連翹葉黃芪發(fā)酵茶制備工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

中圖分類號(hào)：TS272；TS201.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Abstract： The aim of this study was to prepare the fermented tea by compound strain for relieving the bitter and cold properties of Forsythia suspense leaves，F(xiàn)orsythia suspensa leaves and Astragalus membranaceus were used as main raw materials and Lactobacillus bulgaricus and Lactobacillus plantarum were used as fermentation strains，high performance liquid chromatography was used to determine the contents of chlorogenic acid，rutin，forsythia suspensa glycoside A，F(xiàn)orsythia suspensa glycoside，and forsythia suspensa lipin in Forsythia suspensa leaves and Forsythia suspensa fermented tea，The content of the five components and in vitro antioxidant activity were compared，The results showed that the optimum preparation conditions of Forsythia suspensa fermented tea were 15g （20 Forsythia suspensa leaves，2.4 g Astragalus membranaceus ，and the bacterial strain accounted for 3.9% of the total mass，and then Lactobacillus bulgaricus and Lactobacillus plantarum accounted for 55% and 45% of the bacterial strains，respectively，Compared with Forsythia suspensa leaves， the contents of chlorogenic acid，rutin，F(xiàn)orsythia suspensa glycoside A and Forsythin in Forsythia suspensa fermented tea were lower and the Forsythiaside content was higher，The results of antioxidant activity showed that the scavenging rates of DPPH radical were 76.74% and 80.24% at the concentration of 8mg/mL ，respectively，This study provides a new way to alleviate the bitter and cold properties of Forsythia suspensa ，and provides a theoretical basis for the utilization of Forsythia suspensa resources and the development of fermentation products.

Key Words：Forsythia sus pense leaves; Astragalus membranaceus ; fermented tea; preparation technology;antioxidant activity

0 引言

連翹葉為木犀科植物連翹（Forsythiasus-pense（Thunb.）Vahl）的干燥葉，味苦，性微寒，夏、秋季采集，鮮用或曬干，主產(chǎn)于我國(guó)山西、河南、湖北以及陜西等省，為“五大商藥\"之一，具有清熱、解毒、清心和明目等功效[1·2].連翹葉含連翹脂素、蘆丁、連翹苷、連翹酯苷、綠原酸等活性成分[3，4]，具有抗氧化、抗病毒等多種藥理活性[5.6]，連翹酯苷等成分已被證實(shí)對(duì)新型冠狀病毒有抑制作用].2017年山西省頒布《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)-連翹葉》將連翹葉列入食品范疇8，但目前大部分連翹葉被丟棄，未得到有效利用，造成資源的浪費(fèi).黃芪（Astragalus membranaceus （Fisch.） Bge. var.mongholicus（Bge.）Hsiao）是一種常用中藥，含皂苷、多糖和黃酮類等多種活性成分，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗疲勞，抗腫瘤功效.黃芪性甘溫，具有補(bǔ)中益氣、脫毒利尿、生津養(yǎng)血的功效9.因此，本研究在連翹葉中添加黃芪及復(fù)合菌種，通過(guò)微生物發(fā)酵既改善連翹發(fā)酵茶的品質(zhì)，又能減少連翹葉苦寒性質(zhì)的成分而適應(yīng)于人體飲用[10，11].

本研究以感官評(píng)價(jià)和總黃酮、茶多酚含量為指標(biāo)，研究連翹發(fā)酵茶的最佳制備工藝，采用HPLC測(cè)定連翹葉和連翹發(fā)酵茶中綠原酸、蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷、連翹脂素含量，比較連翹葉和連翹發(fā)酵茶的5種成分含量，并研究二者的體外抗氧化活性.旨在開(kāi)發(fā)一款口感好、香氣佳的茶產(chǎn)品，以滿足大眾日常保健需要，同時(shí)為連翹葉資源的開(kāi)發(fā)利用提供參考.

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1. 1. 1 主要實(shí)驗(yàn)原料

連翹葉于2024年3月采自陜西省銅川市王石凹村；黃芪飲片購(gòu)買于陜西省西安市昱康醫(yī)藥店.

1. 1. 2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

綠原酸、蘆丁、沒(méi)食子酸、連翹酯苷A、連翹苷、連翹脂素對(duì)照品， HPLC?98% ，上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈，色譜級(jí)，西安三浦精細(xì)化工廠；植物乳桿菌（CICC20283）、德式保加利亞乳桿菌凍干粉（CICC20354），食品級(jí)，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）；MRS肉湯培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；亞硝酸鈉，硝酸鋁，無(wú)水乙醇，氫氧化鈉，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；DPPH，上海笛醫(yī)生物科技有限公司.

1. 1. 3 主要儀器及設(shè)備

BBS-V800 超凈工作臺(tái)，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；Waters2998型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；Varioskanfiash全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技有限公司；HGZF-101-2電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司； H-1850R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化與培養(yǎng)

（1）德式保加利亞乳桿菌的培養(yǎng)

MRS 肉湯培養(yǎng)基：精密稱取MRS 肉湯 48.3000g 加蒸餾水定容至 1 000mL，121C 滅菌 15min MRS固體培養(yǎng)基：精密稱取MRS肉湯 48.3000g ，加入瓊脂 20.0000g ，加蒸餾水定容至 1 000mL，121C 滅菌 15min 取適量菌粉于MRS液體培養(yǎng)基中， 37° ，150rpm/min ，培養(yǎng) 24h ，進(jìn)行第一次活化，以4% （v/v）接種量接人 100mL 液體培養(yǎng)基中， 37° 培養(yǎng) 24h ，進(jìn)行第二次活化， 4C 冰箱保存、備用.

（2）植物乳桿菌的培養(yǎng)

取適量菌粉于MRS液體培養(yǎng)基中， 35° .150rpm/min ，培養(yǎng) 24h ，以 3% （ 接種量接種于新的液體培養(yǎng)基中活化第二次，培養(yǎng) 24h，4C 冰箱保存、備用[12].

1.2.2 連翹發(fā)酵茶制備工藝流程

（1）稱量、清洗

稱量連翹葉三份，每份 15g ，清水清洗干凈，備用.

（2）高溫軟化

將洗凈的連翹葉置于蒸鍋中，添加適量蒸餾水并充分拌勻，水沸騰時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí) 15min ，使連翹葉充分軟化，吸水紙除去連翹葉表面水分，即得軟化連翹葉.

（3）揉捻

將軟化連翹葉揉捻（按照“輕 2min^? 重 1min^. 輕2min\"反復(fù)揉捻，使葉片達(dá)到卷曲，茶汁外溢，團(tuán)握時(shí)汁液未滴）.需先向連翹葉噴灑保護(hù)液再進(jìn)行揉搓，所述保護(hù)液為 檸檬酸和 碳酸氫鈉的混合液，噴灑量為每千克連翹葉 30mL

（4）高壓蒸汽滅菌

取揉捻后的連翹葉，置于培養(yǎng)血中， 濕熱滅菌 20min ，備用.

（5）制備種子液

對(duì)植物乳桿菌、德式保加利亞乳桿菌培養(yǎng)液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，測(cè)定其菌落總數(shù)， 10 000rpm/min ，取菌體，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)兩株菌的菌液濃度為每種菌液約為 5×10⁶cfu/mL ，振蕩搖勻，備用.

（6）接種發(fā)酵

無(wú)菌操作下，取連翹葉于錐形瓶中，分別加入德式保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌，密封，置于發(fā)酵箱中， 35° ，發(fā)酵 ^18h

（7）干燥

將發(fā)酵后的連翹葉置于培養(yǎng)皿中，干燥箱中50^°C 干燥至含水量 6% 以下.

1.2.3 連翹發(fā)酵茶工藝優(yōu)化

（1）單因素實(shí)驗(yàn)

為探討發(fā)酵過(guò)程中各個(gè)因素對(duì)連翹發(fā)酵茶品質(zhì)的影響規(guī)律，以感官評(píng)分、茶多酚、總黃酮含量為指標(biāo)，固定連翹葉添加量為 15g ，分別以黃芪添加量 （0g，0.75g，1.5g，2.25g，3g） 、德式保加利亞乳桿菌占比（占兩種菌種總量的 0%.33.3% 、50%.66.7%.100%） 、菌種接種量（占發(fā)酵原料總量的 0%1%.2%.4%.8%） 三個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)研究分析.

（2）響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

采用Box-Behnken對(duì)連翹發(fā)酵茶最佳制備工藝進(jìn)行研究，結(jié)合加權(quán)綜合性評(píng)分法，計(jì)算綜合評(píng)分，并利用Design-Expert8.O對(duì)其進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析，選擇黃芪添加量、德式保加利亞乳桿菌占比、菌種添加量等三個(gè)因子，分別用A、B、C代替.

1.3 分析方法

1.3.1 感官評(píng)價(jià)

依據(jù)GB/T23776-2018《茶葉感官審評(píng)方法》進(jìn)行評(píng)價(jià)[13]，將連翹發(fā)酵茶每 1g 置于評(píng)估杯中，加人 50mL 沸水，蓋上蓋子浸泡 2min ，按同樣的泡制順序等速將茶水倒入品評(píng)杯中，隨后第二次泡制，浸泡 5min ，將茶水瀝出.

隨機(jī)邀請(qǐng)5名評(píng)價(jià)人員分別對(duì)第一次瀝茶湯色、葉底、香氣、滋味進(jìn)行品評(píng)，再依次品評(píng)第二次瀝出茶水湯色、香氣、滋味、葉底.品評(píng)結(jié)果以第一次沖泡茶湯判斷湯色，再以第二次沖泡結(jié)果判斷外形、香氣、滋味、葉底.打分要求如表1所示.

表1感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.2 茶多酚含量測(cè)定

（1）沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取 0.1100g 沒(méi)食子酸對(duì)照品，加蒸餾水溶解并定容至 100mL ，搖勻（現(xiàn)配）.精密量取1.0mL，2.0mL，3.0mL，4.0mL，5.0mL 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，分別加蒸餾水定容至 100mL ，搖勻，分別加入 5.0mL10% 的福林酚試劑，搖勻，反應(yīng) 8min ，加 4.0mL 7.5% 碳酸鈉溶液，加蒸餾水定容至刻度、搖勻.室溫放置 60min，765nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值.以濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，制作沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線[14].

（2）樣品溶液的制備及含量測(cè)定

精密稱取 0.2000g 連翹發(fā)酵茶粉末，加 70^°C 預(yù)熱的 70% 甲醇溶液 5mL ，搖勻， 70C 浸提10min ，冷卻至室溫， 3 500rpm/min 離心 10min .殘?jiān)儆?5mL70% 甲醇溶液提取一次，重復(fù)以上操作.合并提取液，定容至 10mL ，搖勻.精密量取5mL 上述母液，加 70% 甲醇溶液定容至 10mL .搖勻，過(guò) 0.45μm 濾膜，備用.以蒸餾水為空白對(duì)照，參照沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法，從“分別加入5.0mL 10% 的福林酚試劑\"操作， 765nm 波長(zhǎng)處測(cè)定樣品溶液的吸光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，即得樣品的茶多酚含量.

1.3.3 總黃酮含量測(cè)定

（1）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取 0.1100g 蘆丁對(duì)照品，加蒸餾水溶解并定容至 100mL ，搖勻（現(xiàn)配）.分別精密移取2.0mL，4.0mL，6.0mL，8.0mL，10.0mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，加入蒸餾水定容至 100mL ，搖勻，分別加入 0.3mL5%NaNO₂ 溶液，混勻，靜置6min ，加入 0.3mL10% （20 Al（NO₃） 3溶液，混勻，靜置 6min ，加入 4mL4% NaOH溶液，加人 30% 乙醇溶液定容至 10mL ，靜置 15min，420nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，以濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線.

（2）樣品溶液的制備及含量測(cè)定

精密量取1.3.2（2）項(xiàng)下樣品溶液 2mL ，加入70% 甲醇溶液定容至 10mL ，搖勻，過(guò) 0.45μm 濾膜，備用.以蒸餾水為空白對(duì)照，參照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法，從“分別加入 0.3mL5% （20 NaNO₂ 溶液”操作， 420nm 波長(zhǎng)處測(cè)定樣品溶液吸光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，即得樣品總黃酮含量，總黃酮含量以蘆丁當(dāng)量表示，單位為 mg/g^[15] ：

1.3.4綠原酸、連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁、連翹脂素的含量測(cè)定

（1）色譜條件

AgilentZORBAXSB-C18色譜柱 （250mm× 4.6mm，5μm） ；流速 1mL/min ;柱溫 30^°C ，流動(dòng)相為乙腈 （A）-0.1% 磷酸溶液（B），梯度洗脫： 0～ 20min，A 相為 10%～25% ： 20～30min， A相為25%～40% 30～35min，A 相為 40%～60% ： 35～ 36min，A 相為 60%～10% ： 36～40min， A相為10%～10% .檢測(cè)波長(zhǎng) 277nm ，進(jìn)樣量 10μL

（2）混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取 10， 000 0mg 綠原酸、連翹脂素、連翹酯苷A對(duì)照品，加入色譜甲醇定容至10mL ，配制成 1.0mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；精密稱取5.6000mg 連翹苷對(duì)照品，加入色譜甲醇定容至10mL ，配制成 0.56mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；精密稱取 6.0000mg 蘆丁對(duì)照品，加入色譜甲醇定容至 10mL ，配制成 0.6mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液.分別精密量取綠原酸、連翹脂素、連翹酯苷A、連翹苷、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各 2mL 混合，搖勻，過(guò) 0. 45μm 濾膜，備用.

（3）供試品溶液的制備

分別精密稱取 1. 000 0g 連翹葉和連翹發(fā)酵茶粉末，加入 30mL 甲醇，超聲提取 ¹h ，冷卻，甲醇補(bǔ)足至 30mL ，濾過(guò)，收集上清液，過(guò) 0. 45μm 濾膜，得供試品溶液，備用

（4）含量測(cè)定

精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液 2μL，5μL，10μL 15μL，20μL ，按照色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以各標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣質(zhì)量（X）為橫坐標(biāo)、以各標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制各標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線[16.17]，將供試品溶液各化合物的峰面積代人對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算，即得連翹葉和連翹發(fā)酵茶中綠原酸、連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁、連翹脂素的含量.

1.3.5 抗氧化活性測(cè)定

樣品提取液的制備：分別精確稱取 1. 000 0g 連翹葉和連翹發(fā)酵茶，加人20倍 100^°C 蒸餾水，于沸水浴中提取 30min ，收集濾液，重復(fù)提取2次，合并濾液，定容至 50mL ，得連翹葉和連翹發(fā)酵茶提取液，以投料原料量計(jì)，兩份樣品濃度均為20mg/mL，4Λ°C 冷藏備用DPPH自由基清除率測(cè)定參照馬海會(huì)等[18]的方法，配制 100mL0.05mg/mL DPPH溶液：精密稱取 5mgDPPH ，加入無(wú)水乙醇定容至 100mL ，錫紙包裹， 4C （避光）備用.分別配制連翹葉、連翹發(fā)酵茶、VC溶液（陽(yáng)性對(duì)照），各濃度為 2.0mg/mL 4.0mg/mL，8.0mg/mL. （20

精密量取上述溶液各 2mL ，加人 2mL DPPH溶液，渦旋混勻，得到樣品溶液；以無(wú)水乙醇代替DPPH溶液，渦旋混勻，得到對(duì)照溶液；以無(wú)水乙醇代替樣品溶液，渦旋混勻，得到空白溶液.將上述溶液 25° 避光反應(yīng) 30min ，于 517nm 處測(cè)定吸光值.按公式（1）計(jì)算清除率.每組試驗(yàn)平行三次，取平均值.

計(jì)算樣品對(duì)DPPH自由基的清除率：

2 結(jié)果與討論

2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1茶多酚和總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液在 10～50μg/mL 呈線性關(guān)系，回歸方程為 Y=0. 002 3X+0. 0336，R²= 0.9959；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液在 0.022～0.11mg/mL 呈線性關(guān)系，回歸方程為 Y=0.6253X+0.0062 R²=0.999 3

2.1.2 黃芪添加量對(duì)連翹發(fā)酵茶品質(zhì)的影響

由圖1可知，隨著黃芪添加量的增多，連翹發(fā)酵茶中茶多酚和總黃酮含量先降低后升高，而感官評(píng)分先升高后降低.在發(fā)酵茶中加入黃芪后，茶多酚被氧化降解，形成茶褐色的其他多酚類高聚物[19]，且在微生物胞外酶的作用下，使總黃酮發(fā)生了轉(zhuǎn)化、降解等反應(yīng)[20].但是連翹發(fā)酵茶中黃芪添加過(guò)多會(huì)影響發(fā)酵效果，茶多酚轉(zhuǎn)化率低，并且黃芪中富含黃酮類化合物，因此連翹發(fā)酵茶中總黃酮總量增多.在發(fā)酵茶中加入黃芪，能較好的保持連翹葉的原始風(fēng)味，茶湯橙黃明亮，香氣純正，與黃芪的口感協(xié)調(diào).黃芪添加較少時(shí)，連翹葉中的苦澀味未被黃芪的甘味中和，當(dāng)添加量過(guò)高時(shí)，連翹發(fā)酵茶的原味被黃芪掩蓋，影響連翹發(fā)酵茶感官品質(zhì).茶多酚含量越高，連翹發(fā)酵茶口感越苦；黃酮類化合物具有柔和的澀感，是茶葉品質(zhì)的重要影響因子，其含量高低與茶湯的色澤、滋味密切相關(guān)，黃酮類物質(zhì)的減少有助于茶湯滋味的醇化和改善茶湯色澤[21].因此，綜合考慮最終選擇黃芪添加量為 1.5g…2.25g…3g 三個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn).

圖1黃芪添加量對(duì)連翹發(fā)酵茶品質(zhì)的影響

2.1.3 德式保加利亞乳桿菌占比對(duì)連翹發(fā)酵茶品質(zhì)的影響

由圖2可知，隨著德式保加利亞乳桿菌占比增大，茶多酚含量先略上升后降低，這是因?yàn)榫N充分生長(zhǎng)產(chǎn)生了多種代謝產(chǎn)物及促進(jìn)多酚釋放的酶類物質(zhì)，但由于德式保加利亞乳桿菌對(duì)茶多酚的氧化降解能力優(yōu)于植物乳桿菌，因而隨前者占比的增加，茶多酚含量降低.隨著德式保加利亞乳桿菌占比增大，總黃酮含量先降低后上升，可能是因?yàn)榈率奖＜永麃喨闂U菌生長(zhǎng)過(guò)程中次級(jí)代謝產(chǎn)物積累，酶活性受到抑制，不利于總黃酮的氧化降解.德式保加利亞乳桿菌的產(chǎn)酸能力強(qiáng)于植物乳桿菌，所以當(dāng)?shù)率奖＜永麃喨闂U菌占比較多時(shí)，產(chǎn)生的乳酸過(guò)多，導(dǎo)致連翹發(fā)酵茶口味發(fā)酸嚴(yán)重，連翹發(fā)酵茶的感官評(píng)分較低.綜合考慮最終選擇德式保加利亞乳桿菌占比為 33.3%.50%.66.7% 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn).

2.1.4 菌種添加量對(duì)連翹發(fā)酵茶品質(zhì)的影響

由圖3可知，隨著菌種添加量增多，茶多酚和總黃酮含量先降低后升高，推測(cè)是發(fā)酵過(guò)程激活了代謝酶系，進(jìn)而使連翹葉細(xì)胞壁破裂，促進(jìn)茶多酚和總黃酮類物質(zhì)的釋放.當(dāng)乳桿菌數(shù)量較少時(shí)，發(fā)酵效果不理想，連翹發(fā)酵茶口感和香氣不佳；當(dāng)菌種添加量增加，微生物在發(fā)酵過(guò)程中迅速繁殖，產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物，形成連翹發(fā)酵茶的風(fēng)味特征，茶湯橙黃明亮，香氣純正，無(wú)雜氣味.綜合考慮最終選擇菌種添加量為 0%4%.8% 三個(gè)水平考察.

圖2德式保加利亞乳桿菌占比對(duì)連翹發(fā)酵茶品質(zhì)的影響

圖3菌種添加量對(duì)連翹發(fā)酵茶品質(zhì)的影響

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化連翹發(fā)酵茶制備工藝

以感官評(píng)分、茶多酚含量和總黃酮含量作為響應(yīng)面試驗(yàn)的考察指標(biāo)，按照各指標(biāo)檢測(cè)的最大值和最小值為參照進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化，采用標(biāo)準(zhǔn)差法對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行權(quán)重賦分[22]，結(jié)果感官評(píng)分、茶多酚含量和總黃酮含量的權(quán)重系數(shù)（W）分別為0.9182、0.0191、0.0627，用權(quán)重系數(shù)和各項(xiàng)指標(biāo)歸一化后的數(shù)值計(jì)算各試驗(yàn)組的綜合評(píng)分（Y），計(jì)算公式

如下：

式（2）中： W_j 表示各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)； σ_j 表示各指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)差； j 表示第 j 個(gè)指標(biāo)； Ψ_m 表示指標(biāo)的個(gè)數(shù).

式（3）中：Y表示各試驗(yàn)組的綜合評(píng)分; F_1max 、F_2max，F(xiàn)_3max 分別表示各試驗(yàn)組3個(gè)指標(biāo)測(cè)定的最大值 ：F_1min?F_2min?F_3min 分別表示各試驗(yàn)組3個(gè)指標(biāo)測(cè)定的最小值； F₁?F₂?F₃ 分別表示某個(gè)試驗(yàn)組3個(gè)指標(biāo)測(cè)定的數(shù)值.

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Design-Expert V8.0.6 軟件，輸人響應(yīng)面因素水平表，得出以下試驗(yàn)設(shè)計(jì)表（如表2所示），以黃芪添加量、德式保加利亞乳桿菌占比、菌種添加量三個(gè)因素為自變量，以綜合評(píng)分Y為響應(yīng)值，得出綜合評(píng)分Y（如表2所示）.

表2Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及結(jié)果

對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得出了綜合評(píng)分（Y）的二次元多項(xiàng)回歸方程，黃芪添加量（A）、德式保加利亞乳桿菌占比（B）、菌種添加量（C）真實(shí)值的回歸模型方程為： Y=-3.701 6+ 1.848 1A+0. 0616B+0. 384 3C-0. 004 0AB- 0.041 0AC-0.000 8BC-0.314 7A²-0.000 4B²- 0.0316C² .根據(jù)顯著性檢驗(yàn)分析結(jié)果，二次多項(xiàng)模式在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有很高的顯著性 （Plt;0.000 1） ，失擬項(xiàng)沒(méi)有顯著意義，其校正決定系數(shù)（ R_adj² ）為0.934，說(shuō)明 93.40% 的綜合評(píng)分變化可從該模型來(lái)說(shuō)明.相關(guān)系數(shù) R² 為0.9804，表明綜合評(píng)分與試驗(yàn)結(jié)果吻合良好，可應(yīng)用于連翹發(fā)酵茶中感官評(píng)分、茶多酚含量、總黃酮含量預(yù)測(cè).回歸公式中各個(gè)因子的系數(shù)值反映了各個(gè)因素對(duì)指標(biāo)的影響，F(xiàn)值愈大，則說(shuō)明其對(duì)指標(biāo)的影響越重要，影響連翹發(fā)酵茶綜合評(píng)分的因素依次是：德式保加利亞乳桿菌占比 gt; 黃芪添加量 gt; 菌種添加量.

圖4所示為各因素的曲面圖，反映出了各因素之間的相互作用對(duì)結(jié)果的影響.響應(yīng)面曲線為拋物線，表明該模型具有最大值.

根據(jù)回歸模型得到的連翹發(fā)酵茶綜合評(píng)分最優(yōu)制備工藝條件為：連翹葉添加量 15g ，黃芪添加量為 2.325g ，菌種添加量為總質(zhì)量的 3.872% ，其中德式保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌分別為菌種量的 56.5% 和 43.5% .考慮到實(shí)施條件，將制備最佳參數(shù)設(shè)為：連翹葉添加量 15g ，黃芪添加量為2.4g ，菌種添加量為總質(zhì)量的 3.9% ，其中德式保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌分別為菌種量的 55% 和 45%.

2.3連翹葉和連翹發(fā)酵茶中主要活性成分的含量分析

2.3.1綠原酸、連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁、連翹脂素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液在 0. 4～4μg 呈線性關(guān)系，回歸方程為 Y=986 952X+150 13，R²= 0.9998;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液在 0. 24～2. 4μg 呈線性關(guān)系，回歸方程為 Y=410216X+29263，R² =0.997 1 ;連翹酯苷A標(biāo)準(zhǔn)品溶液在 0.4～4μg 呈線性關(guān)系，回歸方程為 Y=689 413 X-166102，R²=0.9959 ；連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液在0. 224～2. 24μg 呈線性關(guān)系，回歸方程為 Y= 460 397X+9 062. 3，R²=0. 9978 連翹脂素標(biāo)準(zhǔn)品溶液在 0.4～4μg 呈線性關(guān)系，回歸方程為Y=693031X+26733，R²=0.9983.

2.3.2茶多酚和總黃酮含量比較分析

由表3可知，在連翹發(fā)酵茶最佳制備工藝條件下，在連翹葉中加入黃芪飲片和菌種發(fā)酵，連翹發(fā)酵茶感官品質(zhì)提高，茶多酚含量降低，總黃酮含量升高，其原因是黃芪所含總黃酮類成分形成了連翹發(fā)酵茶總黃酮含量的增加.

表3茶多酚和總黃酮含量

2.3.3連翹葉與連翹發(fā)酵茶綠原酸、連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁、連翹脂素含量分析

由表4和圖5可知，連翹發(fā)酵茶中綠原酸、蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷的含量與連翹葉相比降低，而連翹脂素的含量升高，這可能是連翹葉中連翹苷被酶解轉(zhuǎn)化為連翹脂素，這與李曦等[23]的研究成果一致.由此可見(jiàn)，連翹葉在最佳制備工藝條件下，既能生成更易吸收和更強(qiáng)藥理活性的連翹脂素[24]，又能使連翹發(fā)酵茶口感、香氣、滋味、品相提高.

圖5混合標(biāo)準(zhǔn)品、連翹葉和連翹發(fā)酵茶中5種指標(biāo)成分高效液相色譜圖（1：綠原酸；2：蘆丁；3：連翹酯苷A；4：連翹苷；5：連翹脂素）

表4綠原酸、蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷、連翹脂素含量

2.4抗氧化活性分析

由圖6可知，隨著連翹葉和連翹發(fā)酵茶茶湯濃度增大，DPPH自由基清除率逐漸升高這一結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)[25]報(bào)道相符.在 2mg/mL 時(shí)，連翹葉和連翹發(fā)酵茶對(duì)DPPH自由基的清除率分別為76.58% 和 66.67% ，在 8mg/mL 時(shí)，清除率分別增加到 80.24% 和 76.74% .結(jié)果表明，連翹葉通過(guò)最佳制備工藝條件制備成連翹發(fā)酵茶后仍表現(xiàn)有一定的抗氧化活性.

圖6 DPPH清除率比較

3結(jié)論

連翹葉味苦性寒，其資源大多被丟棄，黃芪具有補(bǔ)中益氣的功效，可以緩和連翹葉寒涼性質(zhì).本研究基于對(duì)連翹葉資源的充分利用，以連翹葉和黃芪為主要原料，以德式保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌為發(fā)酵菌種，以感官評(píng)分、茶多酚和總黃酮含量為指標(biāo)，確定連翹發(fā)酵茶最佳制備工藝為連翹葉添加量 15g ，黃芪添加量為 2.4g ，菌種添加量為總質(zhì)量的 3.9% ，其中德式保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌分別為菌種量的 55% 和 45%.

采用HPLC法測(cè)定5種活性成分發(fā)現(xiàn)，與連翹葉相比，連翹發(fā)酵茶品質(zhì)得到了改善，影響寒涼性質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)得以調(diào)整，且主要功效成分維持在一定水平.連翹發(fā)酵茶和連翹葉對(duì)DPPH自由基的清除率分別為 76.74% 和 80.24% ，均具有抗氧化活性.本研究為連翹葉高附加值產(chǎn)品開(kāi)發(fā)及廢棄資源的綜合利用提供了理論依據(jù).

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