低共熔溶劑對(duì)偏甘油酯脂肪酶LipaseG50活性和穩(wěn)定性的影響

中圖分類(lèi)號(hào)：Q814 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Abstract：This study aims to investigate the effects deep eutectic solvents（DESs） on the activity stability partial glyceride lipase Lipase G5O.By preparing 21 different types DESs，the correlations between the physicochemical properties DESs their components were explored，along with the influence patterns various DESs on the activity stability Lipase G5o.The results demonstrate that the prepared DESs primarily form through hydrogen bond interactions. Their acidity or alkalinity is determined by the component with stronger proton-donating or proton-accepting capabilities，while polarity is mainly governed by hydrogen bond acceptors （HBAs）.Lipase G5O exhibited good acid-base tolerance in DESs but lost activity in highly polar or strongly acidic environments.Enzyme activity significantly decreased when viscosity exceeded 10 000mPa?s. Urea-based proline-based DESs notably enhanced both the activity thermal stability Lipase G5O. This research provides a theoretical basis for the application Lipase G5O in DES-mediated catalytic oil modification.

Key words：deep eutectic solvents （DESs）； Lipase G5O；activity； stability； physicochemical properties

0 引言

隨著綠色化學(xué)和可持續(xù)發(fā)展理念的不斷推進(jìn)，傳統(tǒng)有機(jī)溶劑因存在毒性大、揮發(fā)性強(qiáng)、環(huán)境污染等問(wèn)題，逐漸無(wú)法滿足現(xiàn)代工業(yè)對(duì)綠色、環(huán)保的要求.因此，開(kāi)發(fā)新型綠色溶劑成為化學(xué)和生物催化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn).2003年，Abbott等[1，2]首次發(fā)現(xiàn)氯化膽堿-尿素的低共熔現(xiàn)象并提出了低共熔溶劑（Deep Eutectic Solvents，DESs）的概念.DESs是由氫鍵供體（HBDs）和氫鍵受體（HBAs）按照一定摩爾比混合形成的液體混合物，其熔點(diǎn)顯著低于單一組分的熔點(diǎn).這類(lèi)溶劑因其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，如低揮發(fā)性、高溶解性、可調(diào)性和環(huán)境友好性，逐漸成為傳統(tǒng)有機(jī)溶劑和離子液體的理想替代品，尤其是在綠色化學(xué)和可持續(xù)化學(xué)領(lǐng)域.

近年來(lái)，DESs在生物催化領(lǐng)域的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注.Choi等[3]于2011年提出了天然低共熔溶劑的概念，其組分完全來(lái)源于生物體內(nèi)小分子代謝物，如膽堿衍生物、醇類(lèi)、有機(jī)酸、糖類(lèi)等，這些天然組分不僅具有低毒性、生物可降解性和環(huán)境友好性，還能夠通過(guò)氫鍵等相互作用形成低共熔混合物，從而顯著降低溶劑的熔點(diǎn).這一概念的提出進(jìn)一步拓展了DESs在生物催化中的應(yīng)用前景，尤其是在酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用.

研究表明，DESs能夠顯著提高某些生物酶（如脂肪酶）的活性與穩(wěn)定性.脂肪酶是一類(lèi)重要的生物催化劑，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品和生物柴油等領(lǐng)域.DESs通過(guò)其獨(dú)特的溶劑特性，如高極性、低揮發(fā)性和良好的溶解性，能夠?yàn)槊柑峁┮粋€(gè)適宜的微環(huán)境，從而增強(qiáng)酶的催化效率和穩(wěn)定性.例如，DESs中的氫鍵網(wǎng)絡(luò)可以穩(wěn)定酶的構(gòu)象，減少酶在非水相環(huán)境中的失活.此外，DESs還能夠通過(guò)調(diào)節(jié)反應(yīng)介質(zhì)的極性和粘度，影響底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散速率，進(jìn)而優(yōu)化反應(yīng)條件[4].然而，目前關(guān)于DESs中脂肪酶活性和穩(wěn)定性的研究大多集中在甘油三酯脂肪酶上，而對(duì)于偏甘油酯脂肪酶的研究相對(duì)較少.偏甘油酯脂肪酶是一類(lèi)具有特殊甘油酯選擇性的酶，其僅能催化合成或水解甘油單酯和甘油二酯，而不能合成或水解甘油三酯.因其獨(dú)特的甘油酯選擇性，目前，偏甘油酯脂肪酶被廣泛應(yīng)用于功能性結(jié)構(gòu)脂質(zhì)（甘油二酯、甘油三酯型PU-FA等）丙二醇脂肪酸酯的制備，并被廣泛應(yīng)用于高酸價(jià)油脂的酶法脫酸和植物油的酶法脫膠中[5].

然而，目前關(guān)于低共熔溶劑中偏甘油酯脂肪酶活性和穩(wěn)定性的研究尚未有報(bào)道.

LipaseG5O作為唯一一種市售的偏甘油酯脂肪酶，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值.然而，關(guān)于其在DESs中的活性和穩(wěn)定性的研究鮮有報(bào)道[.因此，本研究旨在通過(guò)制備多種不同類(lèi)型的DESs，系統(tǒng)研究其理化性質(zhì)（如極性、pH、密度、水分活度、粘度等）對(duì)LipaseG5O活性和穩(wěn)定性的影響，以期為L(zhǎng)ipaseG5O和DESs在生物催化領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持.

1材料與方法

1.1主要材料及試劑

氯化膽堿（分析純），甜菜堿（分析純）脯氨酸（分析純），乳酸（分析純），甘油（分析純），乙二醇（分析純），檸檬酸（分析純），尿素（分析純），葡萄糖（分析純），LipaseG5O商品化脂肪酶（日本天野酶制劑公司），溴化鉀（光譜純），尼羅紅染料（分析純），氫氧化鈉（分析純），聚乙烯醇（分析純）， 95% 乙醇（分析純）

1.2 主要儀器

傅里葉紅外光譜儀（VECTOR-22），數(shù)字式粘度計(jì)（NDJ-8S）， pH 計(jì)（PHS-3C），紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Evolution200），低溫恒溫槽（DC-0510），水分活度計(jì)（HD-3B），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52AA），氣浴恒溫振蕩器（THZ-92C）.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 低共熔溶劑的制備

DESs的制備比例按照表1所示，按一定的摩爾比分別稱取各組分，混合置于 250mL 圓底燒瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中 80° 水浴旋轉(zhuǎn) 直至獲得澄清透明液體.由于部分DESs按比例無(wú)法形成均一透明液體，而少量水分不會(huì)對(duì)低共熔溶劑性質(zhì)造成巨大影響，因此制備過(guò)程中按比例加人一定量的去離子水.

1.3.2 傅里葉紅外光譜測(cè)定

采用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）技術(shù)對(duì)低共熔溶劑（DESs）及其組分進(jìn)行表征.具體操作如下：首先將干燥的溴化鉀研磨成粉末，并將其壓制成薄片.隨后，將少量DESs均勻涂抹于溴化鉀薄片表面.將樣品放入傅里葉變換紅外光譜儀中進(jìn)行掃描，掃描范圍設(shè)定為 500～4000cm^-1 ，掃描次數(shù)為15次，分辨率設(shè)置為 0.07cm^-1.

表1低共熔溶劑的組成及摩爾比

1.3.3 極性測(cè)定

參照J(rèn)uric等8的方法并加以改進(jìn)，尼羅紅染料的最大吸收波長(zhǎng)會(huì)因溶劑極性的不同而發(fā)生顯著變化，因此可以通過(guò)測(cè)定尼羅紅在不同溶劑中的最大吸收波長(zhǎng)來(lái)間接反映溶劑的極性.本研究采用以下方法進(jìn)行測(cè)定：首先，使用 96% 乙醇配制濃度為 5mmol/L 的尼羅紅溶液.然后，將980μL 的低共熔溶劑（DESs）與 20μL 尼羅紅乙醇溶液混合均勻，制備成測(cè)試樣品.接著，利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在 400～700nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定樣品的最大吸收波長(zhǎng).根據(jù)公式（1）計(jì)算溶劑的極性值：

E_NR=28 591λ_max^-1

1.3.4 物理性質(zhì)測(cè)定

（1）pH 測(cè)定

采用 pH 計(jì)對(duì)配置的DESs的 ΔpH 進(jìn)行測(cè)定，各種樣品測(cè)定三次，結(jié)果取平均值.

（2）密度測(cè)定

DESs的密度參考鐘小榮9的方法采用密度瓶法進(jìn)行測(cè)定，具體測(cè)定步驟如下：首先用乙醇、乙醚依次清洗密度瓶，待完全干燥冷卻到室溫后置于分析天平上稱量并記錄質(zhì)量；然后倒?jié)M蒸餾水，置于低溫恒溫槽中 20°C 條件下浸泡，待水溫到達(dá)20° 后取出，擦拭干水分后置于分析天平上稱量并記錄質(zhì)量，計(jì)算出 20° 時(shí)蒸餾水的質(zhì)量；倒出蒸餾水瀝干水分后再倒?jié)M待測(cè)DESs樣液，重復(fù)上述操作，計(jì)算出 20°C 時(shí)待測(cè)樣液的質(zhì)量.相對(duì)密度按照公式（2）計(jì)算：

式（2）中： m₁ 為 20° 時(shí)密度瓶裝滿DESs的質(zhì)量 （g）;m₂ 為 20°C 時(shí)密度瓶裝滿蒸餾水的質(zhì)量（g）；0.9982為 20°C 時(shí)水的密度 （g/cm³） ：

（3）水分活度測(cè)定

DESs的水分活度使用水分活度儀進(jìn)行測(cè)定.具體測(cè)定方法如下：在測(cè)定DESs樣品的水分活度之前，首先使用無(wú)水硅膠進(jìn)行三次預(yù)測(cè)定以校準(zhǔn)儀器.隨后，將DESs樣品均勻鋪展在塑料樣品血中，將樣品血放置于水分活度儀的傳感器底座上，并蓋上傳感器進(jìn)行測(cè)定.每次測(cè)定持續(xù) 5min ，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次，最終取三次測(cè)定結(jié)果的平均值作為該樣品的水分活度值.

（4）粘度測(cè)定

DESs的粘度使用數(shù)字式粘度計(jì)進(jìn)行測(cè)定.具體測(cè)定方法如下：將一定量的低共熔溶劑（DESs）移取至 50mL 塑料離心管中，隨后利用恒溫水浴鍋對(duì)DESs樣品進(jìn)行加熱處理.在測(cè)量之前，先對(duì)粘度計(jì)進(jìn)行校準(zhǔn)操作，以確保測(cè)量的準(zhǔn)確性.根據(jù)所測(cè)DESs的特性，選擇合適的轉(zhuǎn)子和轉(zhuǎn)速，將轉(zhuǎn)子浸入DESs中，直至液面達(dá)到轉(zhuǎn)子的刻度線.啟動(dòng)粘度計(jì)進(jìn)行測(cè)量，待讀數(shù)穩(wěn)定后記錄數(shù)據(jù).

1.3.5 偏甘油酯脂肪酶LipaseG5O水解活力的測(cè)定

采用甘油二酯乳化法測(cè)定LipaseG5O的水解活力[10].具體操作如下：先將 4% 的聚乙烯醇與甘油二酯按照質(zhì)量比 3：1 的比例混合，用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)乳化 3min 左右，靜置 3min 后再繼續(xù)均質(zhì)3min 左右，直至乳化液呈乳白色且無(wú)油滴為止.然后，在 25mL 錐形瓶中加入 4g 乳化液和 pH5.6 的磷酸鹽緩沖液（PBS），于 30^°C 的恒溫振蕩器中預(yù)熱 5～10min ，準(zhǔn)確加入 0.01g 的LipaseG50酶粉重新放回恒溫振蕩器中并開(kāi)始計(jì)時(shí)，反應(yīng)5min 后取出并立即加入 12g95% 乙醇終止反應(yīng)，最后滴加1滴 1% 酚酞試劑，采用 0.1mol/L NaOH溶液進(jìn)行滴定，準(zhǔn)確記錄NaOH消耗的體積.空白組不加酶粉，其他操作同前.

脂肪酶水解酶活定義為：在上述測(cè)定條件下，每分鐘水解甘油二酯產(chǎn)生 1μmol 脂肪酸所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U）.水解活力按照公

式（3）計(jì)算：

脂肪酶水解酶活 （U/g）=

式（3）中： V₁ 為實(shí)驗(yàn)組滴定結(jié)束后消耗的ΔNaOH 溶液體積 （mL ）； ΔV₂ 為空白組滴定結(jié)束后消耗的NaOH溶液體積 （mL）;c 為NaOH溶液濃度（mol/L） ； m 為反應(yīng)加入的酶粉質(zhì)量 Π（g）_σ;t 為反應(yīng)的時(shí)間（ ：

1.3.6 低共熔溶劑中LipaseG5O水解活力的 測(cè)定

將 4g 低共熔溶劑（DESs）與等質(zhì)量乳化液混合.將混合物置于 30^°C 的恒溫振蕩器中預(yù)熱 5～ 10min .隨后，加入 _0.01g LipaseG50酶粉，重新將錐形瓶放回恒溫振蕩器中，并開(kāi)始計(jì)時(shí).反應(yīng)進(jìn)行 5min 后，迅速取出錐形瓶，并立即加入 12g 95% 乙醇以終止反應(yīng).最后，通過(guò)滴定法測(cè)定酶的活性.乳化液的配制方法以及酶活的測(cè)定步驟均參照第1.3.5節(jié)的描述進(jìn)行.

1. 3.7 低共熔溶劑中LipaseG5O熱穩(wěn)定性測(cè)定

稱取適量酶粉置于DESs中，分別在 30° 、 下孵育 ^2h ，再按照1.3.5節(jié)方法測(cè)定水解活力.

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)設(shè)定三次平行，使用SPSS對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，結(jié)果以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，Plt;0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與討論

2.1低共熔溶劑的制備

氯化膽堿和甘油作為最早發(fā)現(xiàn)的低共熔溶劑（DESs）組分，因其來(lái)源安全、成本低、工藝綠色，被廣泛用于促進(jìn)酯化、轉(zhuǎn)酯化等反應(yīng)，并對(duì)酶活性有保護(hù)和促進(jìn)作用.Gutiérrez等[11]發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞在氯化膽堿-甘油體系中低溫凍干后仍能保留大部分活性.甜菜堿作為天然生物小分子，廣泛存在于生物體內(nèi)，能調(diào)節(jié)滲透壓并保護(hù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其形成的DESs在生物酶催化領(lǐng)域有大量報(bào)道.盡管尿素會(huì)破壞酶蛋白活性，但與甜菜堿結(jié)合形成DESs后，卻能穩(wěn)定酶蛋白結(jié)構(gòu)，這與氫鍵供體（HBDs）和氫鍵受體（HBAs）的分子作用密切相關(guān).Chen等[12]證明，在甜菜堿-尿素體系中，甜菜堿優(yōu)先與溶菌酶作用，阻止了尿素對(duì)酶蛋白的破壞.氨基酸因結(jié)構(gòu)與甜菜堿類(lèi)似，也被用于DESs的制備[13].Freitas等[14]發(fā)現(xiàn)，乳酸-甘油體系中脂肪酶活性顯著提升，表明乳酸在DESs制備中具有應(yīng)用潛力，

低共熔溶劑（DESs）的制備方法主要有研磨法、冷凍干燥法和加熱法.研磨法在常溫下進(jìn)行，避免溫度影響，制備的DESs純度高，但吸濕性組分（如氯化膽堿）易因長(zhǎng)時(shí)間研磨吸水.冷凍干燥法可加速溶解，但操作復(fù)雜且設(shè)備要求高.加熱法是常見(jiàn)方法，將組分混合后在 80° 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至澄清液體，操作簡(jiǎn)便且性質(zhì)穩(wěn)定，適合實(shí)驗(yàn)室制備.Florindo等[15]比較研磨法和加熱法，發(fā)現(xiàn)二者制備的DESs物理性質(zhì)差異不大.

目前，DESs的制備主要以氯化膽堿、甜菜堿、甘油、尿素為主，為進(jìn)一步豐富其他類(lèi)型DESs的應(yīng)用，本文按照1.3.1節(jié)中方法選用均來(lái)源天然的生物小分子的氯化膽堿和甜菜堿（膽堿類(lèi)）、甘油和乙二醇（醇類(lèi)）、檸檬酸和乳酸（有機(jī)酸類(lèi)）、脯氨酸（氨基酸類(lèi)）、尿素（酰胺類(lèi)）、葡萄糖（糖類(lèi)）作為DESs組分，采用加熱法制備了21種DES.

2.2低共熔溶劑FI-IR表征

目前的相關(guān)研究DESs的制備過(guò)程未涉及傳統(tǒng)意義上的化學(xué)反應(yīng)，各組分（如氫鍵受體HBAs與氫鍵供體HBDs）通過(guò)物理作用形成均相體系，且在混合后仍保持其化學(xué)本質(zhì)的獨(dú)立性.針對(duì)DESs在常溫下由固態(tài)原料形成穩(wěn)定液態(tài)的獨(dú)特現(xiàn)象，研究者提出了三類(lèi)理論機(jī)制：其一為“內(nèi)部簇結(jié)構(gòu)理論”，主張?jiān)辖M分在微觀層面通過(guò)自組裝形成動(dòng)態(tài)簇狀結(jié)構(gòu)，從而破壞原有晶格；其二，認(rèn)為物理混合過(guò)程中機(jī)械能的輸入導(dǎo)致分子間距改變，促使相態(tài)轉(zhuǎn)變；而最具影響力的解釋來(lái)自DESs領(lǐng)域奠基人Abbot團(tuán)隊(duì)提出的“氫鍵協(xié)同作用理論”，其核心觀點(diǎn)是HBAs（如氯化膽堿）與HBDs（如甘油、尿素）間形成高強(qiáng)度氫鍵網(wǎng)絡(luò)，顯著降低體系的晶格能，導(dǎo)致混合物的共熔點(diǎn)遠(yuǎn)低于單一組分熔點(diǎn).由于甘油基DESs性質(zhì)比較穩(wěn)定，針對(duì)其與不同氫鍵受體（HBAs）復(fù)配時(shí)粘度顯著差異的特性，并結(jié)合目前糖基DESs基礎(chǔ)數(shù)據(jù)匱乏的現(xiàn)狀，系統(tǒng)篩選制備了六種具有代表性的DESs體系，通過(guò)FT-IR對(duì)比分析其氫鍵相互作用特征及組分結(jié)構(gòu)變化規(guī)律.

圖1（a）展示了氯化膽堿-甘油及其兩種單一組分的紅外光譜.結(jié)果表明，氯化膽堿-甘油中未出現(xiàn)額外的特征峰，說(shuō)明混合后未發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成新物質(zhì).然而，羥基振動(dòng)峰從單一組分的 3579cm^-1 下移至 3541cm^-1 ，且峰強(qiáng)度增強(qiáng)、峰形變寬.C-H伸縮振動(dòng)峰 （2800～2900cm^-1） 和伯醇吸收峰（ 1050cm^-1 ）的位移不明顯，但強(qiáng)度增加.1482cm^-1 處的甲基和亞甲基吸收峰對(duì)結(jié)構(gòu)分析意義不大.這些現(xiàn)象主要?dú)w因于分子間氫鍵 （X-H…Y） 的形成.根據(jù)化學(xué)鍵振動(dòng)頻率與力常數(shù)的關(guān)系，氫鍵的形成導(dǎo)致化學(xué)鍵長(zhǎng)增加、力常數(shù)減小，從而使紅外吸收峰發(fā)生紅移（向低波數(shù)移動(dòng)）[16].同時(shí)，氫鍵的締合還會(huì)使譜帶變寬、吸收強(qiáng)度增強(qiáng).

圖1（b）表示了甜菜堿-甘油及其兩種單一組分的紅外光譜圖.結(jié)果顯示，甜菜堿-甘油的羥基振動(dòng)峰從 3579cm^-1 紅移至 3578cm^-1 ，峰形顯著變寬，但紅移幅度較小，表明氫鍵作用相對(duì)較弱.這說(shuō)明甜菜堿-甘油體系的形成不僅依賴于氫鍵，還可能涉及其他作用力[17].Kumar等[18]的研究表明，在甜菜堿-尿素體系中，除了氫鍵外，庫(kù)侖力和范德華力也發(fā)揮了重要作用.

如圖1（c）所示，脯氨酸-甘油的羥基振動(dòng)峰也出現(xiàn)變寬現(xiàn)象，但不顯著.這是由于脯氨酸-甘油中氫鍵的主要形式為 N-H…O. 在 1677cm^-1 處的酰胺吸收峰顯著紅移并變寬，進(jìn)一步支持了氫鍵的存在.

類(lèi)似地，在乳酸-甘油（如圖1（d）所示）以及甜菜堿-葡萄糖（如圖1（e）所示）、脯氨酸-葡萄糖（如圖1（f所示）幾種DESs的譜圖也表現(xiàn)出相同的氫鍵締合現(xiàn)象.綜上所述，所制備得到的DESs主要通過(guò)氫鍵相互作用形成.

（b）B-Gly及其單一組分FI-IR圖

2.3低共熔溶劑極性分析

低共熔溶劑（DeepEutecticSolvents，簡(jiǎn)稱DESs）是一種具有獨(dú)特性質(zhì)的溶劑體系，其極性是眾多關(guān)鍵物化性質(zhì)中的重要一環(huán).這種極性在很大程度上決定了低共熔溶劑的溶解能力，即它能夠溶解哪些物質(zhì)以及溶解的程度如何.此外，極性還影響著低共熔溶劑的反應(yīng)活性，進(jìn)而決定了它在化學(xué)反應(yīng)中能夠參與哪些反應(yīng)以及反應(yīng)的速率和程度.通過(guò)傅里葉紅外光譜分析表明，DESs之主要是通過(guò)分子間氫鍵形成，其極性受外部因素顯著影響：Pey等[19.20]發(fā)現(xiàn)水分會(huì)增強(qiáng)極性（氫鍵網(wǎng)絡(luò)破壞），而溫度對(duì)極性無(wú)明顯作用.目前外源物質(zhì)影響機(jī)制較明確，但內(nèi)源組分（尤其是非氯化膽堿體系）因復(fù)合配比研究仍不充分，本研究系統(tǒng)測(cè)定了20種DESs的極性（Pro-Glu體系因顯色干擾未納入），通過(guò)圖2與表2揭示了組分-極性關(guān)聯(lián)規(guī)律.

本研究利用尼羅紅作為溶劑致變色探針，通過(guò)測(cè)定其最大吸收波長(zhǎng) （λ_max ）紅移程度間接評(píng)估DESs的極性：極性越大， λ_max 紅移越顯著，對(duì)應(yīng)ENR值越小（結(jié)果如表2所示）.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乳酸基和檸檬酸基DESs因具有豐富的羥基和羧酸基團(tuán)，其極性顯著高于其他DESs，這證實(shí)有機(jī)酸類(lèi)DESs通過(guò)增強(qiáng)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)和質(zhì)子供給能力展現(xiàn)出更強(qiáng)極性特征，與Dai等[21]、Craveiro等[22]和Florindo等[23]關(guān)于氫鍵供體性質(zhì)影響極性的研究結(jié)論相吻合.值得注意的是，同類(lèi)型氫鍵受體（HBAs）制備的DESs呈現(xiàn)出相近極性值，進(jìn)一步驗(yàn)證了HBAs的化學(xué)結(jié)構(gòu)是決定DESs極性特征的關(guān)鍵主導(dǎo)因素.

圖2尼羅紅測(cè)定DESs極性的紫外-可見(jiàn)光譜圖

表220種DESs的極性

2.4低共熔溶劑物理性質(zhì)分析

2.4.1 pH

由于DESs的組成成分不一，形成溶液后酸堿度也有所差異.在使用DESs作為溶劑時(shí)，其酸堿度對(duì)反應(yīng)起到了至關(guān)重要的影響，尤其是在酯化和酯交換反應(yīng)中[23].因此，確定DESs的酸堿度對(duì)其在物質(zhì)提取、生物催化等領(lǐng)域的應(yīng)用有著重要研究意義[24，25].本研究對(duì)所制備的21種DESs進(jìn)行了pH 測(cè)定，結(jié)果如表3所示.從表3中可以看出，在以弱酸性的ChCl和弱堿性的B作為HBAs的DESs中，除中性HBDs外，DESs酸堿性的隨HBDs的變化而變化，但是當(dāng)HBDs為中性物質(zhì)如醇類(lèi)時(shí)，ChCI體系DESs呈弱酸偏中性，而B(niǎo)體系DESs呈弱堿偏中性.中性的Pro形成的DESs 酸堿性也主要由HBDs決定，但在酸性較強(qiáng)的Lac體系DESs中，HBDs的酸堿性對(duì)于整體的影響不大.由此結(jié)合布朗斯特酸堿理論可知，DESs的酸堿性主要由組分中給質(zhì)子能力或接受質(zhì)子能力強(qiáng)的一方?jīng)Q定.因此，對(duì)于二元組分的DESs，在確定了其中一個(gè)組分后，可以通過(guò)調(diào)控另外一個(gè)組分的種類(lèi)來(lái)決定DESs的酸堿性.

2.4.2 密度

研究表明，DESs的密度通常大于水和大多數(shù)有機(jī)溶劑，在 298.15K 時(shí)約為 1.0～1.35g/cm^3[26] .本研究測(cè)定了21種DESs的密度（如表3所示），范圍在 1.138～1.344g/cm³ 之間.研究發(fā)現(xiàn)以甘油、檸檬酸和葡萄糖為HBDs的DESs密度較高.盡管甜菜堿和脯氨酸摩爾質(zhì)量相近且條件相同，但形成的DESs密度差異較大.這種差異主要源于組分的分子結(jié)構(gòu)和分子間相互作用：甘油和葡萄糖的多羥基結(jié)構(gòu)以及檸檬酸的多羧基結(jié)構(gòu)可形成致密的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，從而增加密度.Florindo等[15]發(fā)現(xiàn)羧酸的引入會(huì)提高密度.從微觀角度看，DESs的密度與其自由體積和孔隙大小相關(guān)，可通過(guò)空穴理論解釋[27，28].當(dāng)氫鍵網(wǎng)絡(luò)致密時(shí)，粘度增加，孔隙變小，密度升高粘度與密度的關(guān)系將在后續(xù)討論.

2.4.3 水分活度

DESs由氫鍵作用形成，而水分子本身也富含氫鍵，因此水分的引人會(huì)對(duì)DESs的性質(zhì)產(chǎn)生本質(zhì)影響.水分活度反映了溶劑中水分的存在形式，并對(duì)DESs產(chǎn)生本質(zhì)影響.本研究測(cè)定了21種DESs的水分活度（如表3所示），結(jié)果顯示，除BCA體系外，其20種DESs均處于低水分活度狀態(tài)，表明其水分主要以結(jié)合水形式存在.這說(shuō)明在DESs制備過(guò)程中，水分與DESs組分結(jié)合形成氫鍵，與FT-IR結(jié)果一致.

從密度角度看，氫鍵對(duì)DESs密度有顯著影響.例如，本研究中制備的ChCl-CA和B-CA體系在相同條件下，理論上ChCl-CA的密度應(yīng)更高，但實(shí)際結(jié)果相反.此外，B-CA的水分活度較高，表明其水的結(jié)合程度較低.這說(shuō)明適量水分的加入可以促進(jìn)DESs中氫鍵的形成，而過(guò)多水分則會(huì)破壞氫鍵結(jié)構(gòu).這一現(xiàn)象與Makos等[29]的研究一致，即少量水分可形成穩(wěn)定的配合物，但過(guò)量水分會(huì)破壞DESs 的結(jié)構(gòu).

表3DESs的pH、密度及水分活度

注：標(biāo)“-\"為無(wú)法測(cè)定

2.4.4 粘度

粘度作為DESs的一項(xiàng)關(guān)鍵物理性質(zhì)，在其眾多應(yīng)用中扮演著至關(guān)重要的角色.具體來(lái)說(shuō)，粘度顯著地影響著反應(yīng)過(guò)程中的傳質(zhì)效率DESs的粘度特性主要由其內(nèi)部的幾種相互作用力決定.氫鍵、范德華力和靜電相互作用等作用力，這些作用力共同形成了相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，并與溫度、水分含量及組分構(gòu)成密切相關(guān).由于內(nèi)部強(qiáng)作用力形成的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，DESs普遍呈現(xiàn)高粘度特性，這對(duì)工業(yè)應(yīng)用形成制約.研究顯示，與傳統(tǒng)離子液體相似，DESs 粘度具有顯著溫度敏感性[27.30].因此，通過(guò)調(diào)整組分以制備新型DESs或改變溫度，是降低其粘度的有效途徑.在實(shí)際應(yīng)用中，降低粘度對(duì)于提高反應(yīng)效率和降低成本具有重要意義.

升溫時(shí)，所有DESs粘度降低，高粘度體系降幅更明顯.因溫度升高使分子間作用力減弱，分子獲得能量自由移動(dòng)，符合空穴理論：溫度升高增加分子間自由體積和溶劑孔隙大小，使溶劑分子更自由地移動(dòng)，使得溶劑粘度下降，密度變小.為進(jìn)一步研究不同DESs粘度隨溫度變化機(jī)理，利用擬合方程公式（4）計(jì)算[31]，結(jié)果如圖3及表4所示.

式（4）中： η 為某溫度下的DESs粘度； η₀ 為常 數(shù)； E_η 為DESs的粘流活化能 ?KJ/mol? ： R 為理想氣 體常數(shù) （8.314J?mol^-1?k^-1） ; T 為測(cè)定溫度（K）.

圖3不同體系DESs在 、45C，55C 下的粘度

表4DESs粘度與溫度擬合結(jié)果

圖4為所制備的21種DESs的粘度與溫度變化后的 lnη 和 1/T 呈良好的線性關(guān)系，符合阿倫尼烏斯方程.擬合結(jié)果如表4表明，相關(guān)系數(shù)均高于0.945，且DESs的粘流活化能 （E_η ）與粘度成正比. E_η 越大，其受溫度的影響越顯著，根據(jù)空穴理論， E_η 是流動(dòng)單元躍遷到空穴所需的最小能量.當(dāng)溶劑粘度較大時(shí)，空穴體積較小，分子間作用力較強(qiáng)，流動(dòng)單元躍遷所需的能量也更高.因此，DESs的粘度與溫度呈負(fù)相關(guān)，而與密度和分子間作用力呈正相關(guān).

圖4不同體系DESs的粘度與溫度的擬合圖

2.4.5不同低共熔溶劑中LipaseG50水解活力分析

DESs的出現(xiàn)極大地推動(dòng)了溶劑和生物酶催化領(lǐng)域的發(fā)展.現(xiàn)有研究表明，DESs能夠穩(wěn)定脂肪酶的結(jié)構(gòu)并作為保護(hù)劑，部分DESs甚至可以提升脂肪酶的活性[32，33].然而，目前關(guān)于DESs對(duì)脂肪酶的研究多集中于甘油三酯脂肪酶，而對(duì)偏甘油酯脂肪酶的作用研究較少.本研究以偏甘油酯脂肪酶LipaseG50為對(duì)象，探討不同DESs對(duì)其的影響，結(jié)果如圖5所示.

圖5不同DESs中LipaseG5O 的水解活力

在實(shí)驗(yàn)中觀察到，LipaseG5O在九種強(qiáng)酸性DESs（如ChCl-Lac、ChCl-CA、B-Lac、B-CA、ProLac、Lac-Gly、Lac-EG、Lac-U、Lac-Glu）中完全失活，表明強(qiáng)酸性環(huán)境會(huì)破壞酶的活性.值得注意的是，在某些體系（如B-Lac、Lac-U）中，滴定后會(huì)出現(xiàn)短暫的紅色，隨后迅速消失，而pH計(jì)測(cè)量結(jié)果顯示溶液呈中性，這使得滴定終點(diǎn)難以判斷.這一現(xiàn)象的原因在于滴定液中的水分破壞了DESs中的氫鍵，導(dǎo)致酸性組分被釋放并迅速被NaOH中和，雖然有研究通過(guò)添加類(lèi)似物來(lái)調(diào)節(jié)DESs的pH以適應(yīng)酶催化條件，但這會(huì)引入額外組分，使體系復(fù)雜化，而使用緩沖液調(diào)節(jié)pH則會(huì)引入水分，破壞DESs的結(jié)構(gòu)[33].因此，這類(lèi)強(qiáng)酸性DESs不僅不適用于LipaseG5O的催化反應(yīng)，還可能對(duì)其結(jié)構(gòu)造成破壞.

2.4.6 不同低共熔溶劑中LipaseG5O熱穩(wěn)定性分析

溫度能影響DESs的粘度，間接決定了生物酶在催化過(guò)程中的傳質(zhì)速率[34，35]，同時(shí)，溫度對(duì)于酶的活性也有著至關(guān)重要的影響.本研究以上述實(shí)驗(yàn)篩選的LipaseG5O在其中水解酶活較好的4種DESs為例，研究結(jié)果如圖6所示.

圖6LipaseG5O在不同體系和溫度下的水解酶活

由圖6可知，隨著溫度升高，五種體系下酶活性均下降，高溫破壞了酶的結(jié)構(gòu).但在 40°C 時(shí)，Li-paseG5O在ChCl-U中活性顯著提升，而在B-U中活性大幅下降.這可能是因?yàn)橛坞x脂肪酶需要更多水分維持穩(wěn)定，ChCl-U結(jié)合水分更緊密且ChCl吸水性強(qiáng)，而B(niǎo)-U中水分逐漸喪失，甜菜堿無(wú)法穩(wěn)定酶的水化層，高溫使氫鍵斷裂、尿素釋放，導(dǎo)致酶構(gòu)象改變.

此外，LipaseG5O在兩種脯氨酸基DESs（ProGly和Pro-U）中表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性.在ProGly中，酶活性在 60^°C 時(shí)仍保持 80% ， 70C 時(shí)保留 50% ;在Pro-U中， 30°C 時(shí)活性是無(wú)溶劑體系的2.5倍，盡管隨著溫度升高活性下降，但在 70°C 時(shí)仍有一定活性保留.這可能與體系中尿素的性質(zhì)和高溫有關(guān).

2.4.7 低共熔溶劑性質(zhì)與LipaseG50活力與穩(wěn)定性的相關(guān)性

研究表明，DESs的理化性質(zhì)直接影響LipaseG50 的活性和穩(wěn)定性.LipaseG50在DESs中表現(xiàn)出良好的酸堿耐受性，尤其對(duì)堿性DESs的耐受性優(yōu)于酸性體系.在高極性DESs（如ChCl-Lac、ChCl-CA、Lac-Glu）中，酶活性喪失可能與溶劑極性過(guò)大有關(guān).此外，高粘度 （gt;10000mPa?） 的DESs會(huì)顯著抑制酶活性，而粘度在 范圍內(nèi)的DESs則對(duì)酶活性影響較小.

尿素基HBDs和脯氨酸基HBAs構(gòu)成的DESs對(duì)LipaseG5O的活性和熱穩(wěn)定性有顯著促進(jìn)作用，可能分別通過(guò)保護(hù)酶分子表面的水化層和穩(wěn)定酶結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn).因此，在設(shè)計(jì)適合LipaseG50催化的DESs時(shí)，應(yīng)優(yōu)先選擇氨基酸類(lèi)、酰胺類(lèi)和醇類(lèi)組分，避免使用強(qiáng)酸性、強(qiáng)堿性、高極性或多羥基/多羧基組分，以防止體系粘度過(guò)高，從而優(yōu)化酶的催化性能.

3結(jié)論

在本研究制備了21種不同類(lèi)型的低共熔溶劑（DESs）.隨后，對(duì)這些DESs的理化性質(zhì)進(jìn)行了詳細(xì)的表征分析，并進(jìn)一步研究了它們對(duì)偏甘油酯脂肪酶（LipaseG5O）活性和穩(wěn)定性的影響.最終得出的研究結(jié)論如下：

（1）DESs的理化性質(zhì)主要由組分間的氫鍵網(wǎng)絡(luò)決定.其酸堿度受組分質(zhì)子供/受體能力的協(xié)同作用調(diào)控，極性主要由氫鍵受體（HBAs）主導(dǎo).黏度與分子間作用力及密度呈正相關(guān)，且隨溫度升高顯著下降，符合阿倫尼烏斯方程.水分活度分析表明，DESs中水分多以結(jié)合態(tài)存在，過(guò)量水分可能會(huì)破壞氫鍵結(jié)構(gòu).值得注意的是，以醇類(lèi)或酰胺類(lèi)為HBDs的DESs具有低黏度特性，更適合作酶催化體系；而多羥基/羧基類(lèi)DESs因其高黏度特性會(huì)影響酶促反應(yīng)傳質(zhì)效率.

（2）LipaseG50在DESs中表現(xiàn)出顯著的酸堿耐受性，當(dāng)極性在一定范圍內(nèi)變化時(shí)，對(duì)酶活性的直接影響不顯著；但在強(qiáng)極性或強(qiáng)酸性環(huán)境下，酶活性會(huì)顯著下降甚至失活.尿素基（ChCl-U、B-U）及脯氨酸基（Pro-Gly、Pro-U）DESs對(duì)酶活性和熱穩(wěn)定性具有雙重促進(jìn)作用.這一效應(yīng)可能與尿素對(duì)酶表面水化層的保護(hù)作用及脯氨酸對(duì)活性位點(diǎn)的輔助結(jié)合有關(guān).相比之下，強(qiáng)酸性（如Lac-Gly）或高黏度（如Pro-Lac）DESs因能破壞酶構(gòu)象或限制傳質(zhì)，導(dǎo)致酶活性顯著下降.

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