親和層析技術(shù)在生物科學(xué)中的應(yīng)用及發(fā)展

摘 要：近幾十年來(lái)，親和層析技術(shù)發(fā)展十分迅速，廣泛應(yīng)用于生物分子(如結(jié)合蛋白、酶、抑制劑、抗原、抗體、激素、激素受體、糖蛋白、核酸及多糖類等)及組織(如細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒等)的分離和純化，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中重要的技術(shù)之一。介紹了親和層析的基本類型及配體合成的研究進(jìn)展，概述了親和層析技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)以及在其他方面的應(yīng)用和發(fā)展動(dòng)態(tài)。

關(guān)鍵詞：親和層析；基本原理；類型；應(yīng)用

中圖分類號(hào)：Q819

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007—7847(2006)01—0012—06

親和層析(amnitychromaloSraphy)是利用偶聯(lián)親和配體的親和吸附介質(zhì)為固定相親和吸附目標(biāo)產(chǎn)物，使目標(biāo)產(chǎn)物得到分離純化的液相層析法，近幾十年來(lái)，親和層析技術(shù)發(fā)展十分迅速，并在生物技術(shù)產(chǎn)品、生物分子及組織的分離和純化領(lǐng)域取得令人矚目的成就。現(xiàn)已廣泛用于分離純化蛋白質(zhì)、肽、酶及其底物和抑制劑、抗體及抗原、核酸及其特異性作用物、激素及受體、細(xì)胞及細(xì)胞表面物等等”。基于此，本文針對(duì)親和層析的基本類型，配體的選擇和親和層析在生物學(xué)特別是蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用等方面作一介紹。

1 親和層析的類型

親和層析柱中被固定的配體是決定親和層析成功的關(guān)鍵因素。根據(jù)配體與生物大分子之間相互作用體系不同，可以把親和層析分為以下4種類型。

1．1 生物親和層析(BAFC)

生物親和層析是利用自然界中存在的生物特異性相互作用物質(zhì)對(duì)的親和層析。通常具有高的選擇性。典型的物質(zhì)對(duì)有酶-底物、酶-抑制劑、激素—受體等。

1．2 免疫親和層析(1AFC)

利用抗原抗體中的一方為配體，親和吸附另一方的分離系統(tǒng)，稱免疫親和層析，免疫親和層析應(yīng)用相當(dāng)廣泛，許多典型的親和層析純化蛋白質(zhì)的過程已經(jīng)使用了單克隆抗體作為親和配體，目前，利用抗體－抗原模式，有可能得到每一種目標(biāo)蛋白的單抗，然后以單抗為配基，通過親和層析技術(shù)分離純化目標(biāo)蛋白質(zhì)。此種方法的純化倍數(shù)活性回收率非常高。蛋白A和蛋白C作為抗體結(jié)合蛋白已被應(yīng)用于免疫親和層析技術(shù)，是分析人類免疫球蛋白，特別是IgG—類抗體的很好的免疫親和層析的配體。用免疫層析柱進(jìn)行各種類型的免疫檢測(cè)被稱為免疫檢測(cè)法，特別適用于檢測(cè)含量低微的樣品。免疫檢測(cè)法利用被標(biāo)記的抗體或模擬分析物來(lái)進(jìn)行間接的被分析物的分析。常用標(biāo)記如酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記、化學(xué)熒光等。

1.3 金屬離子親和層析(IMAC）

金屬離子親和層析是利用金屬離子的絡(luò)合物或形成整合物的能力吸附蛋白質(zhì)的分離系統(tǒng)。目的蛋白質(zhì)表面暴露的供電子氨基酸殘基，如組氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基，十分有利于蛋白質(zhì)與固定化金屬離子結(jié)合，這是IMAC用于蛋白質(zhì)分離純化的根據(jù)。金屬離子如鋅和銅，已發(fā)現(xiàn)能很好地與組氨酸的咪唑基及半胱氨酸的巰基結(jié)合。含有不同數(shù)量的這些基團(tuán)的蛋白質(zhì)可以通過金屬離子親和層析得到分離。

1.4 擬生物親和層析(BiomimeticAFC)

擬生物親和層析是利用部分分子相互作用，模擬生物分子結(jié)構(gòu)或某特定部位。以人工合成的配基為固定相吸附目的蛋白質(zhì)的親和層析，如以染料親和層析(DAFC)和氨基酸(包括多肽親和層析(AALA)。染料配基，例如三嗪(triazine)或三苯甲烷化合物，能通過共價(jià)鍵牢固地結(jié)合到親和載體上，染料配體與很多蛋白以及酶的活性位點(diǎn)相互作用，以模仿這些生物分子的底物、輔助因子或結(jié)合劑的形式進(jìn)行。

2 親和層析配體的設(shè)計(jì)以及應(yīng)用組合方法篩選配體

親和層析是一種非常有效的大規(guī)模純化生物技術(shù)產(chǎn)品的分級(jí)分離技術(shù)并已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)和其他領(lǐng)域的研究。盡管其具有很大潛力，但針對(duì)每個(gè)目標(biāo)是否能得到適當(dāng)?shù)呐潴w，親和層析方法的利用是受到限制的。近年來(lái)發(fā)展的利用分子模型對(duì)配體進(jìn)行設(shè)計(jì)和組合化學(xué)相結(jié)合已經(jīng)成為一種為特定生物技術(shù)需求產(chǎn)生新穎而特異性強(qiáng)的配體的創(chuàng)新方法。

2．1 親和層析配體的設(shè)計(jì)

依據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)配體：理性設(shè)計(jì)配體的策略包括從合適的數(shù)據(jù)庫(kù)獲取關(guān)于目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)信息并確定蛋白上可能的結(jié)合位點(diǎn)。目標(biāo)位點(diǎn)可能是一活性位點(diǎn)、裸露于溶劑的區(qū)域或是參與同一中性互補(bǔ)配體相結(jié)合的部位。依據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)配體要考慮兩個(gè)重要因素：第一，正確地預(yù)計(jì)被設(shè)計(jì)的配體構(gòu)像的能力；第二，正確預(yù)計(jì)配體的親和力的能力。一些成功地利用蛋白設(shè)計(jì)配體的方法已報(bào)道。例如，針對(duì)L-乳酸脫氫酶而設(shè)計(jì)的蒽醌模仿生物的染料—配體。

依據(jù)蛋白功能設(shè)計(jì)配體：當(dāng)目標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu)未知的時(shí)候，可依據(jù)蛋白的功能對(duì)配體進(jìn)行設(shè)計(jì)，并依賴于考慮配體一定的結(jié)構(gòu)特征。歸納如下：

1)符合一定要求的分子的形狀。例如，線形帶負(fù)電荷的分子肝磷脂對(duì)于純化DNA－結(jié)合酶是一種常規(guī)方法，另外純化核苷酸結(jié)合酶的配體三嗪染料CibacronBlue 3GAca具備能與一些酶的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)形成合適的相互作用所需的幾何結(jié)構(gòu)以及離子和疏水性的基團(tuán)。

2)配體具特異功能團(tuán)。例如苯甲脒作為胰蛋白酶類蛋白酶的配體，羥氨基酸作為與金屬結(jié)合的蛋白的配體。

3)兩個(gè)或數(shù)個(gè)已知的底物、抑制劑、效應(yīng)體或輔助因子這樣的結(jié)構(gòu)模體的結(jié)合體衍生的結(jié)構(gòu)模型。例如酮—羧基仿生物嵌合染料-配體被設(shè)計(jì)作為純化識(shí)別(酮)羧基的酶的配體。

2.2 組合方法篩選配體

應(yīng)用組合化學(xué)的方法建立多肽文庫(kù)，然后利用多肽文庫(kù)來(lái)篩選與目的蛋白特異性結(jié)合的多肽配基，這一觀點(diǎn)的提出大大促進(jìn)了親和層析篩選及合成配基技術(shù)的發(fā)展。過去的十幾年中已出現(xiàn)了允許產(chǎn)生多達(dá)10種不同的蛋白，肽鏈或核酸文庫(kù)的方法。這樣的大文庫(kù)使選擇高親和性和特異性的分子成為可能。在尋找配體時(shí)可應(yīng)用兩個(gè)策略。首先，篩選能與各種類型大文庫(kù)中的生物分子相結(jié)合的目標(biāo)物，然后引進(jìn)一個(gè)設(shè)計(jì)的方法來(lái)縮小被引導(dǎo)的文庫(kù)的大小規(guī)模。這個(gè)被采納的方法主要取決于一開始時(shí)我們有什么信息，如果有被分析物的結(jié)構(gòu)的信息，設(shè)計(jì)配體就有可能；然而如果沒有這樣的信息，組合方法來(lái)篩選配體可能是唯一的途徑，從第一代文庫(kù)獲得的結(jié)合分子能被用做母體支架產(chǎn)生另外的新文庫(kù)，從這種新的文庫(kù)中可篩選出更高活性的結(jié)合物配體。已有報(bào)道從(多)肽，多核苷酸以及替代的三嗪類化合物文庫(kù)中篩選親和配體的組合方法的應(yīng)用。

2．2，1 合成的肽文庫(kù)

合成的肽文庫(kù)是隨機(jī)肽分子的集合體，包含給定肽鏈長(zhǎng)度所有可能的順序。用固相肽合成方法化學(xué)合成肽分子。合成好的肽可從可溶性的肽文庫(kù)斷裂開或者保留在一個(gè)小珠一種結(jié)構(gòu)的肽文庫(kù)的樹脂上。一個(gè)基本的體外篩選組合化學(xué)文庫(kù)方法是讓文庫(kù)中的混合物流經(jīng)一待測(cè)定蛋白已被固定在其表面的通路。具備與固定在表面的蛋白分子有親和性的配體是那些在它們通道上受到阻力的肽，它們通常是親和層析配體很好的候選物。用這樣的方法，具備F-L-L-V-P-L順序的肽配體己被合成并用于人類纖維蛋白原的純化。

2.2.2 噬菌體展示(phagedisplay)

噬菌體展示已經(jīng)迅速成熟并演變成為親和層析發(fā)現(xiàn)高親和性配體的工具。這一技術(shù)是在一稱為生物淘洗的篩選過程中依據(jù)利用噬菌體展示文庫(kù)來(lái)快速鑒定高選擇性的配體，以噬菌體展示得出的肽用親和方法選擇可用兩種方式進(jìn)行。文庫(kù)可直接用被固定的目標(biāo)培養(yǎng)或者在被固定到固體支撐物以前用目標(biāo)預(yù)培養(yǎng)，如同親和層析一樣，相互作用的肽或蛋白特異地或非特異地洗脫出。這些相互作用的噬菌體可用細(xì)菌感染來(lái)放大以增加它們的拷貝數(shù)。這個(gè)篩選／放大過程可多次重復(fù)以獲得較高親和性的噬菌體展示肽。期望的順序可通過對(duì)被分離出的噬菌體DNA順序測(cè)序獲得。噬菌體展示文庫(kù)已經(jīng)成功應(yīng)用于抗原決定基定位，發(fā)展疫苗，鑒定蛋白激酶底物，具生物活性的肽以及非肽配體的肽模擬，并且很適合作為色譜分析的親和配體來(lái)源。蛋白A的免疫球蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域已被展示在噬菌體的表面，使篩選具改進(jìn)的特異性或溫和的洗脫條件的蛋白A變異體親和層析條件成為可能。Gaskin等人描述了利用展示在細(xì)絲狀噬菌體M13表面的7氨基酸肽文庫(kù)作為根毛霉脂肪酶(Rhizomucormieheilipase)可能的親和配體來(lái)源。

2．2．3 核糖體展示和SELEX進(jìn)行的親和選擇

核糖體展示特別適合于掃描和篩選折疊的蛋白，原理總結(jié)如下：首先一DNA文庫(kù)被轉(zhuǎn)錄成mRNA，該mRNA在體外被翻譯，由于缺乏一休止符，阻止了mRNA和肽從核糖體中釋放出來(lái)，在適當(dāng)?shù)臈l件下形成一穩(wěn)定的三元體復(fù)合物。該復(fù)合物然后暴露于固定在一表面的目標(biāo)分子。如果肽與目標(biāo)以充分的親和力相結(jié)合，復(fù)合物就保留了，低親和性的肽被洗脫掉，粘附著的核糖體三元復(fù)合物可被EDTA解離，mRNA再反轉(zhuǎn)錄成cDNA并可由PCR擴(kuò)增強(qiáng)度．指數(shù)濃縮法系統(tǒng)發(fā)展配體(SELEX)被廣泛應(yīng)用于篩選核酸配體，體外篩選已被用來(lái)針對(duì)目標(biāo)確定核酸配體，這些目標(biāo)覆蓋廣泛的體積大小，并包含簡(jiǎn)單離子，肽鏈，蛋白，細(xì)胞器官，病毒，甚至整個(gè)細(xì)胞。

合成的化學(xué)配體在蛋白層析中的作用在過去的幾十年的應(yīng)用中已經(jīng)非常實(shí)在，離子交換，疏水性的和金屬螯合的吸附劑一起構(gòu)成一種固定在基質(zhì)骨架上的確定的、超級(jí)穩(wěn)定和沒有毒性的人工合成功能體，并與蛋白表面帶電荷、非極性或金屬結(jié)合的群體發(fā)生親和作用。例如，組合化學(xué)技術(shù)正開始對(duì)發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)新的融合肽金屬配體發(fā)生較大影響。

2．3 從頭設(shè)計(jì)配體

由于能將X射線晶體學(xué)，NMR或同源結(jié)構(gòu)的知識(shí)與限定的或組合化學(xué)合成以及先進(jìn)的計(jì)算機(jī)技術(shù)相結(jié)合，合理設(shè)計(jì)親和配體變得更切實(shí)可行，有效，符合邏輯且更快，這種方法依賴于利用目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)信息有目的地集中引導(dǎo)配體的合成并使合成的努力限定朝向已經(jīng)過實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)能結(jié)合到被檢測(cè)目標(biāo)或預(yù)計(jì)能結(jié)合到目標(biāo)的方向。該方法包括以下的步驟：選擇目標(biāo)蛋白上合適的位點(diǎn)，設(shè)計(jì)與該位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)相配伍的配體，合成一個(gè)結(jié)構(gòu)上相關(guān)聯(lián)的固相的組合配體文庫(kù)，并針對(duì)目標(biāo)蛋白掃描這個(gè)文庫(kù)。

針對(duì)IgG的非肽仿生物配體已經(jīng)建立，它是依據(jù)蛋白A的B結(jié)構(gòu)域和lgG的Fc片段組成的復(fù)合物的X射線晶體學(xué)結(jié)構(gòu)獲得的。利用計(jì)算機(jī)協(xié)助的分子模型，一系列圍繞蛋白A雙肽Phel32-Tyrl33的仿生物分子被設(shè)計(jì)出。其中一個(gè)這樣的配體能與人類IgG結(jié)合，該配體在三嗪環(huán)上帶有3－氨基苯酚和4－氨基-l-萘酚部分，當(dāng)這個(gè)仿生物配體被固定到瓊脂糖上被成功地用于純化人類血漿的IgG。為重組胰島素前體M131以及重組人類凝固因子Vllar351等而設(shè)計(jì)的仿生物學(xué)配體的類似方法也已建立。

3 親和層析的應(yīng)用

3．1 親和層析在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)組學(xué)最常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)是用于分離蛋白的雙相電泳(2—DE)和用于鑒定被分離蛋白的質(zhì)譜(MS)技術(shù)。然而親和層析也是起很大作用的分離方法．蛋白被2-DE分離之前，親和層析主要被用作選擇性地預(yù)先濃縮和預(yù)處理樣品。其應(yīng)用包括去除一種或一類會(huì)干擾2—DE的分辨率的蛋白，一個(gè)典型的例子是血清及腦脊髓液樣品的白蛋白和免疫球蛋白IgG的去除，是通過吸附在親和樹脂上的方法進(jìn)行的，這樣可顯著提高2-DE膠上蛋白斑點(diǎn)的分辨率，另外，親和層析可濃縮低豐度的蛋白，這樣它們就可在2-DE膠上被看到；還可將所有蛋白分類成兩組或幾組以便進(jìn)一步分析。

很多情況下對(duì)那些還沒有進(jìn)行2-DE分離的樣品進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定，測(cè)定前可借助親和層析進(jìn)行分離而減輕樣品的復(fù)雜程度。對(duì)非2—DE基礎(chǔ)上的研究，親和層析能被用在蛋白水解消化之前或之后的蛋白以及肽鏈的分離。例如凝集素親和層析已被用來(lái)在蛋白水解消化之后分離提取一類特異的糖蛋白，并濃縮糖肽。這種方法對(duì)研究轉(zhuǎn)錄后修飾蛋白特別有用。親和層析也被用來(lái)研究轉(zhuǎn)錄后修飾的位點(diǎn)。親和層析分析糖蛋白是利用目標(biāo)聚糖甚至在蛋白質(zhì)水解以后都能被凝集素識(shí)別而進(jìn)行的，利用抗體和某些IMAC的親和層析可用來(lái)分離并濃縮糖肽。

對(duì)于細(xì)胞是怎樣作為系統(tǒng)而運(yùn)行的理解取決于測(cè)定細(xì)胞蛋白—蛋白間相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。蛋白復(fù)合物的親和純化后進(jìn)行蛋白質(zhì)譜鑒定已作為產(chǎn)生蛋白-蛋白間相互作用圖譜和復(fù)合物在細(xì)胞中位置圖譜的有力工具。所有鑒定蛋白復(fù)合物的親和純化方法都是利用給蛋白加標(biāo)簽進(jìn)行的，在遺傳水平上或是在從細(xì)胞中提取蛋白的水平上。蛋白親和層析方法可能比酵母雙雜交方法更優(yōu)越，因?yàn)樗a(chǎn)生較少的假陽(yáng)性結(jié)果并且是更適用于高通量(高數(shù)量被檢測(cè)的樣品)的操作。親和層析能純化細(xì)胞中形成復(fù)合物的蛋白，目標(biāo)蛋白能與那些相關(guān)聯(lián)的蛋白一起從例如細(xì)胞溶解產(chǎn)物中被純化。重組DNA技術(shù)用例如GST、抗原決定基或TAP這樣的肽鏈片段標(biāo)記物來(lái)給“誘餌”蛋白標(biāo)上標(biāo)簽。一種大規(guī)模的方法可用這些商品肽段標(biāo)記所有誘餌蛋白。利用TAP的方法經(jīng)過lgG小珠和鈣調(diào)蛋白小珠兩個(gè)相連續(xù)的親和步驟來(lái)純化含有TAP標(biāo)記蛋白的蛋白復(fù)合物。

盡管2-DE與MS／MS并聯(lián)的方法已經(jīng)能對(duì)雙向電泳膠中的蛋白進(jìn)行相對(duì)定量，但利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記而使蛋白質(zhì)組學(xué)的定量分析更能夠?qū)崿F(xiàn)。一類小分子試劑，同位素編碼的親和標(biāo)記物已被用來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的定量分析。一種方法是借助MALDI-TOF質(zhì)譜儀和ICAT標(biāo)記物試劑對(duì)復(fù)雜的蛋白混合物進(jìn)行分析。

3．2 分離純化目的蛋白、定量測(cè)定

近年來(lái)，高速發(fā)展的生物制藥工業(yè)已廣泛應(yīng)用親和層析技術(shù)作為其重要的分離純化和定量測(cè)定用于臨床藥物的工具。親和層析最常用于靶標(biāo)蛋白尤其是疫苗的分離純化上．特別在融合蛋白的分離純化上，親和層析更是起到舉足輕重的作用，因?yàn)槿诤系鞍拙哂刑禺愋越Y(jié)合能力。親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應(yīng)用相當(dāng)廣泛，其中，以對(duì)分別帶有(His)₆和GST親和標(biāo)記的融合蛋白的抗原Ni-NAT和GST親和層析應(yīng)用相當(dāng)廣泛。金屬螯和層析與免疫親和層析也得到一定的應(yīng)用。

近年來(lái)，將親和層析原理用于定量分析主要與免疫技術(shù)相結(jié)合，對(duì)抗原和抗體進(jìn)行微量分析，并發(fā)展出了放射免疫、酶標(biāo)免疫及熒光抗體等技術(shù)。另外，親和層析技術(shù)被廣泛應(yīng)用于與生物大分子與其特異性作用物的結(jié)合常數(shù)的測(cè)定以及復(fù)合物的定量分析。親和層析技術(shù)在臨床上已有了較多的應(yīng)用，例如對(duì)糖基化蛋白的定量分析技術(shù)。另外，固定有抗人類轉(zhuǎn)鐵蛋白的免疫親和層析柱被應(yīng)用于對(duì)稀釋的血清轉(zhuǎn)鐵蛋白異構(gòu)體的純化和鑒定。

3．3 生物分子間相互作用的鑒定

親和層析也被用來(lái)研究生物系統(tǒng)中生物分子間發(fā)生的相互作用。該領(lǐng)域已被用來(lái)檢驗(yàn)各種生物系統(tǒng)，包括凝集素lectin／糖，酶／抑制劑，蛋白／蛋白，以及DNA／蛋白間的相互作用，臨床上主要將該技術(shù)用于研究藥物或激素與血清蛋白間的結(jié)合。兩種層析方法可用來(lái)研究生物間相互作用。一種是zonal洗脫研究，另一種是前沿frontal分析研究。

3．4 親和層析與其他分析技術(shù)相結(jié)合

近年來(lái)的另一發(fā)展趨勢(shì)是尋求更加優(yōu)化的系統(tǒng)設(shè)計(jì)和安排形式，從而獲得快速、優(yōu)良的選擇性以及很大數(shù)量被檢測(cè)的樣品。親和層析與其他分析技術(shù)串聯(lián)結(jié)合即可很好地達(dá)到這一目的．目前已經(jīng)有很多成功運(yùn)用親和層析(AFC)-MS、AFC-HPLC、AFC-HPLC—MS、AFC-CE(毛細(xì)管電泳)等串聯(lián)結(jié)合的應(yīng)用。這種結(jié)合因其不可替代的優(yōu)點(diǎn)，仍將繼續(xù)發(fā)展。

4 結(jié)語(yǔ)

在發(fā)現(xiàn)和生產(chǎn)治療疾病的蛋白方面的挑戰(zhàn)已經(jīng)使人們有必要重新考慮設(shè)計(jì)和進(jìn)行純化的過程，這種選擇主要是由方法的引進(jìn)速度，有效性，穩(wěn)定性和經(jīng)濟(jì)承受能力決定的。傳統(tǒng)的純化規(guī)程正被高度選擇性和成熟的以親和層析為基礎(chǔ)的策略所代替。這種技術(shù)對(duì)于純化提供一種理性的設(shè)計(jì)并刺激和探索選擇性純化目標(biāo)蛋白的分子識(shí)別的自然生物過程。親和層析可能是現(xiàn)行僅有的著重于高通量和擴(kuò)大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)關(guān)鍵問題的分離技術(shù)。主要的問題是設(shè)計(jì)新的技術(shù)來(lái)確定與假設(shè)目標(biāo)相結(jié)合的高選擇性的親和配體。利用理性和組合的方法設(shè)計(jì)具高選擇性和穩(wěn)定性的配體對(duì)于親和層析未來(lái)的應(yīng)用會(huì)有巨大的影響。致謝：特別感謝梁宋平教授、張健教授和曾雄智博士對(duì)本文所提出的寶貴意見!