基于CarbonS技術的UPLC-MS/MS法測定藥酒中3種茛烷類生物堿

Determination of Three Hyoscypane Alkaloids in Medicinal Wine by UPLC-MS/MS Method Based on Carbon S Technology

ZHONG Xue，MENG Chunyang， WU Yutian， ZHOU Yibing，LIN Ye， ZOU Lu* （Guizhou Provincial Center for Disease Control and Prevention， Guiyang 55ooo4， China） Abstract： Objective： To establish a rapid method for the detection of three types of hyoscypane alkaloids in medicinal wine.Method： The samples were extracted with acetonitrile and purified with Carbon S adsorbent.The mobile phase was methanol-5 mmol L^-1 ammonium formate （containing 0.1% formic acid），and the detection was caried out in the multi-reaction monitoring positive ion mode.Result： The three kinds of hyoscypane alkaloids had a good linear relationship in the range of 2.0μg?L^-1 to 100.0μg?L^-1， and the correlation coefficient was greater than 0.999; the detection limit was 0.10μg?L^-1 to 0.25μg?L^-1 ，and the quantification limit was 0.25μg?L^-1 to 1.00μg?L^-1 the recovery rate of standard addition was 70.23% to 90.10% ，and the relative standard deviation was 1.71% to 7.44% Conclusion： This method is simple and accurate，and can be used for the rapid analysis of hyoscypane alkaloids in medicinal wine.

Keywords： hyoscypane alkaloids; medicinal liquor; Carbon S

茛蓉堿是一類廣泛存在于茄科植物中的酯類化合物[]，多存在于曼陀羅屬植物如洋金花中[2]。茛蓉堿主要的毒性成分為阿托品、東茛若堿和山茛蓉堿。近年來，茛蓉堿中毒的事件時有發生[3-4]，其中重度中毒可能導致嚴重的神經系統抑制、呼吸抑制、心律失常和昏迷甚至死亡。洋金花、曼陀羅等含有茛蓉堿的植物常被泡入酒中作藥酒飲用，由于部分人群對中草藥的認知有限，誤將有毒植物當作藥材泡酒，導致中毒事件頻發。因此，對藥酒中阿托品、東茛蓉堿和山茛瑩堿進行檢測，可以及時發現潛在的安全問題。

目前，藥酒中茛榮烷類生物堿的前處理方法多采用直接稀釋[5-7]、QuEChERS法[8]。藥酒中含有色素干擾，直接稀釋對色素等雜質去除效果較差，QuEChERS法采用N-丙基乙二胺（N-PropylsulfonicAcid，PSA）和硫酸鎂（ MgSO₄ ）進行凈化，對色素的去除效果有限。CarbonS是一種新型凈化劑，能在促進色素吸附的同時提高疏水性化合物的回收率，在不影響茛蓉堿回收率的情況下可提供高效的基質凈化效果。此外，超高效液相色譜-串聯質譜聯用技術（Ultra Performance Liquid Chromatography-TandemMassSpectrometry，UPLC-MS/MS）在各種基質的生物堿檢測中應用廣泛，可以快速、準確地檢測樣品中茛蓉烷類生物堿的含量。

基于此，本文提出采用CarbonS凈化結合QuEChERS法進行前處理，UPLC-MS/MS法檢測藥酒中阿托品、東茛蓉堿和山茛蓉堿，以期為快速鑒定茛蓉堿提供高效、準確的篩查方法。

1材料與方法

1.1材料與試劑

國公酒、中華跌打酒、風濕跌打藥酒，市售。

阿托品、山茛蓉堿、東茛蓉堿標準品，上海安譜璀世標準技術服務有限公司；甲酸（色譜純），阿拉丁公司；CNWBONDPSA填料，上海安譜實驗科技股份有限公司；CarbonS，美國安捷倫公司。

1.2儀器與設備

Agilent1290InfinityI超高效液相色譜儀、Agilent6470三重四極桿串聯質譜儀，美國Agilent公司；N-EVAP氮吹儀，上海安普科技有限公司；3-30KS高速離心機，德國賽多利斯公司。

1.3樣品前處理

移取 2.0mL 試樣于離心管中，加入 8mL 乙腈，混勻，加入 0.2gNaCl ， 0.2gMgSO₄ ，渦旋5min ，高速離心，取上層有機相于 10mL 容量瓶中，乙腈定容，轉移至離心管中，加入 0.2g PSA， 0.3g Carbon S、 0.2gMgSO₄ ，渦旋 2min ，高速離心，取上清液 5mL 進行氮吹至近干，殘渣用 1.0mL 初始流動相復溶，過 0.22μm 濾膜，供UPLC-MS/MS測定。

1.4標準溶液的配制

分別稱取 10.42mg 阿托品、 20mg 山茛蓉堿、20mg 東茛蓉堿于 10mL 容量瓶中，使用乙腈溶液定容至刻度，得到濃度為 1.042mg?mL^-1 的阿托品、 2.0mg?mL^-1 的山茛蓉堿和 2.0mg?mL^-1 的東茛榮堿標準儲備液。用初始流動相逐步稀釋至濃度為200ng?mL^-1 的混合標準使用液。取不同體積的混合標準使用液，加入 500μL 基質空白溶液，配制成濃度分別為 2.0，5.0，10.0，20.0，40.0，60.0，80.0ngmL^-1 和 100.0ng?mL^-1 的系列標準溶液。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件

Thermo Hypersil GOLD色譜柱（ 100mm×2.1mm 1.9μm ）；流速： 0.25mL?min^-1 ；進樣量： 5μL ；柱溫： 35^°C ；流動相A濃度為 5mmol?L^-1 的甲酸銨（含0.1% 甲酸），流動相B為甲醇。梯度洗脫程序： 0～ 1.0min ， 10%B . 1.0～9.0min ， 10%70%B ： 9.0～ 10.0min ， 70%B ； 10.0～11.0min ， 70%10%B ：11.0～13.0min ， 10%B 。

1.5.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源正離子模式（ ESI⁺ ）；脫溶劑溫度： 300^°C ；毛細管電壓： 4000V ；鞘氣流速：11Lmin^-1 ；噴霧器壓力：45psi（ 310kPa ；鞘氣溫度：250°C ；掃描模式：多反應監測（MultipleReactionMonitoring，MRM）模式。質譜參數見表1。

1.6 基質效應

基質效應（MatrixEffect，ME）計算公式為

式中： ME 為基質效應， 0% ： B 為基質匹配標準曲線斜率； A 為純溶劑標準曲線斜率。通常，|ME|?20.0% 時，基質效應可忽略不計； 20.0%lt; |ME|?50.0% 時，表明基質效應較弱； |ME|gt;50.0% 時，表明有強基質干擾。

2 結果與分析

2.1 前處理條件的優化

2.1.1 提取條件優化

QuEChERS法常用提取試劑為乙腈，常用鹽析劑為 MgSO₄ 、 NaCl 。 MgSO₄ 的作用是結合體系中的水分； ΔNaCl 可以促進相分離，使待測生物堿在樣品中發生液液分配。本文采用乙腈提取，考察 MgSO₄ 與 NaCl 加人量對生物堿提取效率的影響。結果表明，MgSO₄ 與 NaCl 加入量均為 0.2g ，質量比為 1：1 時，提取效率最好，均大于 80% 。

表1質譜參數

注： * 為定量離子。

2.1.2 凈化方式的優化

藥酒基質復雜，若直接進樣干擾較大，且影響色譜柱的壽命，需加入合適的吸附劑進行凈化。PSA可有效吸附酚類、糖類、有機酸等。藥酒中的色素會干擾檢測結果，而CarbonS具有較強的色素去除能力， MgSO₄ 可進一步除去水分，利于后續濃縮。本研究將PSA與CarbonS作為吸附劑， MgSO₄ 為干燥劑，對PSA和CarbonS設置不同的比例，研究其對回收率的影響情況，結果見圖1。CarbonS與PSA加入量分別為 0.1g 和 0.2g （質量比為 1：2 時，回收率（均大于 80% ）相對較高。

圖1加入不同比例的PSA和CarbonS的生物堿回收率

2.1.3 基質效應

根據1.6評判基質效應，得到阿托品、山茛若堿、東茛榮堿ME值分別為 -42.22% 、 -40.44% 、 -41.76% 均有基質干擾。因此，本文采用基質匹配標準曲線來減少基質效應的影響。

2.2 色譜及質譜條件的優化

2.2.1 質譜條件優化

由于阿托品、山茛蓉堿和東茛蓉堿的化學結構帶有氨基基團，正離子模式下易生成 [M+H]⁺ 峰。Q1掃描模式下，可以觀察并鑒別出明顯高于背景噪音的母離子。之后進行子離子掃描，選取兩個豐度較高的碎片離子，其中豐度最高的碎片離子作為定量離子，另一離子為定性離子。在此基礎上優化碎裂電壓和碰撞電壓等參數，以獲得最佳的質譜條件，確保特征離子對的比例和相對豐度效果達到最佳，優化后的質譜條件見表1。

2.2.2 色譜條件優化

通過對比發現，當流動相A選用 0.1% 甲酸水時，色譜峰會拖尾，加入甲酸銨可提高各目標物的離子化效率；流動相B若選用乙腈作為有機相，峰形存在分叉和拖尾現象。此外，對比不同色譜柱的分離效果。使用BEHHILIC色譜柱時柱效較低，分離度較差，存在相互串擾；采用HSST3色譜柱時，東茛蓉堿和山茛蓉堿響應較低，分離度較差。使用ThermoHypersilGOLD色譜柱時，阿托品、山茛蓉堿和東茛蓉堿峰形對稱、響應值較高和分離度較好，無串擾。因此，選用ThermoHypersilGOLD色譜柱，甲醇-5mmol?L^-1 甲酸銨溶液（含 0.1% 甲酸）為流動相，山茛蓉堿、東茛蓉堿、阿托品的保留時間分別為4.305、4.376、 5.780min （圖2）

2.3線性方程、檢出限和定量限

以系列標準溶液的濃度為橫坐標，以其對應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。以3倍信噪比（SN=3）對應的濃度為檢出限，以10倍信噪比（ S/N=10 ）對應的濃度為定量限，得到線性方程、相關系數、檢出限和定量限結果如表2所示。3種生物堿在 2.0～100.0μg?L^-1 線性關系良好，相關系數均大于 0.999 。檢出限在 0.10～0.25μg?L^-1 ，定量限在0.25～1.00μg?L^-1 ，可滿足檢測要求。

2.4加標回收率與精密度

在 2.0mL 藥酒空白樣品中分別加入10、40、80μg?L^-1 這3個濃度水平的標準溶液，進行6次平行試驗，計算加標回收率與相對標準偏差，結果見表3。藥酒中3種茛旁堿的加標回收率在 70.23% ～90.10% ，相對標準偏差在 1.71%～6.59% ，表明具有較好的回收率和精密度。

表23種生物堿的線性方程、檢出限和定量限

2.5 實際樣品測定

對藥店中隨機購買的3批次不同生產廠家藥酒進行檢測，均未檢出阿托品、山茛蓉堿和東茛蓉堿。

3結論

本研究采用以CarbonS凈化的QuEChERS前處理方法，并結合UPLC-MS/MS技術，成功實現了對藥酒中阿托品、山茛蓉堿和東茛夢堿的準確測定。該方法具有較高的準確性、靈敏度，能夠滿足藥酒中3種茛蓉烷類生物堿定性、定量分析的要求，可用于藥酒中茛旁烷類生物堿的快速分析。

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