膠原/羧甲基殼聚糖納米復合纖維基水凝膠的制備及其性能

中圖分類號：O636 文獻標志碼：A

Abstract：Collagen （COL）/carboxymethyl chitosan （CMCS） nanofibrous composited hydrogels were prepared by blending collagen and CMCS at various COL σ： CMCS ratios and subsequent self-assembly. Carboxyl and hydroxyl groups of CMCS were successively interacted with amide groups of collagen via hydrogen bonds，which were the dominated interaction. Then the electrostatic interaction occurred between carboxylate of CMCS and basic amino acid residues of collagen. With increasing CMCS content，the binding stability of CMCS with collgen and collagen self-assembly property firstly increased and then decreased. At a COL ： CMCS ratio of 4：6 ，the collagen self-assembly was optimal，and the formed nanofibrils with D-period possessed larger diameters. Therefore，the composited nanofibrils had better stability，and the properties of the composited nanofibrous hydrogels were improved.For example，thermal denaturation temperature of the composited hydrogel was higher than that of pure collagen;additionally，the swelling ratio and degradation degree were 14930.4% （2號 ±340.7% and 53.4%±2.9% ，respectively. The material has potential application prospects in the field of wound dressings and drug carriers.

Key words：collagen; carboxymethyl chitosan; composited nanofibrous hydrogel; self-assembly

0 引言

水凝膠是一類通過化學或物理交聯形成的網絡凝膠，能夠將水分子束縛在空間網絡中而保留水分，具有類細胞外基質的結構，在生物醫學工程領域有著廣泛的應用1.根據原材料的不同，水凝膠可以分為天然高分子水凝膠和合成高分子水凝膠.其中，天然高分子水凝膠多為蛋白質水凝膠和多糖水凝膠，具有良好的生物相容性、生物活性和可生物降解性[2].

膠原作為細胞外基質的主要成分，所具有的三股螺旋結構賦予其低抗原性、生物相容性、促細胞增殖分化、凝血作用等優異的生物學功能[3].近年來，膠原基水凝膠在生物醫學等領域呈現出令人矚目的應用前景.快速制備膠原水凝膠的方法主要是利用膠原的自組裝性能，即在模擬生理條件，溶液中的膠原分子軸向延伸、側向聚集進行有序排列自組裝形成膠原納米纖維4]；同時納米纖維相互纏結形成網狀結構并將溶液中的溶劑束縛在其內部使溶劑不能自由流動，隨之膠原溶液轉變為膠原水凝膠.與膠原分子相比，膠原納米纖維基材料的微觀結構與組織中的膠原更為相似，因此產生炎癥的幾率較低且降解速度較慢，易與細胞混合，更利于其在生物醫學領域的應用[5].然而，純膠原水凝膠的熱穩定性較差且降解速率過快，限制了其應用[]，因此通常需要對其改性.目前，常用的改性方法包括化學交聯和共混改性；其中，共混改性是將膠原與其他高分子材料共混，融合兩種材料的優點，此方法避免了外源性交聯劑引人對材料生物相容性的不利影響.

天然多糖（如纖維素、殼聚糖、硫酸軟骨素等）作為一類天然高分子，含有羥基、羧基等官能團，能夠與膠原之間形成氫鍵或靜電作用[8]，從而改善膠原的性能.羧甲基殼聚糖（CMCS）是水溶性殼聚糖衍生物，具備止血、促傷口愈合和抑菌等作用，廣泛應用于水凝膠和創傷類生物材料中[9-1].Lin等[12]以膠原、CMCS和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽為原料，通過化學交聯法制備了水凝膠；該材料具有良好生物相容性且利于細胞增殖.目前關于膠原和CMCS基水凝膠的研究集中在膠原分子而非膠原納米纖維組成的膠原基材料.此外，天然多糖的種類和濃度均會對膠原的自組裝性能產生不同的影響[13，14].

綜上，本研究首先重點分析CMCS對膠原自組裝性能及復合納米纖維穩定性的影響，進而制備膠原/CMCS納米復合纖維基水凝膠，并考察其熱穩定性、耐酶解性等.由于該水凝膠具有良好的纖維狀結構，與人體組織更為相似，生物相容性更佳，因此在傷口敷料及藥物載體等生物醫學領域具有潛在的應用價值.

1實驗部分

1. 1 實驗材料與主要儀器

1. 1. 1 主要試劑

牛皮I型膠原海綿，實驗室自制；CMCS，分析純，上海麥克林科技有限公司；氯化鈉、二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉等，分析純，廣東光華科技有限公司.

1. 1. 2 主要儀器

TU-1900紫外可見分光光度儀，北京譜析通用儀器有限責任公司；Vertex7O傅里葉變換紅外光譜儀，德國布魯克公司；Agilent5100原子力顯微鏡，美國Agilent公司；DSC200P3差示掃描量熱儀，德國Netzsch公司.

1.2膠原/羧甲基殼聚糖（CCS）納米復合纖維基水凝膠的制備

將膠原海綿剪碎后在 4C 下溶于磷酸鹽緩沖液（PBS，0.0l mol/L Na₂ HPO₄ /NaH2 PO₄+ 0.125mol/LNaCl，pH～7.4） 中，制得膠原溶液.CMCS溶于PBS緩沖液中制得不同濃度的CMCS溶液.將膠原溶液和不同濃度的CMCS溶液等體積共混，使得膠原與CMCS的質量比（COL：CMCS）分別為 10：0.8：2.6：4.5：5.4：6 和2：8：4 °C 下預孵化 24h 后得到膠原/CMCS（CCS）復合溶液；隨后于 37° 下孵化，促使CCS復合溶液自組裝形成納米復合纖維并包裹溶劑制得CCS納米復合纖維基水凝膠（如圖1所示），依次命名為COL、CCS-82、CCS-64、CCS-55、CCS-46、CCS-28.

圖1膠原/羧甲基殼聚糖納米復合纖維基水凝膠的制備示意圖

1.3CCS納米復合纖維基水凝膠的表征

1.3.1 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）

將CCS水凝膠于室溫下風干成膜，用去離子水多次洗滌除鹽，再次風干.利用傅立葉變換紅外光譜儀采集水凝膠的紅外譜圖，波數范圍為4000～400cm^-1 ，分辨率為 4cm^-1 .對數據進行5點平滑、基線校正和歸一化處理后，采用軟件2Dshige（Kwansei Gakuin 大學 Shigeaki Morita 和 Yuki-hiroOzaki編寫）計算生成二維相關數據，繪制以CMCS用量為外擾的二維紅外相關圖譜.

1.3.2 膠原自組裝動力學測定

采用濁度法研究CMCS對膠原自組裝動力學的影響[15].配制 2mg/mL 的膠原溶液，并與不同濃度的CMCS溶液 （C_cucs=0.5mg/mL.1.33mg/mL， 2mg/mL.3mg/mL.8mg/mL） 同體積共混，在 4C 下預孵化 24h 后得到CCS復合溶液；隨后將其倒入石英比色皿中，立即置于 37° 并采用紫外可見分光光度計記錄 313nm 處的吸光度即濁度與時間（ 0～ 60min） 的關系，繪制自組裝動力學曲線.

1.3.3 CCS水凝膠的微觀形貌

取 10μL CCS水凝膠滴于新剝離的云母片上，室溫風干后采用原子力顯微鏡以輕敲模式觀測其纖維形貌，分辨率為 512×512 pixel，掃描速率為 1Hz. 每個樣品至少觀察3個不同的位置以確定形貌的一致性.

1.3.4 CMCS與膠原的結合穩定性

配制濃度為 0. 05mg/mL，0. 1mg/mL，0. 2 mg/mL0.3mg/mL0.4mg/mL0.5mg/mL 的CMCS溶液，并用分光光度計在 190～350nm 波長范圍內掃描，確定CMCS溶液的最大吸收波長為 205nm .在該波長下測定不同濃度CMCS溶液的吸光度并繪制標準曲線，如圖2所示.

圖2CMCS溶液吸光度與濃度的標準曲線

根據1.3.2節制備 5mLCCS 復合溶液，于 37° 下恒溫 2h 制得CCS水凝膠，離心獲取沉淀即CCS納米復合纖維.將納米纖維浸泡在PBS緩沖液中并監測不同浸泡時間下PBS緩沖液在 205nm 處的吸光度.根據標準曲線計算PBS緩沖液中CMCS的濃度并通過公式（1）計算CMCS與膠原的結合率，用于考察CMCS與膠原之間的結合穩定性[16].

P（%）=（1-c_tV/m）×100

式（1）中： c_t 是 t 時刻PBS緩沖液中CMCS的 濃度； V 是PBS緩沖液的體積； m 為樣品中CMCS 的初始質量.

1.3.5 CCS納米復合纖維的穩定性

將CCS水凝膠置于 4C 或 46^°C 的環境中，分別恒溫 72h 和 ¹h ，測定恒溫前后水凝膠的吸光度，分別記為 A₀ 和 A_f ；通過公式（2）計算吸光度降低百分率，用以評估CCS納米復合纖維的低溫穩定性和高溫穩定性.

ΔA（%）=（1-Af/A₀）×100

1.3.6 CCS水凝膠的熱穩定性

配制 10mg/mL 膠原溶液，并與不同濃度的CMCS溶液 C_CMCS=2.5mg/mL，6.67mg/mL，5mg/mL. 15mg/mL.40mg/mL） 同體積共混， 4° 下預孵化24h 并于 37° 下恒溫 2h 得到CCS水凝膠.準確稱取凍干CCS水凝膠（ ～5mg 并將其密封于鋁坩蝸中，使用空坩蝸作為參比.在氮氣保護下掃描樣品，溫度變化范圍 30°～150° ，升溫速率為

1.3.7 CCS水凝膠的溶脹性能

將1.3.6中所制得的純膠原水凝膠和CCS水凝膠于室溫 （～25°C） 下浸泡在超純水中 ^72h ，早晚換水，然后用濾紙輕輕吸干水凝膠表面的水份，稱量記為 m₁ ；再將水凝膠冷凍干燥成海綿，稱量記為 m₀ .根據公式（3）計算溶脹率，每個樣品做三個平行并取平均值作為水凝膠的溶脹率.

1.3.8 CCS水凝膠的耐酶解性

將膠原酶 （～125U/mg） 溶于含有 0.36mmol/L CaCl₂ 的50 mmol/L Tris/HCl緩沖液 （pH 7， 4） 中，配制酶活為 50U/mL 的酶解液.將1.3.6中所制得的純膠原水凝膠及CCS水凝膠準確稱?。ㄙ|量記為 W₀ ）后浸泡于 3.0mL 上述酶解液中， 37° 下酶解 5h 后取出凝膠并用濾紙吸去其表面的水分，稱重記為 W₁ .通過公式（4）計算降解率.每個樣品做三個平行樣，取平均值作為水凝膠的降解率.

Degradation degree （%）=（1-W₁/W₀）×100 （4）

2 結果與討論

2.1 CCS水凝膠的FTIR分析

圖3為純膠原、CMCS和CCS的紅外譜圖.純膠原的特征吸收峰主要來源于酰胺鍵，分別為酰胺A、BII和III帶.其中， 3324cm^-1 和3072cm^-1 處的特征峰分別歸屬于 N-H （酰胺A帶）和C一H伸縮振動（酰胺B帶）； 1661cm^-1 處的吸收峰歸屬于酰胺I帶的 C=O 伸縮振動；1552cm^-1 處為酰胺II帶，與酰胺基中 N-H 變形和C-N 伸縮振動有關；酰胺III帶出現在1240cm^-1 左右，歸屬于 C-N 伸縮振動和 N-H 彎曲振動.以上特征峰的出現表明膠原具有完整的三股螺旋結構[17].

對于CMCS來說， 3498cm^-1 處的吸收峰來源于 N-H 和 O-H 伸縮振動； 1600cm^-1 處的吸收峰來源于－COOH的 c=o 伸縮振動[18]；1421cm^-1 和 1 318cm^-1 處的吸收峰分別來源于離子化羧基的 c-o 伸縮振動和未離子化羧基的O-H 彎曲振動[19]； 1080cm^-1 處的吸收峰歸屬于C-OH 伸縮振動[20].

引入CMCS后，膠原的酰胺I、II、III帶的峰位并未發生明顯移動，表明膠原的三股螺旋結構未受到影響[21]；但部分峰強度發生變化，推測膠原與CMCS之間存在相互作用，但通過一維紅外圖譜無法確定二者之間發生了何種相互作用.

圖3 CCS水凝膠的FTIR圖

采用二維紅外技術（2D-IR）進一步分析兩者之間的相互作用.圖4是不同膠原與CMCS比例所制備的CCS水凝膠的二維同步圖與異步圖.由圖4（a）可知，在 1690cm^-1，1600cm^-1，1525 cm^-1，1 421cm^-1，1 318cm^-1，1 240cm^-1 和1080cm^-1 處出現自相關峰.2D-IR可將一維圖譜中重疊的吸收峰分開，所以在二維紅外圖譜中出現了一些一維圖譜中未顯示的吸收峰.其中 1690cm^-1 和1525cm^-1 分別衍生于酰胺I帶 1661cm^-1 和酰胺Ⅱ帶 1552cm^-1[22] .交叉峰 Φ^{（1690，1600），Φ} （1525，1080）、 Φ（1 421，1 240） 等的出現表明所對應的結構間存在強烈的相互作用，推測膠原的酰胺鍵、堿性氨基酸殘基與CMCS羧基、羥基之間存在氫鍵結合或靜電作用[23]

為證實上述反應的可能性，對自相關峰的強度及各基團的響應順序進行分析.通過自相關峰的強度評估所對應結構對外擾即CMCS用量的敏感程度 ：1080cm^-1gt;1600cm^-1gt;1421cm^-1gt;1690| cm^-1gt;1 240cm^-1gt;1 525cm^-1gt;1 318cm^-1 ，可知CMCS的羥基和膠原的 C=O 結構變化較大，表明兩者間相互作用主要以氫鍵結合為主；同時，CMCS羧基上的 C=O 結構和膠原的 N-H 結構也存在一定的變化，說明兩者之間存在靜電作用.但CMCS羧基上的 O-H 結構變化很弱，分析主要原因是本實驗條件 （pH～7.4） 下大部分的羧基帶負電荷， -COOH 形成的氫鍵很少.

圖4CCS水凝膠的二維紅外同步和異步圖

結合同步圖與異步圖（如圖4（b）所示），根據野田規則[24]判斷吸收峰的響應順序（如表1所示）.膠原中各吸收峰的響應順序為 1 690cm^-1gt; 1 525cm^-1gt;1 240cm^-1 ，膠原的 C=O 結構最先響應；CMCS中各吸收峰的響應順序為 1 318cm^-1 gt;1 600cm^-1gt;1 080cm^-1gt;1421cm^-1 ，羧基上的羥基最先響應；換言之，CMCS首先通過羧基與膠原發生氫鍵結合；隨后 C=O 結構、羥基與膠原酰胺鍵形成氫鍵；最后羧酸根與膠原堿性氨基酸殘基發生靜電作用.

表1CCS水凝膠交叉峰的相關強度及變化順序

續表1

（20 1 690gt;1 525gt;1 318gt;1 600gt;1 080gt;1 421gt;1 240cm^-1

2.2CMCS含量對膠原自組裝性能的影響分析

圖5是4℃預孵化 24h 后， 37° 下膠原及CCS復合溶液的自組裝動力學曲線.由圖可知，膠原及CCS復合溶液的自組裝動力學曲線均呈“S”型，即其自組裝過程分為滯后期、生長期和平穩期三個階段[25].吸光度隨CMCS含量的提高呈現先增大后減小的趨勢.當 COL：CMCS=4：6 時，最終吸光度最高，表明其自組裝性能最佳，所形成的纖維數量和纖維成熟度較高.分析其主要原因是CMCS的存在使得膠原分子在預孵化期得到分散，增多了其滯后期的“成核\"數量，從而增加了膠原纖維數量；這一現象可通過預孵化 24h 后CCS復合溶液吸光度的增加得到驗證；此外，CMCS與膠原之間存在靜電作用，降低了膠原表面的電荷量，亦可促進膠原納米纖維的形成[26.然而，當CMCS含量繼續增加時，大量CMCS會產生排空體積效應，引起膠原分子的聚集，滯后期成核數量減少，導致所形成的纖維數量減少，表現為預孵化后及 37^°C 下孵化后的吸光度均降低.

圖5 37° 下膠原及CCS復合溶液的自組裝動力學曲線

2.3 CCS水凝膠的微觀形貌

利用原子力顯微鏡（AFM觀察膠原及CCS水凝膠的微觀形貌.如圖6所示，膠原水凝膠（COL）由互相纏結的膠原纖維組成.當COL：CMCS?4：6 時，隨CMCS含量的增多膠原纖維變粗、成熟度更高并且能夠觀察到明顯的D周期明暗條紋（紅色箭頭標記），證實CMCS的加入可以促進膠原的自組裝，與自組裝動力學實驗結果一致；當CMCS的含量繼續增大時，CMCS自身團聚引起的排空體積效應使得膠原纖維成熟度降低即纖維變細，而且纖維表面堆積了大量的CMCS團聚體.

圖6CCS水凝膠的AFM圖（尺寸：

2.4CMCS與膠原結合穩定性分析

為了進一步分析CMCS在膠原自組裝過程中的作用，考察CCS復合纖維中CMCS與膠原的結合穩定性.如圖7所示，離心后CCS復合纖維中CMCS與膠原的初始結合率隨CMCS含量的增加呈先上升后降低的趨勢.當 COL：CMCS= 4：6 時，兩者的初始結合率最高，為 99.63%± 0.34% ：

PBS中浸泡1天后CCS納米復合纖維中的CMCS結合率均顯著下降； 2～5 天緩慢下降；5天后變化很小.主要原因是CMCS具有良好的親水性，浸泡于PBS中后復合纖維中吸附在膠原纖維表面或與膠原結合較弱的CMCS會被逐步洗脫出來.未被洗脫的CMCS與膠原之間存在較強的相互作用，被包裹在復合納米纖維內部.

CCS復合纖維中CMCS的剩余結合率依次為86. 08%±1. 32%.86. 52%±2. 14%.87. 40%± 0.92%.90.00%±0.05% 和 85.32%±0.14% ，說明隨著CMCS用量的增多可以提高其與膠原之間的相互作用，靜電作用的增強消耗膠原的帶電氨基酸殘基，從而促進了纖維的形成；然而，CMCS用量過多不能提升其與膠原的結合，反而會由于自身的團聚作用對膠原的自組裝產生不利影響.此外，PBS浸泡2天后，CCS-46中CMCS的結合率已經無明顯變化，亦可證實此比例下，纖維中CMCS與膠原的結合作用最穩定.

圖7浸泡于PBS中若干天后CCS納米復合纖維中CMCS的結合率

2.5CCS納米復合纖維的穩定性

表2是膠原及CCS水凝膠置于 4C 和 下吸光度的下降率.經低溫或高溫處理后，CCS水凝膠的吸光度均發生降低，主要是由于CCS納米復合纖維發生解離.隨COL：CMCS的減小即CMCS用量的增加，CCS納米復合纖維的低溫和高溫穩定性均呈先升高后降低的趨勢，但吸光度下降率均小于純膠原水凝膠，說明CMCS的加入有利于膠原水凝膠的穩定，尤其是當 COL：CMCS= 4：6 時，其吸光度下降率僅為 25.38% 和 25.79% ，遠低于純膠原纖維的吸光度下降率，表現為最佳的低溫和高溫穩定性.

表2膠原及CCS水凝膠置于 sc 和46^°C 下吸光度的下降率

2.6 CCS水凝膠的熱穩定性

圖8是膠原及CCS水凝膠的DSC曲線，吸收峰的峰值定義為熱變性溫度（ ?T_d ），反映了材料的穩定性[27].CMCS引人后，水凝膠的 T_d 值均升高即熱穩定性得到改善.結合水凝膠的微觀形貌分析，當加入少量CMCS時，即 COL：CMCS=8：2 時，納米復合纖維直徑變粗且纖維間纏繞更加緊密，因此 T_d 值顯著升高了 11.8°C .繼續增加CMCS，纖維的直徑以及纏結緊密度變化不明顯，所以 T_d 值增加緩慢；當 COL：CMCS=4：6 時，復合水凝膠的 T_d 值達到 76. 1° ，比純膠原高 .CMCS含量繼續增多時，纖維變細且數量變少，水凝膠的網狀結構穩定性降低，因此 T_d 值降低至 60.1^c

圖8膠原及CCS水凝膠的DSC曲線

2.7 CCS水凝膠的溶脹性能

溶脹率是評價水凝膠吸收液體能力的一個重要指標.膠原及CCS復合水凝膠的溶脹性能如圖9所示.由圖可知，CCS水凝膠的溶脹率在 12 000%～ 15 000% ，表明其具有良好的吸水性.當COL：CMCS?4：6 時，水凝膠的溶脹率持續增長，最高達到 14930.4%±340.7% ，主要是由于CMCS具有優良的親水性[28]，加人體系后使得復合水凝膠的親水性進一步提升；此外，隨著CMCS引入量的增多，復合水凝膠中納米纖維變粗且數量增加，導致網絡結構較為緊密，可將更多的水分包裹在水凝膠內部.當 COL：CMCS=2：8 時，水凝膠的網狀結構穩定性下降且CMCS與膠原的結合穩定性變差，在實驗過程中CMCS被洗脫出來，水凝膠的親水性提高有限且由于CMCS的損失會導致其溶脹率有所降低.

圖9膠原及CCS水凝膠的溶脹性能2.8CCS水凝膠的耐酶解性能

圖10為膠原及CCS水凝膠的酶降解率.由圖可知，純膠原水凝膠的酶降解率最大，為 96.1%± 1.1% .隨著CMCS用量的增加，酶降解率先減小后增大，當 COL：CMCS=4：6 時酶降解率最低為 53.4%±2.9% ，說明此比例下CCS水凝膠的耐酶解性能最佳.膠原酶的作用位點是膠原螺旋區域的Gly和Leu之間的肽鍵[29]，CMCS引入后膠原纖維的穩定性得到改善且水凝膠的網絡結構更加緊密，導致空間位阻增加，抑制了膠原酶向斷裂位點的擴散以及進一步的降解作用[30].而當COL：CMCS=2：8 時，納米復合纖維變細且水凝膠的網絡密度有所減少，酶易進入網絡內部發生作用，導致其耐酶解性能降低.

圖10膠原及CCS水凝膠的酶降解率

3結論

基于膠原與羧甲基殼聚糖（CMCS）制備納米復合纖維基水凝膠，并重點分析兩者間的相互作用、膠原的自組裝性能及復合水凝膠的性能.膠原與CMCS兩者間主要發生氫鍵結合與靜電作用.

當 COL：CMCS≥4：6 時，兩者間結合穩定性逐步增強，膠原自組裝性能被促進，所形成的納米復合纖維數量增多且變粗，水凝膠中纖維纏結所形成的網狀結構更加緊密，因此纖維穩定性及復合水凝膠性能均得到提升.當 COL：CMCSlt;4：6 時，由于CMCS的團聚，兩者間的結合作用減弱，且所產生排空體積效應導致所形成的納米復合纖維變細，水凝膠的網狀結構穩定性下降，因此水凝膠的各方面性能降低.

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【責任編輯：陳 佳】