右美托咪定調控自噬-ROS-NLRP3途徑對大鼠腦缺血再灌注損傷保護作用的機制研究

TheMechanismofDexmedetomidineRegulatingAutophagyROS-NLRP3PathwayinProtectingAgainstCerebrallschemia-reperusion InjuryinRats

LIUKai，WANG Zhen

ZhumadianCentral Hospital，Zhumadian463ooo，Henan，China CorrespondingAuthor WANG Zhen，E-mail：wzake 1979@ 163.com

AbstractObjective：Toexploretheefectsandmechanismsofdexmedetomidine（DEX）oncerebralischemia-reperfusioninjury（CRl）in rats.Methods：OnehundredSDrats wererandomlydividedintotheshamoperation（Sham）group，theCIRlgroup，theautophagyinducer （RAPA）groupandtheDEX十autophagyinibitor（3-MA）group，with20ratsineachgroup.ExceptfortheShamgroup，theothergroupsof ratsweretreatedwithwirecampingmethodtostablishtheatmodelofmidlecerebralarteryCDuringreperfusionatsineEX groupwere intraperitoneallyinjected with 100μg/κg DEX immediately，rats in the RAPA group were intraperitoneally injected with1 mg/kg RAPAimmediately，and ratsin the DEX + 3-MAgroupwereintraperitoneallyinjectedwith 100μg/kg DEX and 15mg/kg 3-MA immediatelyRatsintheShamandCIlgroupswereitraperitonealynjectedwiththesamevolumeofnoralsaline.Twentyfourours afterreperfusion，theneurologicalfunctionimpairmentscoresoftheratsineachgroupwereevaluatedTecerebralinfarctionatewere detectedbythe2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride（TC）method.Themorphologicalstructureofbaintisuewasobservatedby hematoxylineosnHE）staining.erinaldeoxyribonucleotidyltransferase（TdmediateddUTPickendlabeling（TUNEL）staininga observatedfordetectingneuronalcellapoptosis.AutophagosomechangeswasobservatedbytransmissionelectronmicroscopyC3 proteinexpressoninneuronsasanalysedbyimmunofluorescencemethodWesteBlotwasusedtodetecttheexpressonof3and NOD-ikereceptorprotein3（NLRP3）inflammasome-relatedproteinsinbraintisue.ThelevelofreactiveoxygenspeciesROS）inbrain tissuewasdetectedbythefluorescencemethodofdiydroethidium（DHE）Results：ComparedwiththeShamgroupthebraintisueofrats intheCIRl groupshowedobviouspathologicaldamage，thescoresofeuroogicalfunctionimpaiment，thevolumeofcerebralinfarction， andtherateofneuronalcellapoptosisincreased Plt;0.05） ;thenumberof neuronal cellautophagosomes，thepositiveexpressionrateof LC3，the ratioof LC3-I/LC3-I inbrain tissue，the expressionsof NLRP3，ASC，Caspase-1，interleukin（IL） ^-1β ，IL-18 proteins，and the ROS level upregulated （Plt;0.05） .Compared with the CIRl group，the brain tissue pathological damage in the DEX group and the RAPA groupalviatedndtosofrologicalfunctiotefrebalinfarctiondtateofuroalctosis decreased Plt;0.05） ;thenumberofneuronalcellautophagosomes，thepositiveexpressionrateofLC3，andtheratioofLC3-II/C3-Iin braintissue increased Plt;0.05） ;theproteinexpressionsofNRP3，ASC，Caspase-1，I-1β，I-18and theROS level decreased Plt;0.05） Compared withthe DEX group，the DEX+3-MA group were able to inhibit techangesin CIRIrat indicators caused by DEX （Plt;0.05） ， andreversetheprotectiveefectofDEXonCIRl.Conclusion：DEXcanimprovetheneurologicalfunctioninCIRlrats.Themechanismis related to inducing neuronal autophagy，reducing ROS levels，and inhibiting the activation of NLRP3 inflammasome.

rordscerebralischemia-reperfusion injury;dexmetomidine;autophagy;NODlikereceptorprotein 3;experimental st

缺血性腦卒中是一種由于腦血管損傷導致血流中斷進而引起腦組織出現缺血缺氧性改變、壞死等為主要特征的急性腦血管疾病，具有嚴重致殘、致死等特性[。目前，缺血性腦卒中治療主要有靜脈溶栓、取栓及放置支架等方式，恢復血液灌流，但是在恢復血液灌流的同時會導致血腦屏障的破壞，誘導活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）的產生增加，從而加重腦組織損傷，這一過程為腦缺血再灌注損傷（cerebralischemia-reperfusioninjury，CIRI）[2]。多項研究已證實，氧化應激、炎癥反應以及細胞自噬等參與CIRI所致的神經元損傷[35]，因此深入闡釋CIRI病理過程的分子機制將有助于臨床治療藥物的應用。

自噬是細胞抵抗外界危險因素的一種適應性保護機制，能夠通過清理受損的細胞器、異常蛋白質及病原微生物等，進而發揮自身功能調節作用。既往研究證實細胞自噬在CIRI中發揮重要作用，通過調節細胞自噬水平能夠改善CIRI神經元損傷[6。因此，自噬被認為是CIRI核心調節機制，已成為該領域研究的熱點與難點。但是以往研究有關細胞自噬在CIRI中的可能表現出相反的作用效果。在大鼠CIRI模型中細胞自噬被顯著激活，而通過特異性抑制自噬則會加重CIRI神經元損傷，誘導細胞自噬水平增強則能夠減輕CIRI神經元損傷，提示自噬在CIRI病理過程中可能發揮保護作用[78]。相反，也有研究發現，抑制自噬水平能夠減輕CIRI神經元損傷，誘導自噬則會加重CIRI神經元損傷，表明自噬在CIRI過程中可能是一種損傷因素[9-10]。雖然在既往研究中有關自噬與CIRI的關系可能存在一定的爭議，但是通過適當調節自噬水平與改善CIRI神經元損傷密切相關。研究顯示，ROS-NOD樣受體蛋白3（NOD like receptor protein 3，NLRP3）通路在CIRI神經元損傷中具有關鍵調控作用[\"]。分子機制研究表明，自噬可以通過清除ROS蓄積負向調控該通路激活，進而干預缺血性神經損傷的病理進程[12-13]。補娟等[14]研究發現，刺槐素能夠通過自噬途徑抑制ROS/NLRP3信號通路發揮CIRI保護作用。以上研究表明，自噬-ROS-NLRP3炎癥小體在CIRI發生發展中發揮重要作用。因此，靶向調控自噬ROS-NLRP3信號軸可為CIRI的精準治療策略提供新范式，其機制研究將推動神經保護藥物的靶點篩選與給藥方案優化。

右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）作為高選擇性α2腎上腺素能受體激動劑，除具有鎮靜鎮痛作用外，還可通過拮抗炎性級聯反應與氧化應激損傷，發揮CIRI神經保護效應[15-16]，但是有關DEX能否通過調控自噬-ROS-NLRP3炎癥小體發揮CIRI神經保護作用尚未明確。為此。本研究擬通過線栓法構建大鼠大腦中動脈CIRI模型，基于自噬-ROSNLRP3信號軸揭示DEX減輕CIRI神經元損傷的分子機制，不僅為闡明其神經保護效應提供理論支撐，更為缺血性腦卒中臨床轉化研究奠定關鍵藥理學基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 動物

無特定病原體（SPF）級SpragueDawley雄性大鼠100只，周齡 6～8 周，體質量 200±10）g 。實驗動物采購自上海斯萊克實驗動物中心[SCXK（滬）20220016]。實驗動物于屏障環境（清潔級）內獨立通風籠具系統飼養，環境參數：溫度調控（ 25±2）^°C ，相對濕度50%～65% ， 12h/12h 明暗周期，自由攝食飲水條件下完成7d環境適應性喂養。本實驗方案嚴格遵循動物實驗3R原則，且通過駐馬店市中心醫院倫理委員會審批（批準號：202305019）。

1.1.2 藥品與主要試劑

DEX注射液（揚子江藥業集團有限公司，國藥準字H20183219）；戊巴比妥鈉（德國Merck公司，貨號：4390-16-3）；2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）試劑（武漢華翔科潔生物技術有限公司，貨號：298-96-4）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、DNA斷裂的原位末端標記（TUNEL）染色檢測試劑盒、蛋白質濃度檢測試劑盒、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗、顯影液、β-actin抗體均購自碧云天生物技術有限公司（貨號：C0105S、C1082、P0011、A0208、A0216、P0018S、AF0003）;3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3MA）、雷帕霉素（rapamycin，RAPA）（美國Sigma公司，批號：5142-23-4、S015）；二氫乙錠（dihydroethidium，DHE）（美國ThermoFisherScientific公司，貨號：D11347）；微管相關蛋白輕鏈3（LC3）抗體、神經元核抗原（NeuN）抗體、NLRP3抗體、細胞凋亡相關的斑點樣蛋白（apoptosis-associatedspeck-likeprotein，ASC）抗體、Caspase-1抗體、白細胞介素（IL）-1β抗體、IL-18抗體均購自美國CellSignalingTechnology公司（貨號：4108、24307、15101、67824、83383、12242、57058）。

1.1.3 主要儀器

倒置相差顯微鏡（北京瑞科中儀科技有限公司，型號：IX73）；熒光顯微鏡（日本Olympus公司，型號：BX43）；多功能酶標儀（山東藍虹光電科技有限公司，型號：YT-MB96A）；高速離心機（深圳市瑞沃德生命科技，型號：M1324-M1324R）；凝膠電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號：DYCZ-24K；凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司，型號：Gel doxXR）。

1.2 方法

1.2.1 CIRI大鼠模型的構建、分組及給藥

采用線栓法構建SD大鼠大腦中動脈閉塞（middlecerebralarteryocclusion，MCAO）模型模擬CIRl。通過阻斷大腦中動脈血流2h（缺血期）后實施再灌注 Zea-Longa評分 1～3 分為造模成功。將100只SD大鼠按照隨機數字表法分為Sham組、CIRI組、DEX組、RAPA組及 DEX+3-MA 組，每組20只。Sham組僅暴露血管；CIRI組建立MCAO模型；DEX組、RAPA組在再灌注時分別即刻腹腔注射 100μg/μgDEX^[17] 1mg/kg RAPA[18]; DEX+3?MA 組在再灌注時即刻腹腔注射DEX 100μg/κg 和3-MA 15mg/kg^[18] ; Sham 組與CIRI組腹腔注射等體積生理鹽水。術后 經戊巴比妥鈉 30mg/kg） 麻醉后，實施心臟采血并取腦組織樣本。

1.2.2 神經功能缺失評分

分組干預后，每組20只大鼠均采取Zea-Longa評分法[對其神經功能缺損進行評分，分值越高表示大鼠神經功能缺損越嚴重。

1.2.3 腦梗死體積百分比測定

各組大鼠于再灌注24h后頸椎脫白處死，取腦組織。每組選取6只大鼠腦組織，冰凍 20min ，制備每間隔 2mm 的冠狀面連續切片，共5個層面。將切片放置于 2% TTC溶液中固定 ，并拍照。采取ImageProPlus6.0分析軟件測定腦組織梗死體積比率。腦梗死體積百分比 （%）= 白色梗死體積/全腦體積 ×100% 。

1.2.4腦組織病理形態觀察

每組選取6只大鼠腦組織，腦組織樣本經 10% 多聚甲醛固定后，依次進行梯度脫水、二甲苯透明化處理及石蠟包埋。采用切片機將包埋樣本制備成 3～5μm 厚切片，經HE染色標準流程處理并封固后，使用光學顯微鏡觀察神經組織病理形態特征。

1.2.5 神經元細胞凋亡檢測

石蠟切片制備流程參照HE染色方法，分別采用TUNEL法檢測細胞凋亡和NeuN免疫熒光標記神經元。按試劑盒規范完成TUNEL染色后，采用熒光顯微鏡 （×400 系統性隨機捕獲5個獨立視野，定量分析各組神經元凋亡指數。染色判定標準：TUNEL陽性細胞顯示特征性亮綠色熒光，NeuN標記神經元呈現特異性紅色熒光信號。

1.2.6免疫熒光檢測神經元LC3蛋白表達

腦組織切片經磷酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗3次后，依次進行以下處理： 0.2% TritonX-100膜通透處理中 5min ；PBS重懸清洗； 10% 二喹啉甲酸（BSA）室溫封閉處理 60min ，有效阻斷非特異性結合位點。清除殘留封閉液后，實施LC3/NeuN雙標免疫熒光染色：分別滴加LC3單克隆抗體 （1：200 及NeuN多克隆抗體（1：200），室溫共孵育4h；移除一抗工作液后，于暗環境中與對應種屬的熒光二抗（山羊抗小鼠IgG-Cy3/山羊抗兔IgG-FITC）共孵育 2h 。PBS充分漂洗后，應用4，6-二胱基-乙苯基吲哚（DPAI）核染料染色 5min ，最后以抗淬滅封片劑固封樣本。全過程避光操作，染色結果經激光共聚焦顯微鏡系統采集圖像，每樣本隨機選取3個視野進行熒光信號定量分析。

1.2.7透射電鏡觀察腦組織自噬小體變化

各組大鼠經麻醉處理后立即實施斷頭術，快速摘取腦組織并精準切取缺血半暗帶區域的新鮮皮層樣本，加人 2.5% 戊二醛固定過夜，第2天取出固定組織后使用PBS清洗后加入 1% 俄酸固定約2h，之后進行乙醇梯度脫水、環氧樹脂包埋、超薄切片，后進行醋酸鈾、檸檬酸鉛染色各 10min ，透射電鏡觀察并采集圖像。

1.2.8 腦組織ROS水平檢測

取出OTC凍存液中海馬組織，按以下流程進行ROS檢測：1）恒冷切片機制備 20μm 冠狀切片； 37^°C Krebs-Hepes緩沖液平衡復溫 30min ;PBS（pH7.4）漂洗3次；2）避光條件下浸入 10μmol/L 二氫乙啶（DHE）染色工作液， 37^°C 恒溫濕盒反應30min；3）激光共聚焦顯微鏡采集組織ROS熒光信號，每樣本系統隨機捕獲5個非重疊視野 （×400） 。采用Image-ProPlus6.0圖像分析系統，通過熒光強度積分光密度值（IOD）進行半定量，計算各組海馬ROS相對表達水平（IOD樣本/IOD對照 ×100% ）。

1.2.9蛋白免疫印跡法（WesternBlot）檢測腦組織LC3、NLRP3炎癥小體相關蛋白表達

每組取6只SD大鼠腦組織樣本，經剪碎處理后加入組織裂解液提取總蛋白。完成蛋白質變性后上樣，進行凝膠電泳及轉膜。使用 6% 脫脂牛奶封閉膜片，依次孵育以下一抗：NLRP3炎癥小體相關蛋白（NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1 β 、IL-18;1：1000）、LC3（1：500 及內參 β -actin（1：5000）， 4^°C 過夜孵育后洗膜。隨后于室溫下加入對應種屬二抗孵育2h，洗膜后采用ECL顯影系統進行化學發光檢測。最終通過ImageProPlus6.0軟件對目標蛋白條帶進行灰度值分析，計算相對表達量。

1.3 統計學處理

采用SPSS22.0軟件進行數據分析。符合正態分布的定量資料以均數 ± 標準差 表示，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），進一步兩組間比較采用Student-Newman-Keuls法。以 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1DEX對CIRI大鼠神經功能評分的影響

與Sham組比較，CIRI組神經功能缺損評分升高0 rlt;0.05 。DEX組與RAPA組神經功能缺損評分較CIRI組下降， DEX+3-MA 組神經功能缺損評分較DEX組升高，差異均有統計學意義（ Plt;0.05 ）。詳見圖1。

圖1各組大鼠神經功能評分比較（CIRI組與Sham組比較， ?Plt;0.05 ；與CIRI組比較，# Plt;0.05 ；與DEX組比較，△ Plt;0.05 ）

2.2DEX對CIRI大鼠腦梗死體積和腦組織病理形態的影響

HE染色顯示，Sham組大鼠腦組織細胞排列整齊，結構清晰完整，細胞核著色均勻，無病理性損傷。CIRI組大鼠腦組織細胞腫脹變形，排列紊亂，細胞間隙變寬，有壞死灶形成。與CIRI組相比，DEX組和RAPA組大鼠腦組織細胞形態相對整齊，結構完整，細胞間隙減小，病理損傷明顯減輕。與DEX組相比，DEX十3MA組大鼠腦組織細胞腫脹，細胞排列紊亂，病理損傷明顯加重。TTC染色分析顯示，與Sham組比較，CIRI組腦梗死體積顯著增加（ Plt;0.05 ）。DEX組與RAPA組CIRI大鼠腦梗死體積縮小（ Plt;0.05 ）。DEX + 3-MA則逆轉DEX的神經保護效應，腦梗死體積較DEX組增加（ Plt;0.05 。詳見圖 2～ 圖4。

圖2各組大鼠腦組織TTC染色

圖3各組大鼠腦梗死體積比較（CIRI組與Sham組比較， ?Plt;0.05 ；與CIRI組比較，# Plt;0.05 ;與DEX組比較，△ Plt;0.05 ）

圖4各組大鼠腦組織HE染色

2.3DEX對CIRI大鼠神經元凋亡的影響

與Sham組比較，CIRI組神經元凋亡指數顯著升高 Plt;0.05 ）。DEX組與RAPA組神經元凋亡指數較CIRI組顯著降低 ?Plt;0.05 。 DEX+3-MA 組神經元凋 亡指數較DEX組升高（ ?Plt;0.05 。詳見圖5、圖6。

圖5TUNEL法檢測DEX對CIRI大鼠腦梗死體積和腦組織病理形態的影響

圖6各組大鼠腦組織神經元調亡指數比較（ n=61 （CIRI組與Sham組比較， ^?Plt;0.05 ；與CIRI組比較，# Plt;0.05 ；與DEX組比較， Δ Plt;0.05 ）

2.4DEX對CIRI大鼠腦組織神經元LC3表達的影響

與Sham組相比，CIRI組大鼠腦組織LC3-II/LC3-I比值及神經元LC3陽性率升高 .Plt;0.05） 。與CIRI組相比，DEX組和RAPA組大鼠腦組織LC3-II/LC3-I比值及神經元LC3陽性率升高（ Plt;0.05 。與DEX組相比，DEX + 3-MA組大鼠腦組織LC3-II/LC3-I比值及神經元LC3陽性率降低（ Plt;0.05 ）。詳見圖 7～ 圖10。

圖7各組大鼠LC3-ⅡI、LC3-I蛋白表達條帶圖

圖8各組大鼠腦組織LC3-ⅡI/LC3-I比值比較（CIRI組與Sham組比較， ?P{0.05 ;與CIRI組比較，# P=0.05 與DEX組比較，△ Plt;0.05 ）

圖9各組大鼠腦組織免疫熒光染色圖

圖10各組大鼠神經元LC3陽性率比較（ n=6 1（CIRI組與Sham組比較， ?Plt;0.05 ;與CIRI組比較，# Plt;0.05 ；與DEX組比較， Δ Plt;0.05 ）

2.5 DEX對CIRI大鼠腦組織自噬小體的影響

透射電鏡觀察顯示，Sham組大鼠腦組織未見明顯的自噬小體，超微結構清晰，線粒體形態完整。與Sham組相比，CIRI組大鼠腦組織自噬小體數量明顯增加，且自噬溶酶體分布散亂。與CIRI組相比，DEX組和RAPA組大鼠腦組織自噬小體數量明顯增加。與DEX組相比，DEX + 3-MA組大鼠腦組織自噬小體數量明顯減少。詳見圖11。

2.6 DEX對CIRI大鼠腦組織NLRP3炎癥小體活化的影響

WestemBlot檢測顯示，與Sham組比較，CIRI組腦組織NLRP3通路關鍵蛋白（ASC、Caspase-1）及其下游炎性因子（IL-1β、IL-18）表達顯著上調（ Plt;0.05） 。DEX組與RAPA組NLRP3炎癥小體相關蛋白表達較CIRI組均明顯下調（ Plt;0.05） 。DEX+3-MA組炎癥小體相關蛋白表達較DEX組顯著上調 Plt;0.05 。詳見圖12、圖13。

圖11DEX對CIRI大鼠腦組織自噬小體的影響（透射電鏡， ×5000 ）

圖12各組腦組織NLRP3炎癥小體相關蛋白表達條帶圖

圖13各組大鼠腦組織NLRP3炎癥小體相關蛋白表達比較（ n=6 0（A為各組大鼠NLRP3蛋白表達比較;B為各組大鼠ASC蛋白表達比較；C為各組大鼠Caspase-1蛋白表達比較；D為各組大鼠IL-1β蛋白表達比較;E為各組大鼠IL-18蛋白表達比較。CIRI組與Sham組比較， ^?Plt;0.05 ：與CIRI組比較，# Plt;0.05 ；與DEX組比較，△ Plt;0.05 ）

2.7 DEX對CIRI大鼠腦組織ROS水平的影響

與Sham組比較，CIRI模型組腦組織ROS水平顯著上調（ Plt;0.05 ）。DEX與RAPA干預均能有效抑制ROS蓄積，ROS水平相較于CIRI組顯著降低（ Plt;0.05）。DEX + 3-MA組ROS水平較DEX組顯著上升C Plt;0.05） ，提示自噬抑制可能削弱DEX的抗氧化效應。詳見圖14、圖15。

圖14各組大鼠腦組織ROS蓄積免疫熒光染色圖

圖15各組大鼠ROS水平比較（ n=6 （CIRI組與Sham組比較， ?Plt;0.05 ;與CIRI組比較，# Plt;0.05 ；與DEX組比較 ，Δ Plt;0.05 ）

3討論

近年來，我國腦卒中疾病負擔持續攀升，已成為亟待解決的重大公共衛生挑戰。DEX作為臨床圍手術期常用的麻醉輔助性用藥，具有良好的抗焦慮和鎮靜作用。既往研究發現，DEX能夠通過抑制氧化應激、炎癥反應，改善CIRI大鼠神經元損傷[2]，但是有關DEX是通過何種機制發揮抗CIRI的作用機制尚未完全闡明。本研究首先通過線栓法構建大鼠CIRI模型，結果發現，CIRI組大鼠神經功能缺失評分、腦梗死體積百分比及神經元細胞凋亡率均顯著增加，腦組織形態結構出現明顯的病理損傷，表明模型構建成功。經DEX干預處理后能夠減輕上述病理指標變化，再次證實DEX能夠改善大鼠CIRI。

自噬作為真核生物保守性代謝過程，對維持細胞穩態具有重要生理意義。基礎研究證實，腦缺血再灌注可誘導神經元、膠質細胞及腦微血管細胞等神經細胞自噬流顯著增強，但其在該病理過程中的生物學效應尚存爭議[21-23]。藥理學研究顯示，抑制自噬可有效緩解CIRI病理損傷，提示其激活可能參與繼發性損傷機制[2425]；而神經保護研究則發現增強自噬能減輕神經元損傷，彰顯其神經修復潛能[26-27]。這種雙效性特征可能與缺血區域微環境異質性、損傷階段特異性及干預措施時空差異性密切相關。本研究發現，CIRI組大鼠腦組織自噬水平明顯增強。經DEX干預后能夠顯著上調腦組織及神經元LC3表達，誘導自噬水平增強，提示DEX可能通過誘導神經元自噬，改善大鼠CIRI。進一步研究發現，與CIRI組相比，RAPA能夠通過激活自噬發揮與DEX同向的神經元保護作用。3-MA為自噬的特異性抑制劑，其能夠抑制神經元自噬水平逆轉DEX對大鼠CIRI的保護作用。綜合以上研究表明，在CIRI大鼠模型中，自噬水平顯著升高可能發揮生理性保護效應，DEX干預后能夠通過激活自噬水平，進而發揮神經元損傷的保護作用。NLRP3炎癥小體由NLRP3、ASC和pro-Caspase-1共同組成的蛋白復合物，當其受到外界因素刺激后能夠誘導proCaspase-1發生剪切形成活化的Caspase-1，進而促進下游炎癥細胞因子IL-1β、IL-18釋放，誘導炎癥反應[28]潘海英等[29]研究發現，在大鼠CIRI后腦梗死區域NLRP3炎癥小體相關蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1表達以及IL-1β、IL-18水平均顯著升高，而MCC950能夠顯著抑制NLRP3炎癥小體活化介導的炎癥反應，進而降低腦梗死體積，改善CIRI大鼠神經功能。本研究發現，CIRI組大鼠腦梗死區域NLRP3炎癥小體相關蛋白及IL-1β、IL-18蛋白表達均顯著升高。與CIRI組相比，經DEX處理后大鼠腦梗死區域NLRP3炎癥小體活化介導的炎癥反應被顯著抑制，提示DEX降低腦梗死體，減輕CIRI大鼠神經功能障礙，其機制可能與抑制NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應相關。

研究表明，自噬可以通過負調控NLRP3通路激活，阻斷其介導的炎性級聯反應，從而延緩炎性病理進程[30]。新近研究顯示，普拉托寧能夠通過BNIP3/LC3途徑誘導自噬，抑制NLRP3炎癥小體活化，從而發揮CIRI神經保護作用[31]，表明在CIRI中自噬可能是NLRP3炎癥小體活化的抑制因素。本研究結果顯示，與DEX組相比，RAPA能夠通過激活自噬，抑制NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應，從而發揮與DEX同向的CIRI大鼠神經功能保護作用。3MA能夠抑制自噬，激活NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應，從而逆轉DEX對CIRI大鼠神經功能的保護作用。ROS是調控NLRP3炎癥小體激活的關鍵因子，其過度蓄積可觸發該炎癥小體激活通路，加劇腦損傷進程。研究表明，清除ROS不僅能有效抑制NLRP3介導的炎性級聯反應，還可改善神經組織病理損傷[32]。此外，研究證實，激活自噬流可促進其與溶酶體耦聯，加速清除受損細胞器，阻斷ROS累積，進而拮抗NLRP3炎癥小體激活及其引發的炎性級聯反應。該調控路徑提示ROS可能作為自噬負向調控NLRP3通路的核心信號樞紐[33]。本研究結果顯示，RAPA能夠誘導細胞自噬，降低腦組織ROS水平，進而抑制NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應，并最終發揮與DEX同向的CIRI大鼠神經保護作用。與DEX組相比，3-MA能夠顯著抑制自噬，促進腦組織ROS堆積，誘導NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應，從而逆轉DEX對CIRI大鼠神功能的保護作用。

綜上所述，本研究通過動物模型探究了DEX對大鼠CIRI的作用及機制。結果發現，DEX能過夠通過增強神經元自噬水平，降低腦組織ROS堆積，抑制NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應，進而改善CIRI。但是，本研究還存在一定的局限性，未能夠在細胞水平上進行研究，今后本課題組將通過培養原代神經元從而細胞層面上揭示DEX對低氧/復氧誘導的體外CIRI的作用及機制，進一步為DEX臨床治療CIRI提供了實驗依據。

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