抗lGF-1R單克隆抗體對ALL細胞株細胞周期的影響

王健 林少汾 董紅 陳純(通訊作者)

（1中山大學孫逸仙紀念醫院兒科 廣東 廣州 510120）

（2中山大學附屬第七醫院兒科 廣東 深圳 518107）

急性淋巴細胞白血病（ALL）是兒童時期發病率最高的惡性腫瘤，是由造血干細胞增殖分化異常而引起的惡性血液病。目前在幾乎所有的國內外兒童ALL化療方案中，左旋門冬酰胺酶（L-asp）和糖皮質激素是誘導緩解方案中首選的有效治療藥物。但是，L-asp與糖皮質激素聯合誘導化療的同時也會妨礙胰島素的產生、釋放及功能，這兩種藥物均易誘發高血糖，發生率為4%～20%。并發高血糖導致腫瘤患者預后不良，除外高血糖增加感染的幾率外，高血糖本身合并的高胰島素及高胰島素生長因子Ⅰ型受體（IGF-ⅠR）水平或使用胰島素控制高血糖導致的高胰島素水平，也可能是導致該現象的原因之一。本課題通過體外實驗探討抗IGF-ⅠR單克隆抗體（anti-IGF-ⅠR monoclonal antibodies mAbs)對ALL細胞株Jurkat及Reh細胞周期的影響，間接證實IGF-ⅠR介導的AKT/mTOR通路在細胞凋亡中的可能作用。

1.材料和方法

1.1 一般資料

研究靶細胞為：Jurkat（人T淋巴細胞性白血病細胞）、Reh（人急性非B非T淋巴細胞白血病細胞），細胞株購自上海科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。將Jurkat及Reh細胞培養于含有10%的胎牛血清的RPMI 1640培養液中，在37℃含5%CO2飽和濕度的培養箱中培養，每2天進行半量傳代。

1.2 流式細胞儀檢測細胞周期

取對數期生長的細胞，調整細胞密度為3×105/ml，接種于24孔培養板.每孔加入lml細胞液，加入終濃度為0和lμg/ml的抗IGF-ⅠR單克隆抗體（ab16890），培養48h，收集對照組和處理組細胞，PBS洗滌2次，70%乙醇2ml 4℃固定24h。離心棄上清，PBS洗滌2遍后加人300μ1碘化丙啶(PI)染液重懸細胞，4℃避光孵育后上機檢測，所有試驗重復3次。

2.結果

以1μg/ml的ab16890作用于ALL細胞株后上機檢測細胞周期，在Jurkat細胞中（表1、圖1），與對照組相比，G0/G1期的細胞明顯增多（P=0.025），S期細胞減少（P=0.047），而G2/M期細胞變化不大（P=0.478），說明加藥后使細胞阻滯在G0/G1期。

Table.1 The percentage of each phase in theJurkat cells cycle that compared between two groups

Figure.1 The distribution of each phase of study variables between two groups were in Jurkat cell cycle compared betweentwo analyzed by paired T test.groups were showed using histogram.Comparison of study variables between two groups were analyzed by paired T test.

在Reh細胞中（表2、圖2），在加入1μg/ml的ab16890及胰島素作用后，與對照組相比，G0/G1期的細胞明顯增多（P=0.020），S期細胞減少（P=0.031），而G2/M期細胞也減少（P=0.045），變化趨勢與Jurkat細胞基本一致。

Table.2 The percentage of each phase in theReh cells cycle that compared between two groups.

Figure.2 The distribution of each phase of study variables between two groups were in Reh cell cycle compared betweentwo analyzed by paired T test.groups were showed using histogram.

3.討論

目前已有體外實驗證實，胰島素促進腫瘤細胞的生長，主要是通過活化AKT/mTOR信號通路途徑。PI3K/AKT/mTOR是細胞內重要的信號傳導通路之一，通過活化多種下游的效應分子，介導重要的細胞生理功能，包括促進細胞的增殖、活力和抑制凋亡、自吞噬，與人類多種腫瘤的發生發展密切相關[1]。而IGF-Ⅰ是PI3K/AKT信號通路的上游調節因子，發生高血糖時機體胰島素分泌，體內的IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ產生增加，IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ通過與IGF-1R結合募集PI3K到細胞膜并使其被激活，從而活化AKT/mTOR信號通路，產生下游生物學效應。近十年以來，以IGF-ⅠR為靶點進行靶向治療逐漸成為腫瘤藥物研究的熱點[2]。目前，體外實驗及臨床腫瘤活體樣本研究均發現，腫瘤的進展多與IGF-ⅠR表達量的增多有關[3]，且IGF-ⅠR的高表達往往伴隨著較差的預后。因此，阻斷IGF-ⅠR的活化當前已盡可能的應用于各種腫瘤治療中。抗IGF-ⅠR單克隆抗體作為一種靶向結合蛋白，可與IGF-ⅠR特異性結合，抑制IGF-ⅠR與其配體的結合，從而阻斷其介導的通路信號并較弱下游生物學效應。本實驗采用abcom公司生產的抗IGF-ⅠR單克隆抗體ab16890，以ALL細胞株為研究對象，探討抗IGF-ⅠR單克隆抗體對細胞周期的影響和可能機制。對于阻斷AKT/mTOR信號通路對細胞周期的影響，有研究發現PI3K的過度活化是細胞發生癌變的必要因素。PI3K能夠激活細胞周期依賴性蛋白激酶,使細胞從G0/G1期進入S期，誘導DNA的合成，同時PI3K也能對細胞周期依賴蛋白抑制物p27的表達產生調節作用。Collado等[4]應用PI3K的抑制劑LY294002作用于人膠質瘤U87MG細胞,結果發現p27表達升高,細胞阻滯在G0/G1期。另有文獻報道[5]，采用抗IGF-ⅠR單克隆抗體MK-0646作用于子宮內膜癌兩種細胞株ECC-1及USPC-1后檢測細胞周期，與IGF-Ⅰ處理細胞后相比，兩種細胞G0/G1期細胞比例均增加，同時S+G2/M期細胞減少。本實驗采用流式細胞術檢測在胰島素的基礎上加用1μg/mlab16890培養后細胞周期的變化，與陰性對照組相比，G0/G1期的細胞明顯增多（P=0.025、0.020），S期細胞減少（P=0.047、0.031），而G2/M期細胞變化不大（P=0.478、0.045），說明加藥后使細胞阻滯在G0/G1期，與上述文獻報道一致，猜測ab16890誘導ALL細胞凋亡并使細胞阻滯在G0/G1期可能與胰島素介導的AKT/mTOR信號通路受到阻滯有關。