羅伊氏粘液乳桿菌培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化研究

中圖分類號：TS201.3 文獻標志碼：A

Abstract：In the industrialized cultivation of microorganisms，the optimization of culture medium components and culture conditions is crucial for achieving eficient production. This study selected Limosilactobacillus reuteri CGMCC 24755 as the research object and used MRS medium as the basal medium. The components of the culture medium were optimized using a combination of single-factor experiments and response surface methodology. Initially，the effects of different types and concentrations of carbon sources，nitrogen sources，buffer salt systems，and growth factors on the growth of the strain were investigated using OD6OO as the evaluation index. Based on the results of the single-factor experiments，the optimal ratios were determined using response surface analysis. The optimal formulation for L.reuteri CGMCC 24755 was obtained as follows： 37.8g sucrose，38.8 g soy peptone， 2.5g sodium citrate， 1g citric acid， 60mg L-cysteine hydrochloride， 5g beef extract， 4g yeast extract， 0.2g （204號 magnesium sulfate， 0.05g manganese sulfate，and 1mL Tween 8O，all dissolved in 1L of distilled water. Through the optimization of culture conditions，the experimental results showed that when the initial pH of the culture medium was 5.3，the inoculation amount was 10% ， and the culture was conducted anaerobically at 37^cC for 8 hours，the OD6oO of the bacterial cells reached 1.588.The biomass concentration increased by 2.O78 times compared to that before optimization，providing a theoretical basis for the industrial fermentation of L .reuteri CGMCC 24755.

Key words： Limosilactobacillus reuteri ; response surface methodology; medium optimization；optimization of culture conditions

0 引言

羅伊氏粘液乳桿菌主要存在于哺乳動物腸道中對廣泛的pH環(huán)境與消化系統(tǒng)具有較強的耐受力[.我國衛(wèi)生部于2003年將羅伊氏粘液乳桿菌列為人類保健品的益生菌，其安全性以獲得廣泛認同[2].研究表明，羅伊氏粘液乳桿菌能夠產(chǎn)生羅伊氏菌素，對多種致病微生物均表現(xiàn)出顯著的抑制作用3.此外，多項研究表示羅伊氏粘液乳桿菌對多種疾病具有潛在益處，例如清除幽門螺旋桿菌[4，5]、改善腸道屏障功能[6-8]、降低膽固醇水平[9]、抑制炎癥反應(yīng)[10.11]、調(diào)節(jié)機體免疫調(diào)節(jié)功能[12]、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)[13].本團隊前期從母乳喂養(yǎng)嬰兒糞便樣本中分離篩選出一株具有高產(chǎn)吲哚衍生物的羅伊氏粘液乳桿菌，具有免疫調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)腸道菌群的功能[14]，在保健食品和乳品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景.

隨著越來越多優(yōu)質(zhì)益生菌資源不斷被發(fā)現(xiàn)，不同益生菌的營養(yǎng)成分的需求具有高度特異性，而通用的培養(yǎng)基配方難以滿足其獨特的營養(yǎng)需求，因此需要針對不同菌種進行個性化優(yōu)化[15」.

雖然單因素實驗和響應(yīng)面優(yōu)化對于開發(fā)新型培養(yǎng)基配方屬于常規(guī)優(yōu)化方法，但也存在實驗分組多，周期長，效率低等缺點，而Box-Behnken（BBD）實驗是一種三水平的部分因子設(shè)計，能夠在較少的實驗次數(shù)內(nèi)同時考察多個變量及其交互作用，顯著提高了實驗效率[16].且BBD不包含變量的極端組合，實驗條件更加溫和，避免了極端環(huán)境對菌體生長或產(chǎn)物合成產(chǎn)生負面影響，從而提高了實驗的安全性和可操作性[17].BBD通過建立數(shù)學模型和回歸方程，能夠更準確地預測和優(yōu)化目標值，例如，在暹羅芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化中，BBD結(jié)合二次回歸模型，成功優(yōu)化了培養(yǎng)基成分，使大環(huán)內(nèi)酯產(chǎn)量較通用LB培養(yǎng)基顯著提高9.48倍[18].BBD還能夠處理復雜的多因素體系，適用于工業(yè)化生產(chǎn)中的優(yōu)化需求.例如，在球等鞭金藻培養(yǎng)條件優(yōu)化中，BBD通過多因素交叉實驗，優(yōu)化了溫度、鹽度和接種量等條件，顯著提高了藻類的比生長速率，最大可達 0.44d^-1[19] .綜上所述，BBD在優(yōu)化培養(yǎng)基方面具有高效、精確、低成本和適應(yīng)復雜體系等優(yōu)勢，能夠顯著提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量，為羅伊氏粘液乳桿菌工業(yè)化生產(chǎn)提供了有力支持.

本研究首先利用單因素實驗和響應(yīng)面BBD優(yōu)化實驗確定最佳培養(yǎng)基配方，接下來對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，得到最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件.本研究不僅為羅伊氏粘液乳桿菌工業(yè)發(fā)酵和高密度培養(yǎng)提供基礎(chǔ)信息，也為高效培養(yǎng)基設(shè)計提供一種優(yōu)化解決方案.

1材料與方法

1. 1 實驗原料

1. 1.1 材料與菌株

葡萄糖、麥芽糖購于西隴科學股份有限公司；魚蛋白陳、大豆蛋白陳、玉米漿干粉、麥芽糊精購于北京鴻潤寶順科技有限公司；無水硫酸鎂購于天津博迪化工股份有限公司； VB₁ ！ VB₂ ！ VB₃ ！ ΔVB₆ ！VC、L-半胱氨酸鹽酸鹽購于文蔚生物科技有限公司；酵母粉、牛肉粉均購于北京奧博星生物技術(shù)公司；乳糖、四水硫酸錳、 Na₂HPO₄ ！ NaH₂ （20號 PO₄ 、 K₂ HPO₄ 均購于天津市科密歐化學試劑有限公司；蔗糖購于山東科源生化有限公司；甘油、乙酸鈉、檸檬酸銨、吐溫80、檸檬酸鈉、 KH₂PO₄ 均購于天津市天力化學試劑有限公司；檸檬酸購于上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司；蛋白肺購于牛津有限責任公司.以上試劑均為分析純.

羅伊氏粘液乳桿菌CGMCC24755（ L .reuteriCGMCC24755）為本實驗室前期分離自母乳喂養(yǎng)健康嬰兒的糞便樣本.

1.1. 2 培養(yǎng)基

（1）MRS培養(yǎng)基： _10.0g 蛋白脈、 5.0g 牛肉粉、 .20.0g 葡萄糖、 .4.0g 酵母粉、 .2.0g 檸檬酸銨、2.0g 磷酸氫二鉀、 5.0g 乙酸鈉 ?0.05g 硫酸錳、0.2g 硫酸鎂、 1mL 吐溫80、將以上成分加人 1L 蒸餾水中.

（2）MRS瓊脂培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中 添加 15g/L 的瓊脂.

1.2主要儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHG-303-4B電熱恒溫培養(yǎng)箱，浙江力辰儀器科技有限公司；厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)，Gene-Sci-enceScientificInstruments，Inc，USA;MX-S渦旋混勻儀，大龍興創(chuàng)實驗儀器股份公司；101-2B電熱鼓風恒溫干燥箱，紹興市蘇珀儀器有限公司；XFH-40CA電熱式壓力蒸汽滅菌器，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；Eon酶標儀，美國博騰儀器有限公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

將一 條件下保藏的L.reuteriCGMCC24755菌株在MRS瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)， 37° 厭氧培養(yǎng) 24h ，挑取單菌落接種于液體MRS培養(yǎng)基中， 37° 恒溫培養(yǎng) ^12h ，以 2% 接種量接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng).

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基成分單因素實驗

分別選擇不同的碳源、氮源、緩沖鹽體系及生長因子作為菌株生長的主要影響因素，通過單因素試驗篩選出最適合菌株生長的營養(yǎng)物質(zhì)組合，為后續(xù)的響應(yīng)面實驗奠定基礎(chǔ).以 2% 的接種量接種菌株，于 37° 條件下進行厭氧培養(yǎng)，根據(jù)菌株 24h 時 OD₆₀₀ ，確定各因素的最佳選擇.

（1）最佳碳源的確定

分別以蔗糖、乳糖、麥芽糖、麥芽糊精和甘油作為MRS培養(yǎng)基中葡萄糖的替代碳源，添加量與原始培養(yǎng)基中的碳源含量保持一致，其他成分不變.

（2）最佳氮源的確定

分別以大豆蛋白肺、玉米槳干粉、魚蛋白肺作為MRS培養(yǎng)基的替代氮源，添加量與原培養(yǎng)基中的氮源含量保持一致，其他成分不變.

（3）最佳緩沖鹽體系的確定

以 Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ 、檸檬酸/檸檬酸鈉、乙酸鈉/檸檬酸鈉/ ^'K₂HPO₄ 、 KH₂PO₄/Na₂HPO₄ 四種組合替代MRS中的緩沖鹽體系，添加量與原培養(yǎng)基中的緩沖鹽含量相同，其他成分不變，

（4）最佳生長因子的確定

在MRS培養(yǎng)基中分別加人 20mg/LVB_i ！VB₂ 、 VB₃ ！ VB₆ 、VC、L-半胱氨酸鹽酸鹽，其他成分保持不變.篩選出最適生長因子后，進行濃度篩選.

其中，維生素先使用無菌濾膜進行過濾除菌，隨后在無菌條件下添加至培養(yǎng)基中.

1.3.3 Box-Behnken實驗設(shè)計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果按照表1所示選取A：碳源（蔗糖含量 % ），B：氮源（大豆蛋白陳含量 % ），C：緩沖鹽體系（檸檬酸鈉/檸檬酸含量 % ），運用De-signExpert軟件中的Box-Behnken（BBD）設(shè)計對篩選得到的培養(yǎng)基成分含量進行優(yōu)化，以培養(yǎng) ⁶h 的 OD₆₀₀ 為評價指標，設(shè)計三因素三水平共17點的響應(yīng)面分析.

表1Box-Behnken實驗因素與水平設(shè)計

1.3.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化

基于優(yōu)化后的培養(yǎng)基，進一步對培養(yǎng)條件進行系統(tǒng)優(yōu)化，包括培養(yǎng)基初始 ΔpH 值、培養(yǎng)溫度以及接種量.通過評估不同培養(yǎng)條件下菌株 8h 的OD₆₀₀ ，從而確定最佳培養(yǎng)條件.

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert13，GraphPad 1O.1.0，SPSS26.0等軟件對數(shù)據(jù)進行分析，并采用SPSS軟件的ANOVA方法對結(jié)果進行單因素方差分析， ρlt;0.05 表示樣品間具有顯著性差異.

2 結(jié)果與討論

2.1單因素實驗結(jié)果

2.1.1 培養(yǎng)基的碳源優(yōu)化結(jié)果

碳源作為微生物生長與繁殖過程中的關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)，不僅為微生物細胞結(jié)構(gòu)構(gòu)建提供物質(zhì)基礎(chǔ)，還在其繁殖代謝過程中供應(yīng)必要的能量[20].選擇適宜的碳源，會顯著提高乳酸菌對碳源的利用率，降低能耗，進而促進菌體增殖[21].本研究以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過替換不同碳源進行發(fā)酵培養(yǎng)實驗.

圖1（a）展示了L.reuteriCGMCC24755對不同碳源物質(zhì)的利用情況.其中蔗糖對菌濃的促進作用最強；其次為乳糖和麥芽糖；而麥芽糊精、甘油的促進作用較弱.這可能是因為蔗糖、乳糖和麥芽糖是雙糖，容易被微生物分泌的酶分解為單糖，進而被菌體快速吸收利用.麥芽糊精是由多個葡萄糖單元組成的多糖，分解速度較慢，導致菌體利用效率較低.甘油雖然是小分子物質(zhì)，但其代謝途徑與糖類不同，可能無法高效提供能量或碳骨架，因此對菌體生長的促進作用較弱.因此，本研究確定蔗糖為最佳碳源，進一步對蔗糖的添加量進行優(yōu)化.

由圖1（b）可知，隨著蔗糖添加量的增加，菌體密度逐漸增加，在蔗糖添加量為 3.5% 達到最佳，之后隨著添加量增加呈下降趨勢，這可能是由于高濃度碳源形成高滲透壓環(huán)境，抑制了菌體的生長，最終選取 3%.3.5%. 4% 作為響應(yīng)面的水平.

圖1L.reuteriCGMCC24755優(yōu)化碳源生長曲線2.1.2培養(yǎng)基的氮源優(yōu)化結(jié)果

微生物在繁殖過程中會合成蛋白質(zhì)、核酸等關(guān)鍵生物大分子，這一過程氮元素必不可少[22].氮源能夠提供種類豐富且結(jié)構(gòu)復雜的營養(yǎng)物質(zhì)，不僅能夠滿足菌體生長的基本需求，還能顯著促進其代謝活動及增殖效率.

圖2（a）反映了L.reuteriCGMCC24755對不同氮源物質(zhì)的利用情況.其中大豆蛋白肺對該菌株菌體密度的促進作用最顯著；其次為魚蛋白陳和玉來漿粉；利用能力較弱的為胰蛋白脈.可能是大豆蛋白陳富含多肽、氨基酸等有機氮化合物，更能夠被L.reuteriCGMCC24755分解并利用，進而轉(zhuǎn)化為微生物生長所需的蛋白質(zhì)、核酸等含氮生物大分子，滿足其生長過程中對氮元素的大量需求.

接下來，本研究對大豆蛋白肺的添加量進行優(yōu)化，結(jié)果如圖2（b）所示，隨著大豆蛋白脈添加量的增加，菌體密度逐漸增加，當添加量超過 3% 時，菌體密度開始降低.最終選擇添加量為 2.5% 、 3% 、4% ，進行后續(xù)實驗.

圖2 L.reuteriCGMCC24755優(yōu)化氮源生長曲線2.1.3培養(yǎng)基的緩沖鹽體系優(yōu)化結(jié)果

在菌體生長和繁殖過程中，酸性代謝產(chǎn)物的積累會顯著降低菌體的存活率，而緩沖鹽體系能夠減輕因酸性代謝物其對菌體生長的抑制作用.此外，緩沖鹽還可以調(diào)節(jié)細胞的滲透壓平衡[23].

圖3（a）反映了L.reuteriCGMCC24755在加入不同緩沖鹽體系培養(yǎng)基中的生長情況.其中檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖鹽對菌體的促進生長效果最好.原因可能是檸檬酸鈉是一種弱酸強堿鹽，與檸檬酸配伍可組成較強的pH緩沖劑，能夠維持培養(yǎng)環(huán)境的相對穩(wěn)定，避免pH值的大幅波動.此外，檸檬酸是微生物代謝中的重要中間產(chǎn)物，參與三羧酸循環(huán)，能夠為菌體提供碳源和能量.檸檬酸鈉在水解后可釋放檸檬酸，進一步促進菌體的代謝活動[24].因此選定該緩沖鹽體系繼續(xù)濃度因素的探究.

由圖3（b）所示的濃度篩選結(jié)果可知，L.reu-teriCGMCC24755菌體生長隨著添加量的增加，菌體密度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，最佳緩沖鹽的添加量為 0.1% ，其次為 0.05% 和 0.4%

圖3 L.reuteri CGMCC 24755優(yōu)化緩沖鹽體系生長曲線

2.1.4培養(yǎng)基的生長因子優(yōu)化結(jié)果

生長因子是微生物無法利用碳源和氮源自身合成，需要通過外界攝取，對生命活動至關(guān)重要，但需要量極少[25].本研究選擇VC、B族維生素和L-半胱氨酸鹽酸鹽作為該菌株的潛在生長因子.根據(jù)圖4（a）可知，與MRS培養(yǎng)基相比，L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加對L.reuteriCGMCC24755生長的提升具有顯著促進作用.L-半胱氨酸鹽酸鹽是一種含硫氨基酸，能夠直接參與蛋白質(zhì)合成，為菌體提供必需的氨基酸.L-半胱氨酸鹽酸鹽具有還原性，可以作為還原劑在培養(yǎng)基中發(fā)揮作用，能夠除去環(huán)境中的游離氧，降低氧化還原電勢，從而有利于厭氧菌的增菌培養(yǎng).這種特異性作用使其在菌種的培養(yǎng)中表現(xiàn)出優(yōu)于其他營養(yǎng)物質(zhì)的效果.

對L-半胱氨酸鹽酸鹽在培養(yǎng)基中的添加量進一步研究.圖4（b）反映出，在L-半胱氨酸鹽酸鹽的含量為 60mg/L 時，對菌體的生長促進作用最強，其次為 80mg/L 和 100mg/L

圖4 L.reuteri CGMCC 24755優(yōu)化生長因子生長曲線

2.2 Box-Behnken試驗結(jié)果與分析

碳源、氮源、緩沖鹽在菌株生長的培養(yǎng)基中起決定性作用，菌體生長速度與生長因子添加量的依賴關(guān)系微弱.所以選擇碳源含量（A）、氮源含量（B） 、緩沖鹽含量（C）為影響因素，以6h后的OD₆₀₀ （Y）為響應(yīng)值，進行三因素三水平的Box-Be-hnken響應(yīng)面分析，進一步優(yōu)化培養(yǎng)基的添加，得到的Box-Behnken試驗結(jié)果見表2所示.

表2Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

續(xù)表2

模型顯著性分析結(jié)果見表3所示.構(gòu)建的模型極顯著（ plt;0.001 ），模型的失擬項 p=0. 073 5 不顯著，表明模型在整個回歸區(qū)域內(nèi)具有良好的擬合度.由F值可知，影響 OD₆₀₀ 評價的因素大小為碳源添加量 gt; 氮源添加量 gt; 緩沖鹽添加量，即因素Agt;Bgt;C. 模型的確定系數(shù) R²=0.9940 ，進一步表明模型與實際情況擬合程度高，其校正系數(shù) R_adj²= 0.9864，這意味著二階回歸方程能夠解釋 98.64% 的響應(yīng)值變化.變化系數(shù)（CV越低，模型的預測誤差越小，說明模型的精確度和可信度越高[26]，本實驗 CV=3.38 表明試驗的可信度和精確度很好；精密度是有效信號與噪聲的比值，本試驗精密度達到31.1563遠高于4，進一步驗證實驗設(shè)計的合理性.

表3Box-Behnken試驗方差分析

由表3可知， AB 的 p 值為 0. 013 2lt;0. 05 ，表明 AB 交互作用顯著的，而 AC 的 Π_P 值為 0.803gt; 0.05，BC 的 Π_P 值為 0.880gt;0.05 表明 AC，AB 的交互作用均不顯著.這說明在實驗條件下，碳源和氮源的組合對響應(yīng)變量有顯著影響，而其他因素的交互作用影響較小.

對數(shù)據(jù)進行多項回歸分析，得出羅伊氏粘液乳桿菌CGMCC24755的菌體密度（式中用 Y 表示）與培養(yǎng)基中的碳源 A ，氮源 B ，緩沖鹽 C ，所構(gòu)成的回歸方程是： 0.0429C+0.0665AB+0.0413AC-0.0400BC- 0.4248A²-0.0546B²+0.0087C²

交互圖中的響應(yīng)曲面有最高的峰值，表明所選因素的范圍是可行的[27].響應(yīng)曲面坡度越陡，等高線呈橢圓形，則表示兩者交互作用顯著[28].由圖5可知，碳源 （A） 與氮源 （B） 交互作用響應(yīng)曲面圖較陡峭，等高線呈橢圓形，因此交互作用顯著；碳源（A） 與緩沖鹽 （C） ，無交互作用；氮源（B）與緩沖鹽（C） 無交互作用.這與方差分析結(jié)果一致.

用Designexpert軟件進行尋優(yōu)，得到最優(yōu)化條件為蔗糖 3.78135% 、大豆蛋白膚 3.8859% 緩沖鹽 0.097545% ，此時預測的響應(yīng)值 （6hOD₆₀₀ ）可達1.497.考慮到操作方便和實際生產(chǎn)，對模型取得的最佳工藝條件進行調(diào)整，調(diào)整后的工藝條件為蔗糖 3.78% 、大豆蛋白陳 3.88% 、緩沖鹽0.1% .在調(diào)整后的工藝條件下，進行驗證實驗，實驗重復三次，優(yōu)化后羅伊氏粘液乳桿菌 6hOD₆₀₀ 可達1.498，與模型預測值 6hOD₆₀₀ 為1.497之間無顯著性差異（ _pgt;0.05） ，說明了該模型的合理性和可靠性.優(yōu)化后培養(yǎng)基較MRS培養(yǎng)基 6hOD₆₀₀ 相比有極顯著差異 ?plt;0. 001 ），較MRS培養(yǎng)基OD₆₀₀ 提高0.909.

圖5兩兩交互作用對L.reuteriCGMCC247556h OD₆₀₀ 的響應(yīng)面圖

2.3最終優(yōu)化完成的培養(yǎng)基成分配方結(jié)果分析

通過響應(yīng)面實驗確定好最佳配方，再將篩選出的生長因子加入到優(yōu)化培養(yǎng)基中.最終培養(yǎng)基配方為： 37.8g 蔗糖、 38.8g 大豆蛋白肺、 .2.5g 檸檬酸鈉 .1g 檸檬酸、 60mgL^- 半胱氨酸鹽酸鹽、 5g 牛肉粉、 4g 酵母粉、 0.2g 硫酸鎂、 0.05g 硫酸錳、 1mL 吐溫80、將以上成分加入 1L 蒸餾水中.

按 2% 的接菌量，接人菌體至選定好的確定的優(yōu)化培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，置于 37° 條件下厭氧培養(yǎng)，測定 6hOD₆₀₀ .驗證在響應(yīng)面實驗優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，加上生長因子是否能夠進一步提高菌濃，實驗重復三次.結(jié)果表明，L.reuteriCGMCC24755在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，生長 ⁶h 后 OD₆₀₀ 可達1.511，較響應(yīng)面預測培養(yǎng)基提高0.013.

2.4培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果與分析

在不同培養(yǎng)條件下，L.reuteriCGMCC24755的菌體密度表現(xiàn)出顯著差異 （plt;0.05） .培養(yǎng)基初始pH是影響微生物生長的重要環(huán)境因素之_[29]．良好的胞內(nèi)外 pH 環(huán)境有助于微生物細胞的正常生長、蛋白質(zhì)的正確功能和結(jié)構(gòu)完整性，并支撐微生物發(fā)揮其功能30」.

由表4可知，當初始 pH 值為5.3時，菌濃最高.這表明，弱酸性環(huán)境更有利于該菌株的生長代謝，可能與菌株的酶活性及細胞膜穩(wěn)定性在特定pH 范圍內(nèi)的最佳表現(xiàn)有關(guān).

在實驗設(shè)定的溫度范圍內(nèi)，菌體密度隨溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，結(jié)果表明菌體生長的最適溫度為 37° .溫度過高可能導致菌體內(nèi)酶系統(tǒng)失活或細胞膜結(jié)構(gòu)受損，從而抑制菌體生長；而溫度過低則會降低菌體的代謝活性，延緩生長速率[31].

表4不同培養(yǎng)條件對L.reuteriCGMCC24755菌體密度的影響

注：角標含有相同字母的數(shù)據(jù)之間差異不顯著（ plt;0.05）

在此基礎(chǔ)上，進一步對接種量進行優(yōu)化，結(jié)果見表5所示.當數(shù)據(jù)顯示接種量為 10% 時，能夠顯著提高菌體密度并優(yōu)化生長效率.這是由于初始菌體數(shù)量較少，導致菌體在培養(yǎng)初期需要更長時間適應(yīng)環(huán)境并啟動對數(shù)生長期.

表5不同接種量對L.reuteriCGMCC24755菌體密度的影響

注：角標含有相同字母的數(shù)據(jù)之間差異不顯著（ plt;0.05）

綜合可知：L.reuteriCGMCC24755優(yōu)化培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基初始 pH5.3 ，培養(yǎng)溫度 37° ，接種量 10% ：

2.5培養(yǎng)條件優(yōu)化后的羅伊氏粘液乳桿菌的生長曲線

L.reuteriCGMCC24755在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng) 12h 到達穩(wěn)定期，到達穩(wěn)定期時 OD₆₀₀ 為0.764，而在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，相同條件下 OD₆₀₀ 為1.588.在優(yōu)化后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)8h到達穩(wěn)定期，到達穩(wěn)定期時 OD₆₀₀ 為1.588.

如圖6所示，經(jīng)過培養(yǎng)基優(yōu)化及培養(yǎng)條件調(diào)整后，L.reuteriCGMCC24755的菌體密度顯著高于未優(yōu)化條件下的培養(yǎng)結(jié)果，且其達到穩(wěn)定期的時間更短.在后續(xù)研究中菌株培養(yǎng)時間選定為 8h ，此時菌株既有旺盛的繁殖能力，又達到了最高菌體濃度，能夠縮短發(fā)酵周期，節(jié)約經(jīng)濟成本，提高經(jīng)濟效益.

圖6L.reuteriCGMCC24755的生長曲線

3結(jié)論

本研究以工業(yè)化生產(chǎn)為出發(fā)點，降低培養(yǎng)基成本和簡化生產(chǎn)工藝為目的，對 L .reuteri CGMCC24755菌株進行培養(yǎng)配方和條件進行優(yōu)化.本實驗以羅伊氏粘液乳桿菌 OD₆₀₀ 為研究對象，采用單因素與Box-Behnken優(yōu)化實驗相結(jié)合，探究蔗糖添加量、大豆蛋白脈添加量、緩沖鹽添加量對菌濃的影響，確定了最適培養(yǎng)基配方： 37.8g 蔗糖、 38.8g 大豆蛋白膚 ?2.5g 檸檬酸鈉、 .1g 檸檬酸、 60mgL^- 半胱氨酸鹽酸鹽 ?⁵g 牛肉粉、 4g 酵母粉、 .0.2g 硫酸鎂、 .0.05g 硫酸錳 ?¹mL 吐溫80、將以上成分加人 蒸餾水中.最優(yōu)發(fā)酵條件為：初始 pH5.3 .培養(yǎng)溫度 37° ，接種量 10% .通過優(yōu)化后 L .reu-teriCGMCC24755培養(yǎng) 8h 到達穩(wěn)定期， OD₆₀₀ 為1.588，且最終菌體質(zhì)量濃度較優(yōu)化前提高2.078倍.為羅伊氏粘液乳桿菌工業(yè)發(fā)酵和高密度培養(yǎng)提供研究基礎(chǔ).

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【責任編輯：蔣亞儒】