根皮素調節Shh/Gli1信號通路對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌損傷的機制研究

Effctof Phloretinon Rats lschemia-reperfusion Myocardial Injuryby Regulating the Shh/Gli1 SignalingPathway ZHANG Zhiling，DI Xueqin，MA Xiaoru，MA Shuyi，LIFangfang

BaodingNo.1Central Hospital，BaodingO72150，Hebei，China Corresponding Author Dl Xueqin，E-mail： 149939389@ qq.com

AbstractObjective：ToexploretheefectofphloretinPhtonratsischemia-eperfusionmyocardialijury（Ml）byregulatingthesonic hedgehog/gloaoatedcogene1（SGli）signaigpatayMethds：Atotalof90ealtyaleSDatsofspeificptof （SPF）grade wererandomlydividedintothecontrol group（Control group），themodel group（MIRlgroup），thelow-dosephytoltreatment group（Pht-L），thehighdosephytoltreatmentgroup（Pht-H），andtheigh-dosephytoltreatment+cyclopamine（aGliShhsignaling pathwayinhibitorgroup（PhtHCycgroup）.TheMIRIratmodelwasestablishedbyligatingtheleftanteriordescendingbranchofthe coronaryarterysfitoctoossfctteri-ββ）dd indicatorssuchascreatinekinaseisoenzyme（CK-MB），troponinI（cTnl），andmyoglobin（Mb）weredetectedbyenzymeinked immunosorbentassay（ELSA）.Hematoxylineosin（HE）stainingwasusedtoobservethemorphologicalchangesofmyocardiatissue. terminaldeoxibonucleotidyltransferase（TdTmediateddUTPnickendlabelingUNEL）stainingwasusedtodetect theapoptosisof cardiacmusclecelexpessonveofcelo-cl-2）c-soatedproteiax）ndGetedy WesterBlotResults：ComparedwiththeControlgroup，theMRlgroupshoweddeepstainingofmyocardialcellnucleidisordered arrangement of myocardial fibers，and significant infiltration of inflammatory cels，the levels of TNF-α ，IL-1β，CK-MB，cTnl，Mb，TUNEL positive cels，apoptosisrate，andBax expressionelevated，theexpressionof Bcl-2，Shh，nd Glidecreased （Plt;0.05） .Themyocardial celinthePhtLandPhtHgroupsererelativelyntactandoalomparedtatofteMlgropitelativelyatarrngtf myocardialfibersand lessobvious infiltrationof inflammatorycels，the levels of TNF- ，IL-1 β ，CK-MB，cTnl，Mb，TUNELpositive cells，cell apoptosisrate，andBaxexpressionreduced，theexpressionof Bcl-2，Shh，and Gli1increased Plt;0.05） .ThePht-H + Cyc group showed moresevere myocardial tissue damage compared that of the Pht-H group，the levelsof TNF -a ，IL-1 β ，CK-MB，cTnl，Mb，TUNEL poitive cells，apoptosisrate，andBaxexpressonelevated，theexpressionofBcl-2，Shh，and Gli1decreased Plt;0.05 .Conclusion：Phloretincan reducemyocadialinjuryinatsiyocadialiheperfusionijurnditsechasmiselatedtotectivatioofti signaling pathway.

Keywordsmyocardialischemia-reperfusioninjury；phloretin；sonichedgehog/glioma-assciatedoncogene1signalingpathway; experimentalstudy

急性心肌梗死（AMI）是臨床最常見的心血管疾病，具有高發病率與死亡率，是全球范圍內心血管疾病死亡的主要原因，嚴重威脅人類的生命健康[12]。AMI主要是由于冠狀動脈急性或持續性缺血缺氧引起心肌細胞壞死，目前主要通過支架植入術、冠狀動脈介入術等及時恢復心臟供血，是治療AMI最有效的策略，但在缺血狀態下恢復供血會加重心肌損傷即心肌缺血再灌注損傷（MIRI），進而導致心肌細胞功能障礙[3]。因此，減輕MIRI是目前研究重點。根皮素是二氫查爾酮類化合物，具有抗炎、抗凋亡、抗纖維化等多種生物活性，可通過恢復沉默信息調節因子1（SIRT1）表達抑制高糖誘導的心肌細胞損傷[4]。音猬因子/膠質瘤相關癌基因同源物1（Shh/Gli1）信號通路可以通過抗凋亡、抗氧化應激等多種機制參與多種組織損傷修復過程，其中茯苓酸可以通過激活Shh/GIi1信號通路改善MIRI大鼠心肌損傷[5]。根皮素能否通過調控Shh/Gli1信號通路改善MIRI大鼠心肌損傷尚未可知，本研究主要探討根皮素對MIRI大鼠心肌損傷及Shh/Gli1信號通路的影響，以期為MIRI治療提供理論參考。

1材料與方法

1.1 主要材料

90只無特定病原體（SPF）級健康雄性SD大鼠，體質量 180～2209 ，購自武漢云克隆動物有限公司[生產許可SCXK：（鄂）2023-0021]；根皮素（ 99.99% ，P7912-100MG）購自上海Sigma公司；環巴胺對照品（純度 98% ，XY-XBZP-2705）購自上海烜雅生物公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（G11120）購自北京Solarbio公司；DNA斷裂的原位末端標記（TUNEL）細胞凋亡試劑盒（G001-1-1）購于南京建成生物公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒購自上海碧云天公司；肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌鈣蛋白I（cTnIELISA試劑盒購自上海江萊生物公司；肌紅蛋白（Mb）ELISA試劑盒購自上海西格生物公司；兔源B淋巴細胞瘤-2相關蛋白（Bcl-2-associatedXprotein，Bax）、兔源B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、兔源磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）兔源Shh、兔源GIi1及羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）抗體購自英國abcam公司。本研究經保定市第一中心醫院倫理委員會批準，編號：快（2023）008號。

1.2 方法

1.2.1 MIRI模型

麻醉大鼠后連接動物呼吸機和心電監護儀，左側心臟搏動處打開胸腔，于左冠狀動脈前支 2mm 左右處結扎 30min ，隨后松開縫線 120min ，期間發現冠狀動脈結扎時心電監護儀ST段抬高或T波高聳，心外膜顏色發絳，松開縫線后ST段下降 gt;50% ，心外膜顏色恢復正常，說明MIRI大鼠模型構建成功[6]。Control組只進行左冠狀動脈前支分離、穿線不結扎。

1.2.2 分組與處理

將90只大鼠隨機分為對照組（Control組）模型組（MIRI組）、根皮素低劑量處理（Pht-L）組、根皮素高劑量處理（PhtH）組、根皮素高劑量處理 + Shh/Gli1信號通路抑制劑環巴胺組（PhtH十Cyc組），每組18只。PhtL組、Pht-H組分別給予 166，332mg/kg 根皮素灌胃，每日1次；Pht-H + Cyc組缺血前 30min 進行10mg/kg環巴胺腹腔注射及造模完成后給予 480mg/kg 根皮素灌胃，每日1次；Control組與MIRI組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次。各組均連續干預4周。

1.2.3炎性因子水平及心肌損傷指標檢測

各組隨機選擇6只大鼠麻醉處死，取出心肌組織，加入預冷生理鹽水，研磨制成勻漿， 5000r/min 離心取上清液，檢測TNF- -a 、IL-1 β 、CK-MB、cTnI、Mb水平，詳細操作參照ELISA試劑盒說明書。

1.2.4心肌組織形態學變化觀察

各組隨機選擇6只大鼠處死，取心肌組織，清洗干凈后固定、石蠟包埋，切片機切片，HE染色，梯度乙醇脫水后，透明、封片，顯微鏡下觀察心肌的病理變化。

1.2.5 細胞凋亡觀察

取1.2.4制備的石蠟切片，脫蠟后加入預冷丙酮固定，TUNEL染色，一般凋亡細胞呈棕色或深棕色，觀察心肌組織著色情況，計算心肌細胞凋亡率（凋亡細胞數/總細胞數 ×100% ）。

1.2.6調亡及Shh/Gli1信號通路相關蛋白檢測

采用蛋白免疫印跡法（WestemBlot），處死各組剩余6只大鼠取心肌組織，預冷研磨后進行RIPA裂解，提取并檢測總蛋白濃度。取適量蛋白變性，進行凝膠電泳分離，冰上轉膜、封閉，清洗后加入Bax、Bcl-2、Shh、GIi1、GAPDH一抗及HRP標記二抗進行孵育，再加入增強化學發光試劑（ECL）孵育，凝膠成像系統觀察并分析各蛋白相對表達量。

1.3 統計學處理

采用SPSS25.0軟件進行數據分析。符合正態分布的定量資料以均數士標準差 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1 根皮素對炎性因子水平的影響

MIRI組TNF- α 、IL-1 β 水平較Control組升高（ Plt;0.05）；Pht-L組、Pht-H組 TNF-α IL-1β水平較MIRI組依 次降低（ Plt;0.05） ;PhtH+Cyc 組TNF- a 、IL-1β水平較PhtH組升高（ Plt;0.05 ）。詳見表1。

單位：ng/mL

表1各組大鼠炎性因子水平比較

注：MIRI組與Control組比較， ① Plt;0.05 ；與MIRI組比較， ② Plt;0.05 ；與Pht-L組比較， ③ Plt;0.05 ；與Pht-H組比較， ④ （20 Plt;0.05

2.2 根皮素對心肌損傷指標的影響

MIRI組CK-MB、cTnI、Mb水平較Control組升高（ Plt; 0.05）；Pht-L組、Pht-H組CK-MB、cTnl、Mb水平較MIRI組依次降低（ Plt;0.05） ;Pht-H + Cyc組CK-MB、cTnl、Mb水平較Pht-H組升高（ Plt;0.05 。詳見表2。

表2各組大鼠CK-MB、cTnI、Mb水平比較（x士s）

注：MIRI組與Control組比較， ① Plt;0.05 ；與MIRI組比較， ② Plt;0.05 ；與Pht-L組比較， ③ Plt;0.05 ；與Pht-H組比較， ④ Plt;0.05

2.3根皮素對心肌組織病理形態變化的影響

Control組心肌細胞結構完整且排列有序，細胞形態完整，大小均勻；MIRI組心肌細胞核固縮深染，心肌纖維排列紊亂，有明顯炎性細胞浸潤；Pht-L組、PhtH組心肌細胞相對完整正常，心肌纖維排列相對整齊，炎性細胞浸潤不明顯；PhtH + Cyc組較Pht-H組心肌組織損傷加重。詳見圖1。

圖1HE染色觀察各組大鼠心肌組織病理形態變化（ ×200

2.4根皮素對心肌組織細胞凋亡的影響

與ControI組比較，MIRI組TUNEL陽性細胞增多， 細胞凋亡率及Bax表達升高，Bcl-2表達降低（ Plt; 0.05）；Pht-L組、PhtH組TUNEL陽性細胞減少，細胞凋 亡率及Bax表達依次降低，Bcl-2表達依次升高 Plt; 0.05）；與Pht-H組比較，Pht-H十Cyc組TUNEL陽性細 胞增多，細胞凋亡率及Bax表達升高，Bcl-2表達降低 （ Plt;0.05 。詳見圖2、圖3、表3。

圖2 TUNEL染色檢測各組大鼠心肌細胞凋亡情況 1×400 ）

圖3WesternBlot檢測Bax、Bcl-2蛋白表達條帶圖（A為Control組；B為MIRI組；C為Pht-L組；D為PhtH組；E為Pht-H + Cyc組）

表3各組大鼠心肌細胞凋亡及凋亡相關蛋白比較

注：MIRI組與Control組比較， ① Plt;0.05 ；與MIRI組比較， ② Plt;0.05 ；與Pht-L組比較， ③ Plt;0.05 ；與Pht-H組比較， ④ Plt;0.05， 0

2.5根皮素對Shh/Gli1信號通路相關蛋白的影響

MIRI組Shh、Gli1表達較Control組降低（ Plt; 0.05）；Pht-L組、PhtH組Shh、Gli1表達較MIRI組依次升高（ Plt;0.05 ）;Pht-H + Cyc 組Shh、Gli1表達較Pht-H組降低（ Plt;0.05 。詳見圖4、表4。

圖4WesternBlot檢測Shh、Gli1蛋白表達（A為Control組；B為MIRI組；C為Pht-L組；D為PhtH組；E為Pht-H + Cyc組）

表4各組大鼠Shh/Gli1信號通路相關蛋白表達比較（x士s）

注：MIRI組與Control組比較， ① （204 Plt;0.05 ；與MIRI組比較， ② 1lt;0.05 ;與Pht-L組比較， ③ Plt;0.05 ;與Pht-H組比較， ④ Plt;0.05 。

3討論

MIRI是在治療AMI時短時間內血液灌注恢復，造成心肌組織損傷加劇的病理過程，其發病受多因素影響，主要機制包括炎癥損傷、細胞調亡、氧化應激和線粒體功能障礙等[9]。目前，對于MIRI主要采用促紅細胞生成素、汀類藥物、降壓藥等進行治療，雖然有所改善，但特異性差，副作用明顯，尋求新的藥物治療MIRI成為研究重點[1]。根皮素作為一種天然酚類化合物，存在于蘋果、草莓、梨及中草藥白刺藜子和白鮮皮等植物中，具有抗炎、抗氧化、保護血管等多種作用，還具有心臟保護作用[11]。根皮素可通過抑制NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）/IL-1β通路，減輕炎癥反應，減輕纖維化，預防室性心律失常和心力衰竭[12]。根皮素還可通過抑制炎癥因子釋放及細胞凋亡相關蛋白表達，保護三氧化二砷誘導的心肌細胞凋亡[13]。本研究結果顯示，根皮素治療使心肌損傷敏感指標CK-MB、cTnl、Mb水平下調，說明根皮素可以改善MIR大鼠心肌損傷。

MIRI發病機制較為復雜，而炎癥反應和心肌細胞的凋亡是MIRI關鍵過程。MIRI其發病過程主要是由于缺血損傷刺激巨噬細胞、中性粒細胞等分泌大量促炎因子TNF- IL-1β等，TNF -a 又可引發心肌細胞發生促炎性程序性細胞死亡，加重心肌組織纖維化，導致心功能障礙[14]。本研究發現，根皮素可以降低 TNF-α 、IL-1 $| ＼beta ＼rrangle$ 水平，上調Bcl-2表達，下調Bax表達，抑制炎癥反應和細胞凋亡，可以改善MIRI。TNF- 作為細胞信號轉導蛋白，可促進炎癥介質的表達，而IL-1β是促炎癥因子，兩者共同調控機體炎癥反應[15]。而TNF -α 又可調控細胞凋亡，促進促凋亡因子Bax表達，Bax與抑制細胞凋亡因子Bc-2相互拮抗在細胞調亡過程中發揮重要作用，而抑制細胞凋亡可以減輕MIRI[16]。

Shh/Gli1作為保守的信號通路，參與心肌缺血后的修復過程。其中Shh蛋白為Hh蛋白家族一員，參與胚胎發育的多個生物進程，而GIi1高表達是Shh通路激活的標志。其主要機制為Shh蛋白與Patched受體結合，Patched對Smoothed受體的抑制被解除，使GIi1、GIi2和GIi3進人細胞核，促進調控細胞生長、分化的一系列靶基因表達，發揮各種生物學作用[17]。研究發現，SNHG6沉默通過調節miR-135a-5p/HIF1AN激活Shh/Gli1信號通路，緩解缺氧/復氧誘導的心肌細胞凋亡[18]。遠隔缺血預處理可通過激活Shh/Glil信號通路減輕大鼠再灌注性心律失常[19]。異氟醚后處理可激活Shh/Gi信號通路，減少腦梗死體積，抑制細胞凋亡，改善組織病理學損傷，進而減輕腦缺血-再灌注損傷[8。本研究發現，根皮素可以上調Shh、Gli1表達，可能通過激活Shh/GIi1信號通路改善MIRI大鼠心肌損傷。環巴胺是異甾體類生物堿，可通過改變Smoothened蛋白的空間結構對Shh/Gli1信號通路發揮抑制作用，而本研究環巴胺處理可以逆轉根皮素的作用，進一步證實根皮素可通過激活Shh/GIi1信號通路改善MIRI大鼠心肌損傷。

綜上所述，根皮素可改善MIRI大鼠心肌損傷，其機制與激活Shh/GIi1信號通路有關。本研究仍存在不足之處，根皮素作用于MIRI的機制尚不清楚，需要進一步實驗驗證。

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