農桿菌介導的水稻遺傳轉化的優化研究

中圖分類號：S511.035文獻標志碼：A

文章編號：1673-6737（2025）05-0018-06

Optimization of Rice Genetic Transformation Mediated by Agrobacterium Tumefaciens

ZHOU Xiao-tong （Northeast Forestry University，Harbin 15OOOO，China）

Abstract：Objective：TooptimizethegenetictransformationofricemediatedbyAgrobacterium.Method：Mature embryos ofindicaricevariety9311，Minghui-86，andjaponicaricevarietyNihon Harunawereusedasresearch materialsfor genetictransformationoptimizationofrice.TheAgrobacterium strainusedintheexperiment was LBA404，and the plasmid used waspCAMBIA1301A At MYB44.After preparing multiple solutions，prepare Agrobacterium competentcells. Transfer plasmid pCAMBIA1301A At MYB44 into Agrobacterium strain LBA4404 using prepared Agrobacterium competent cells.Applytheimportedbacterialsolutiontoinfectthreetypesofriceandachievetheirgenetictransformation.Extract DNA molecules fromrice plantsafter genetictransformationandperformPCRdetection.Result：Afteroptimization，the DNAextractionamount，DNApurity，andDNAintegritywereallhigher.Afteroptimization，thegenetictransformation efectofindicaricevarietiesisbeter.Afteroptimization，thePCRbandsareclearer，andtheocurenceofnon-specific bandsis lessobvious，resulting inahigher positiverateofPCRdetection.Conclusion：TheoptimizationofAgrobacterium mediatedrice genetic transformationhas beensuccesfullyachievedinthestudy，which hassignificantpractical significance.

Key Words：Agrobacterium;Plasmid; Rice genetic transformation;DNA molecule extraction;PCR detection

隨著生物技術的不斷發展，在作物新品種培育與改良中，植物遺傳轉化發揮著日益關鍵的作用，其中農桿菌介導法作為經典且高效的植物遺傳轉化手段，在水稻等重要糧食作物的研究中得到了廣泛應用。然而，當前農桿菌介導法在實際應用中仍然面臨著操作流程繁瑣、基因型依賴性強、轉化效率不穩定等諸多限制，這制約了該方法在水稻遺傳改良中的深入應用與進一步推廣，因此開展農桿菌介導的水稻遺傳轉化的優化研究具有迫切需求與重要的現實意義。

對于農桿菌介導的水稻遺傳轉化問題的研究，國內起步較早，目前已經實現粳稻、粘稻等主要品種的轉化體系構建，并在積極探索如何提升轉化效率。多種優質基因已經被導入水稻，為其遺傳改良提供了有力支持。而國外研究更重視跨物種應用拓展與農桿菌介導轉化技術的底層機制創新。在應用領域方面，國外已經實現了小麥、玉米等谷物的高效轉化，還研究了受體材料優化、菌株改造等方面以及物理處理如離心、熱休克、疏散等對于轉化效率的提升作用?，F參考以往所取得的各種研究成果，對農桿菌介導的水稻遺傳轉化實施優化研究。

1材料與方法

1.1受體植物材料

本研究以燦稻品種9311成熟胚、明恢86以及粳稻品種日本晴為水稻遺傳轉化優化的研究材料，來自某水稻研究所溫室與轉基因圃內，由專人進行管理[3]。

1.2農桿菌菌株和質粒

試驗中使用的農桿菌菌株為LBA4404，購于某生物技術有限公司。采用的質粒為pCAMBIA1301A-AtMYB44，該質粒含有HUS報告基因與篩選標記基因NPTII、HPT，三者的啟動子均為CaMV35S。由于HUS報告基因編碼區中含有一個內含子，因此該基因僅能在植物中表達。

1.3試驗試劑與儀器

試驗中采用的試劑如表1所示。

試驗中采用的儀器如表2所示。

表1試驗中采用的試劑

表2試驗中采用的儀器

接著配制試驗中所需的溶液。

1.4 溶液配制

需要配制的溶液包括DNA提取緩沖液、 .50× TAE緩沖液、3M乙酸鈉溶液、 .0.5mol/L EDTA溶液、質粒提取液、 20×SSC 溶液、中和緩沖液、變性緩沖液、洗滌緩沖液、馬來酸緩沖液、抗體溶液以及檢測緩沖液。

其中DNA提取緩沖液采用CTAB法配制，具體操作如下：將 20g/L 的 CTAB，25mMpH 值為8.0的 _{Tris-HCl，0.5g/L} 的 Spermidine 的NaCl 混合均勻，進行 20min 的121 C 滅菌處理

50×TAE 緩沖液的配置操作如下：混合100ml ΔpH 值為8.0的 05mol/L EDTA .57.1ml 的冰醋酸以及 242g/L 的Tris，加水定容至 ¹L 。

3M 乙酸鈉溶液（ 3MNaAc ）的配置操作如下：在 水中溶入無水 NaAc24.6g ，加入HAc將 pH 調至5.2，加水定容至 100ml^[η] 。

0.5mol/L EDTA溶液的配置操作如下：在800ml 重蒸水中溶人EDTA- -Na²?2H₂0 共 186.1g，劇烈攪拌后通過NaOH調節溶液將 ΔpH 調至8.0，加水定容至1L。

利用堿裂解法配制質粒提取液，配置操作如下：稱取 值為8.0的EDTA pH 值為8.0的Tris-HCl以及 50mM 葡萄糖，混合后分裝，接著進行20分鐘高壓滅菌處理，保存備用。

20×SSC 溶液的配置操作如下：稱取 88.2g Na₃Citrate 與 175.3gNaCl ，使用dd H₂O 將其定容至 ¹L ，并進行高壓滅菌處理。

中和緩沖液的配置操作如下：稱取 121.14g Tris-base與 87.66gNaCl ，均溶于 800ml dd H₂O 中，利用HCl將其 pH 值調至7.4并最終定容至1L

變性緩沖液的配置操作如下：稱取 20g NaOH與 87.66g NaCl，均溶于 800ml dd H₂O 中，并定容至 ¹L 。

洗滌緩沖液的配置操作如下：取 0.3% Tween-20添加至馬來酸緩沖液中，現配現用[0]

馬來酸緩沖液的配置操作如下：稱取 8.77g NaCl.7.88gNaOH.11.607g 馬來酸，均溶于800ml dd _H2O 中，使用固體將其 ΔpH 值調至7.5定容至1L并進行高壓滅菌處理。

抗體溶液的配置操作如下：對原始管中的anti-digoxigenin-AP實施 5min 離心，將轉速設置為 10000r/min 轉，從表面吸取所需用量，按照1：10000的比例通過配制的封阻溶液進行稀釋，該溶液同樣需要新鮮制備[2]

封阻溶液的配置操作如下：按照1：10的比例對 10× 封阻液進行稀釋，最終稀釋為 1× workingsolution，現配現用。

1.5 試驗方法

首先需要制備農桿菌感受態細胞，具體制備流程如圖1所示。

使用制備好的農桿菌感受態細胞將質粒pCAMBIA1301A-AtMYB44導入農桿菌菌株LBA4404中，具體流程如下：應用DNA提取緩沖液 .50×TAE 緩沖液以及變性緩沖液提取 1μg 純化后的質粒DNA，將其加入農桿菌感受態細胞中，加入一滴 0.5mol?L^-1EDTA 溶液以螯合金屬離子，加入三滴 3M 乙酸鈉溶液以調節 pH 值至酸性范圍，混合均勻后進行 5min 冰浴[3]。將菌液轉移至含有卡那霉素的YEP固體培養基中，涂抹均勻[4。在 28°C 下培養2～3d后，挑取單菌落進行質粒培養15]。使用質粒提取液提取質粒，以實施菌落PCR檢測，確認質粒是否成功轉入到農桿菌中，以及目標基因是否按預期插入到農桿菌中[其中制備的菌液如圖2所示。

圖1具體制備流程

圖2制備的菌液

去除燦稻品種9311成熟胚、明恢86以及粳稻品種日本晴的種子穎殼，并選取飽滿、無病斑種子，使用每 100ml 加人1滴Tween-20的漂白精進行消毒，利用無菌水洗至無味，使用洗滌緩沖液沖洗，并用無菌濾紙將水稻種子吸干，接入至誘導培養基光照培養7d，作為外植體[7]。

使用中和緩沖液調整導入質粒pCAMBIA1301A-AtMYB44的農桿菌菌株LBA4404菌液的菌液值至0.1，在該菌液中加入兩滴抗體溶液，利用其侵染粘稻品種9311成熟胚、明恢86以及粳稻品種日本晴[18]。 30min 后使用無菌濾紙吸干種子表面菌液，接人至共培養培養基中滴入兩滴 20× SSC 溶液與IAA實施 72h 愈傷共培養[1]

挑選狀態較好的愈傷組織將其轉移至分化培養基上，實施14d黑暗培養，培養溫度為 28°C ，接著進行在30 C 恒溫環境下使其接受光照16h，再度轉移至黑暗環境中保持 8h 不見光狀態，不斷重復直到水稻苗長到 2cm 左右[20。將水稻苗轉移至生根培養基中，在 30°C 恒溫環境下使其接受光照 16h ，再度轉移至黑暗環境中保持 不見光狀態，不斷重復]。

最終的水稻遺傳轉化結果如圖3所示[2]。

圖3最終的水稻遺傳轉化結果

在試驗中，使用傳統農桿菌介導的水稻遺傳轉化方法作為以上優化方法的對比[23]。

1.6 測試項目

首先通過CTAB法提取遺傳轉化后水稻植株的DNA分子。接著對DNA分子實施PCR檢測24。

2 結果與分析

2.1DNA分子提取結果分析

傳統農桿菌介導的水稻遺傳轉化方法與該優化方法的DNA提取量與DNA純度測試結果如表3所示。

由表1的DNA分子提取對比結果，就傳統方法與優化方法的對比來說，優化方法的DNA提取量更高，說明優化方法轉化過程對細胞活力的影響小，即水稻植株代謝紊亂、組織壞死等情況的發生概率更低，轉化過程對細胞的毒性也較低。優化方法的DNA純度也更高，說明轉化過程中雜質殘留增加或細胞裂解不充分的情況更少。

就不同水稻品種來說，優化方法對于粘稻品種9311成熟胚、明恢86的DNA提取量與DNA純度更高，對于粳稻品種日本晴的DNA提取量與DNA純度更低。這是由于該優化方法采用的質粒pCAMBIA1301A-AtMYB44含有HUS報告基因、篩選標記基因NPTII和HPT，且三者的啟動子均為CaMV35S，能使外源基因在粘稻品種中的表達和整合更為高效，從而減少了轉化過程對水稻植株細胞的損傷，有利于后續提取DNA。以及粘稻品種作為受體材料時，具有對農桿菌浸染更高的耐受性和較高的再生能力。這種特性使得粘稻品種在轉化過程中能夠保持較好的生理狀態，減少DNA降解與細胞死亡，有利于完整提取DNA。

就9311成熟胚來說，傳統農桿菌介導的水稻遺傳轉化方法與該優化方法的DNA完整性對比情況如圖4所示。

表3DNA提取量與DNA純度測試結果

優化方法的9311成熟胚DNA完整性測試結果為清晰高分子量條帶，而傳統方法的9311成熟胚DNA完整性測試結果不如優化方法清晰，也不如優化方法分子量高，說明優化方法轉化過程中毒性更低。其中條帶更清晰說明優化方法下9311成熟胚的DNA未發生明顯斷裂或降解。同時優化方法下9311成熟胚的條帶位于凝膠頂部，DNA分子量更大，說明優化方法下9311成熟胚DNA形態更加完整。這是由于優化方法采用LBA4404菌株與pCAMBIA1301A-AtMYB44質粒的組合，降低了轉化過程中對宿主細胞的代謝壓力即降低了農桿菌對于水稻細胞的損傷。

圖4DNA完整性對比情況

2.2PCR檢測結果分析

傳統農桿菌介導的水稻遺傳轉化方法與該優化方法遺傳轉化后水稻植株DNA分子的PCR檢測結果對比情況如圖5所示。

圖5PCR檢測結果對比情況

以上PCR檢測結果表明，優化方法條帶更加清晰，同時其出現非特異性條帶的情況不明顯，而傳統方法條帶清晰度低于優化方法，同時粘稻品種9311成熟胚與粳稻品種日本晴均明顯出現非特異性條帶。說明傳統方法在轉化過程中存在DNA損傷或非特異性擴增，而優化方法通過加入IAA這種植物激素以及優化了侵染條件與水稻遺傳轉化中使用的各種溶液，能夠減少轉化過程中對水稻細胞的損傷，保障其DNA完整性，使得PCR產物條帶更加清晰、特異性更高。

傳統農桿菌介導的水稻遺傳轉化方法與該優化方法遺傳轉化后水稻植株DNA分子的PCR檢測陽性率對比情況如圖6所示。

圖6PCR檢測陽性率對比情況

不論是粘稻品種，還是粳稻品種，該優化方法遺傳轉化后水稻植株DNA分子的PCR檢測陽性率均高于傳統方法。這是由于優化方法通過LBA4404菌株與pCAMBIA1301A-AtMYB44質粒的組合，以及侵染條件的優化等因素，顯著提高了農桿菌介導的轉化效率，使得更多水稻植株成功整合了外源基因。

3結論

在農桿菌介導的水稻遺傳轉化的優化中，采用LBA4404菌株與pCAMBIA1301A-AtMYB44質粒的組合，投入了IAA這種植物激素，并在浸染條件、水稻遺傳轉化中使用的各種溶液等方法分別進行了優化，最終提升了水稻遺傳轉化效率與質量，這對于提升產量、改善品質、增強抗逆性降低成本、保障糧食安全及推動農業可持續發展等多個方面均有重要現實意義。

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