國(guó)際通行的檢測(cè)方法驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)（如美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)要求回收率為 80%～120% ，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10% ）。這充分說(shuō)明本文方法的樣品前處理步驟對(duì)于目標(biāo)物質(zhì)造成的損失較小，同時(shí)高效液相色譜條件具有良好的穩(wěn)定性，適合用于復(fù)雜食品基質(zhì)中痕量防腐劑及抗氧化劑的定量分析。

2.4準(zhǔn)確度

挑選未添加防腐劑及抗氧化劑的空白大豆油，加人 20.0mg?L^-1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 1.0mL ，分別采用國(guó)標(biāo)法［《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中9種抗氧化劑的測(cè)定》（GB5009.32—2016）]及本文方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，本文方法的測(cè)定結(jié)果與國(guó)標(biāo)法相近，相對(duì)偏差為 2.1%～4.3% ，顯示兩種方法具有良好的一致性。

表2各目標(biāo)物質(zhì)的線性方程、相關(guān)系數(shù)及最低檢出限

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本文方法檢測(cè)3個(gè)市售大豆油樣品，結(jié)果如表5所示。結(jié)果表明，只有1#和3#樣品檢測(cè)出了BHT，其檢出量分別為0.18、 0.25mg^.kg^-1 ，遠(yuǎn)低于《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB2760—2014）中規(guī)定的BHT在油脂中的最大允許限量（ 200mg?kg^-1 ）[8-9]，其余目標(biāo)化合物（DMF、PG、BHA、TBHQ）均未檢出。這表明當(dāng)前大豆油生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)于防腐劑和抗氧化劑的使用是比較規(guī)范的。

表4本文方法與國(guó)標(biāo)法測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度比較

BHT的檢出源于其在油脂加工過(guò)程中較為常用，但是其檢出量遠(yuǎn)低于安全限值，消費(fèi)者不必為此擔(dān)心。其他目標(biāo)物質(zhì)未檢出，可能與生產(chǎn)商逐漸淘汰高風(fēng)險(xiǎn)添加劑有關(guān)。

3結(jié)論

本文建立了高效液相色譜法檢測(cè)大豆油中酚類防腐劑與抗氧化劑的分析方法。結(jié)果表明，該方法具有良好的線性關(guān)系，檢出限較低，回收率較高，可有效克服復(fù)雜基質(zhì)所帶來(lái)的干擾。市售大豆油中目標(biāo)添加劑的質(zhì)量濃度符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，安全性良好。該方法能夠?yàn)槭称诽砑觿┑谋O(jiān)管提供可靠的技術(shù)支撐，在未來(lái)可推廣到其他油脂或者復(fù)雜食品基質(zhì)的檢測(cè)當(dāng)中，為保障食品安全發(fā)揮積極作用。

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