曲古抑菌素Ａ對結腸癌細胞株ＳＷ４８０細胞周期影響的機制研究

摘 要：為了研究組蛋白去乙?；?HDACs)抑制劑曲古抑菌素A(TSA)對結腸癌細胞周期和凋亡的影響，初步探討TSA作用細胞周期的可能機制，將人結腸癌細胞系SW480經TSA處理后，運用流式細胞術檢測細胞周期、凋亡以及細胞周期素的變化，最后采用western-blot對細胞周期相關的基因進行檢測。結果表明，TSA處理細胞后，TSA能夠延緩細胞周期G₁-S進程，阻滯細胞于G₁期，并且影響細胞周期素cycliE、cyclinA聚集，而對凋亡無明顯的影響。Westem-blot顯示，TSA能夠上調p21^Wafl/Cipl、p27^Kipl的表達，下調CDK2、cyclinE以及cycli-nA的表達。以上結果說明在結腸癌細胞中，TSA能夠通過上調p21^Waftl/Cipl、p27^Kipl的表達以及下調CDK2、cy-clinE、cyclinA的表達，從而阻滯細胞周期于G₁期，最終影響腫瘤細胞的生長，以上研究為HDAC抑制劑應用于結腸癌治療提供了理論依據。

關鍵詞：結腸癌；曲古抑菌素A(TSA)；細胞周期

中圖分類號：Q786；R735．3⁺5

文獻標識碼：A

文章編號：1007—7847(2006)01-0039-06

真核細胞中，遺傳信息貯藏在高度保守的染色質中，染色質的基本結構單位是核小體，核小體是由146 bp的DNA包繞著核心組蛋白構成的，核心組蛋白包括：H2A、H2B、H3、H4.核心組蛋白在進化中是高度保守的，而可被翻譯后修飾的主要是核小體外的N端的氨基酸尾巴。組蛋白末端能被各種不同的翻譯后修飾，包括：乙?；⒓谆?、磷酸化。其中乙酰化、泛素化修飾賴氨酸；磷酸化修飾蘇氨酸、絲氨酸；甲基化既能修飾精氨酸又能修飾賴氨酸。

現在研究得比較清楚的翻譯后修飾是乙?；揎棇毎飳W的影響，通常情況下，HDAC(組蛋白去乙?；?和HATs(組蛋白乙酰化酶)調節著賴氨酸和精氨酸的乙?；癄顟B，以保持基因的活性或失活狀況，組蛋白乙酰化與基因活化以及DNA復制相關，組蛋白的去乙?；突虻氖Щ钕嚓P。乙酰化轉移酶(HATs)主要是在組蛋白H3、H4的N端尾上的賴氨酸加上乙酰基，去乙?；?HDACs)則相反，不同位置的修飾均需要特定的酶來完成。乙?；讣易蹇勺鳛檩o激活因子調控轉錄，調節細胞周期，參與DNA損傷修復，還可作為DNA結合蛋白。去乙酰化酶家族則和染色體易位、轉錄調控、基因沉默、細胞周期、細胞分化和增殖以及細胞凋亡相關。

結腸癌是多基因、多步驟的致癌過程，包括癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活等。而在基因的表達調控中，表觀遺傳修飾有著重要的作用，主要包括DNA甲基化修飾和組蛋白乙?；揎?。曲古抑菌素A(trichostatinA，TSA)是去乙?；?HDAC)抑制劑。HDAC抑制劑可以通過抑制組蛋白去乙?；?HDACs)，阻斷由于HDAC募集功能紊亂而導致的基因表達受抑，從而達到抗腫瘤效應，本研究通過TSA體外作用于結腸癌細胞SW480，對處理作用前后細胞的細胞周期、細胞周期素以及相關的蛋白表達進行觀察與研究，從而探討TSA的作用機制，為將更為有效的HDAC抑制劑應用于結腸癌治療提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 主要試劑

TSA溶于DMSO(二甲基亞砜)中，濃度為(1g／L)置于-20℃冰箱。TSA及DMSO均購自Sigma公司(由晶美生物工程有限公司代理)，RPMll640購自GIBCO公司，小牛血清購自杭州四季清公司，MIT購自寶泰克公司。一抗p53、p21、p27、CDK2、cyclinE、cyclinA、a-tublin購自SantaCruz，anti-AcetylatedH3購自Upstate。

1.2 細胞株及細胞培養

SW480細胞系購自中南大學分析測試中心細胞生物室。采用10％小牛血清的RPMll640培養液(含有1 x10⁵U／L)青霉素和100mg／L鏈霉素)，在37t、5％的C02孵箱中培養．取對數生長期細胞進行實驗。

1．3 細胞周期分析

收集TSA作用8h后的細胞，用70％的預冷乙醇固定24h 以上，加1 mLPC緩沖液和100mg／LRNase(Sigma公司)50μL后，再加人50mg／L碘化丙錠(Sigma公司)5001tL，4℃室溫避光30min，而后用流式細胞儀(FACSsort，BectonDickinson)分析細胞周期。

1.4 WesternBlot

用3去污試劑提取總蛋白質，用Bradford方法測定蛋白質濃度。等量蛋白質采用SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進行分離，然后轉至PVDF膜上，室溫下搖動封閉(TBS2T+5％脫脂奶粉)2h后，加入相應的一抗4℃過夜，室溫下洗膜后加入辣根過氧化物酶(HRPO)偶聯羊抗鼠IgG，最后用化學發光底物進行發光顯跡，

1.5 細胞乙?；降臋z測

對于TSA處理細胞后乙?；降臋z測，我們主要采用western-blot的方法，針對乙?；M蛋白3的表達水平來判定處理后細胞的乙酰化水平，并且采用a-tublin做為內對照。

2 結果

2．I TSA能夠提高SW480細胞乙?；?/p>

我們根據文獻提供的TSA濃度(50μg／L)r5l，處理細胞，分別在0、2、4、8、16h收集細胞，采用acetylatedH3抗體進行western-blot檢測其處理后細胞的乙?；?，a-tublin做為內對照，結果(圖1)顯示：95A處理后2h乙?；介_始增加，8h到達高峰，16h后乙酰化水平略有下降。這說明TSA處理SW480細胞8h后乙?；降竭_最高峰，故在下面的實驗中我們都以TSA(501xg／L)處理細胞8 h為基礎進行研究。

2．2 TSA能夠阻滯細胞周期G1－S期進程，并且能夠明顯下調細胞周期紊cyclinE、cyclinA的表達

我們將TSA處理細胞8h后，用乙醇固定，然后進行流式細胞計數分析，結果(圖2)顯示：TSA處理后，G_o／G₁細胞從36．29％升高到60，21％，說明TSA能夠阻滯細胞周期G～S期進程．而對凋亡無明顯影響。進而我們對細胞周期素cyclinDl、cyclinE、cyclinA以及cyclinB進行了檢測，結果顯示：TSA處理細胞后，細胞周期素cyclinDl以及cyclinB處理前后無明顯的改變(結果未顯示)，而cyclinE與cyclinA經TSA處理后明顯降低(圖3)，這說明TSA能夠降低cyclinE與cvclinA表達。

2．3 TSA處理細胞后能夠上調p21^wan/ciplp27^kip1、下調CDK2以及進一步證實下調cyclinE以及cyclinA表達。

由于通過流式細胞分析我們發現TSA處理細胞后能夠阻滯細胞于C₁期，并且發現cyclinE和cyclinA下調，而cyclinE，cyclinA主要在細胞周期C1的中晚期表達，這說明TSA可能主要作用于C₁的中晚期，因而我們進一步采用了western-blot對p21、p27、p53、CDK2等影響細胞周期C₁中晚期的關鍵分子進行了檢測，結果顯示(圖4)：TSA處理細胞后，對p53表達無明顯影響；但能夠明顯上調p21^wan/cipl和p27^kipl，的表達以及降低Cdk2、cvclinE以及cyclinA的表達。

3 討論

組蛋白脫乙?；?histone deacetylaseHDACs)，其功能是催化乙?；暮诵慕M蛋白脫去乙酰基，這種脫乙酰酶可能介導了某些位點特異DNA結合的轉錄抑制子抑制轉錄的功能，或者通過脫乙?；淖兞巳旧|的構象而抑制轉錄，故脫乙?；c轉錄抑制有關。組蛋白乙?；负兔撘阴；副旧砜赡軈⑴c了轉錄調控，而乙酰化與脫乙?；慕Y果也影響基因的活性，而且是激活與抑制兩種相反的作用。通過組蛋白乙?；降膭討B變化來發揮正反兩方面的作用，使轉錄在對立統一的基礎上受到調節，以滿足生命活動的需要。

許多研究報道HDAC抑制劑如NaBu和TSA能夠誘導多種腫瘤細胞的生長停滯或凋亡。本研究中我們采用TSA(50μg／L)處理結腸癌細胞SW480后，流式細胞計數分析發現Co／G₁，期細胞明顯增多，細胞周期C₁-S進程被延緩，細胞阻滯在C₁期，而對凋亡無明顯影響，通過對細胞周期素的分析，我們發現TSA處理后cyclinDl、cy-clinB無明顯的改變，cyclinE以及cyclinA被明顯下調。

真核細胞的細胞周期行進受細胞周期依賴性蛋白激酶(Cyclindependentkinases，CDKs)、cdk亞單位和周期素調節亞單位調控。目前，人類細胞主要的CDKs有CDKl(CDC2)、CDK2、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7(CDK activating kinases，CAK)；主要的周期素有CyclinA、CyclinB、Cy－clinDl、CvclinD2、CyclinD3和CyctinE．CDK的時相性激活是細胞周期調控機制的核心，它主要依賴于Cvclin蛋白表達的細胞周期特異性起伏來調節，二者的協調性表達確保了細胞周期發生的時間性、協同性，在細胞周期行進的不同時期，由不同Cvclin蛋白的表達驅動，如：CDC2與CyclinB1的結合是M期事件的啟動和進行的必要條件，CDK2與Cyclin A的結合是C2期事件的啟動和進行的必要條件，CDK2還負責S期的進行，與Cyclin E結合是S期啟動的必要條件，CDK2、CDK4與Cyclin結合，而CDK2、CDK4、CDK5、CDK6與CyclinDl、D2、D3結合是Cl期運行的必要條件。

CylinE主要表達于C，中晚期，是哺乳動物細胞周期通過C，期進入S期所必須的限速因素之一，它通過與Cdk2相互作用，調節細胞周期的行進，Cdk2結合CyclinE形成的CyclinE／Cdk2復合體，通過直接結合E2F／P107，使其釋放E2F的CvclinA啟動子結合位點，激活CyclinA轉錄，加速細胞周期跨過C₁／S關鍵點，進入S期，CyctinA作為S期的主要調節蛋白，在Cl晚期開始表達合成，是S期DNA復制所必需的。當腫瘤抑制基因如p27KipI的表達減少，CyclinE／Cdk2與E2F／P107即可在C₁晚期形成復合體，促進CyclinA的合成，加速細胞周期行進，因此，細胞進AS期和G2／M過渡離不開CyclinA的功能。

我們發現TSA處理細胞后能夠下調CyclinE和Cdk2表達，這說明TSA能夠抑制C2期的Cy－clinA激活和合成，將細胞周期行進阻滯于C1晚期．對于p21^wafl/cipl和p27^kipl，研究表明可以通過抑制CyclinE和Cdk2的相互作用將細胞周期阻滯于G₁期。同樣，p27_kipl可以通過誘導E2F抑制復合體的形成，并抑制E2F調節基因的表達，阻斷CyclinE依賴的CyclinA的表達造成細胞周期的G1期捕獲。通過westerBblot我們進一步分析了CDK抑制子p21^{wai/ciPl和p27kipl表達的活性改變，結果顯示：TSA處理細胞后p21_wal/cipl和p27Kivl表達上調，結合對Cdk2的分析結果，認為TSA可能通過上調p21wafl/cipl和p27kipl的表達、抑制Cdk2的激酶活性，達到阻止細胞周期進行，影響細胞增殖的目的。}

本研究通過TSA體外作用于結腸癌細胞SW480，初步闡明了TSA阻滯結腸癌細胞SW480細胞周期于C¹期的可能機制，這為HDAC抑制劑應用于結腸病治療提供理論依據。