羊松果體細胞原代培養及其生物學特性的研究

摘 要：體外培養山羊及綿羊的松果體細胞，觀察其增殖情況和功能狀態的變化。結果顯示：山羊、綿羊的松果體細胞體外形態及生長情況相似。細胞多呈圓形或多角形，細胞體積有增大趨勢。采用MTT了法檢測細胞生長狀態，發現細胞有明顯的增殖現象，大約于11 d達到高峰，用免疫組織化學對培養細胞進行染色， 發現5-HT陽性細胞數量隨細胞的增殖而增加。表明山羊和綿羊松果體細胞在體外均增殖旺盛，并能保持體內的分泌功能。

關鍵詞：松果體細胞培養；M9了；5-HT免疫組化

中圖分類號：S827

文獻標識碼：A

文章編號：1007—7847(2006)01—0087—04

松果體為哺乳動物的重要神經內分泌器官，產生多種胺類和肽類物質，其主要分泌物--褪黑素(MT)對許多器官的功能具有重要的調節作用。為了解松果體的生理價值，許多學者采用體外培養技術研究其細胞形態和分泌功能．體外構建松果體組織并植入動物體內成為目前研究的熱點，這些研究有助于深入了解松果體的活動特點，為進一步調節動物體內松果體細胞分泌的研究積累材料。

哺乳動物松果體細胞培養早在20世紀70年代國外就有報道，1977年Rowe首次觀察了體外培養大鼠松果體細胞的形態，1978年Budat成功檢測了培養的大鼠松果體細胞褪黑素合成和分泌功能。本實驗以山羊和綿羊作為研究對象，對其松果體進行體外培養，觀察在無其他因素干擾條件下山羊和綿羊松果體細胞的形態變化、增殖過程和功能狀態的異同，為研究松果體細胞分泌特點及改變動物繁殖現狀提供依據。

l 材料與方法

1.1 主要實驗試劑及儀器

DMEM培養液(GIBCO，美國)，M199培養液(sigma，美國)，犢牛血清(sigma，美國)，胰蛋白酶(sigma，美國)，雙抗(武漢亞法)，MTr(sigma，美國)，DMSO(國產分析純)，兔抗5-HT血清(武漢博士德)，SABC試劑盒(武漢博士德)，DAB顯色試劑盒(武漢博士德)，自動酶標儀(Tecan，澳大利亞)，C02培養箱(LAB—LINE，美國)，倒置顯微鏡(Nikon，日本)。

1．2 松果體細胞的體外培養

按伊斯蘭方法屠宰1歲齡健康萊蕪黑山羊6只、小尾寒羊5只，分別進行以下步驟：迅速開顱取出松果體，冷D-hank昌液沖洗；剪碎后，0．25％膠原酶消化30min，含血清培養液中和，反復吹打，離心；加完全培養液吹打混勻，按每mL 1xl0⁴的細胞密度分別接種于96孔培養板(分7組，每組6孔)和24孔板(分7組，每組3孔，每孔內置一蓋玻片)，放人37℃、5％C02培養箱內培養。另外，本

實驗中山羊采用DMEM培養液，綿羊采用M199培養液。

1．3 MTT法檢測細胞增殖

從培養第3d開始，隔日取96孔板內一組細胞，每孔加入MTY 15 μL，繼續培養4h后，每孔加入DMSO 30 gL，吹打至沉淀完全溶解后，在0D570。處測吸光度值并繪制曲線。

1．4 5－HT免疫組織化學方法24孔板每組從第3d開始隔日取出細胞爬片，PBS沖洗，冷95％乙醇固定10min；用正常羊血清在室溫下封閉30rain；加入兔抗5—HT血清(1：100)37℃孵育2h，然后4℃過夜，PBS沖洗3rainx3；加入生物素標記的IgG，37℃ 30min，PBS沖洗3minx3；SABC復合物37℃下作用30rain，PBS洗3 minx3；DAB鏡下顯色5～10Min；蘇木素復染，脫水，透明，封片觀察。

2 結果

2．1 松果體細胞的形態觀察

倒置顯微鏡觀察體外培養的山羊、綿羊松果體細胞形態相似，大多呈圓形或多角形，x400下觀察呈圓圈狀。培養過程中都可見到“8”形的細胞形態，可能為正處于細胞分裂期。培養后期，細胞體積略增大，折光性減弱，但形態變化不大。另外可見具有長突起的小膠質細胞(圖1、2)。

2．2 MTT檢測結果

從表1和圖3可以看出，體外培養的松果體細胞數量前7d增長緩慢，第9d開始分裂增殖速度加快，于第11d左右達到高峰，此后生長曲線開始緩慢下降。

2．3．5-HT免疫組化染色結果

不同培養時期都可見細胞爬片上布滿棕黃色的5-HT陽性細胞，培養后期細胞的陽性反應仍然明顯，松果體細胞多呈圓形或多角形，高倍鏡下細胞中陽性物質呈不均質分布，細胞輪廓無明顯界限，復染后核位于細胞中間，呈規則的圓形(圖4、5)。培養前期隨時間延長，陽性細胞數有增加現象；在11d細胞增殖達高峰后，陽性細胞數量變化不大。

3 討論

1)體外條件下培養山羊、綿羊的松果體細胞形態相似，初期呈小圓形、折光性強，后期細胞逐漸增大、折光性減弱，這與廖華對大鼠松果體細胞的報道基本一致。

2)MTT比色法是一種檢測細胞增殖情況的經典方法，酶標儀所測的OD值可反映出細胞的相對數量。從測量OD值得出的生長曲線可見，兩種羊雖在不同培養液中生長，但其增殖趨勢相同，松果體細胞在培養第9d開始增殖，11d左右達到高峰，隨后增長緩慢。證明松果體細胞在常規培養條件下，能保持其增殖能力，細胞數目明顯增加，而在成年動物體內，松果體細胞與神經元一樣，數目恒定且很難再生。對于一特定動物來說，隨著年齡的增長松果體細胞開始退化，同時也沒有新生的細胞出現，因此松果體這一器官將逐漸衰老而無法發揮其功能。本實驗發現體外松果體細胞表現出明顯的增殖現象，說明體外構建松果體組織用于解決細胞的更新問題渴望成為可能。

3)褪黑素是松果體細胞的主要分泌物，而它是由色氨酸在多種酶的作用下轉化而成，因此檢測轉化過程中的任一中間產物或酶都可反映細胞的功能狀態，本實驗采用目前常用的5—羥色胺免疫細胞化學染色，因為5-羥色胺作為MT的前體與MT的分泌有著密切的關系，可初步判斷松果體細胞的功能狀態。我們對培養不同時期的細胞爬片進行抗5—羥色胺免疫細胞化學染色，發現爬片上布滿陽性細胞，細胞中含有大量呈點狀的陽性顆粒，細胞多為圓形和不規則形，陽性細胞數量隨細胞總數的增加而增加。證明體外增殖的松果體細胞具有合成5－HT，分泌MT的能力。

4)本研究所選的實驗動物山羊、綿羊均為季節性繁殖動物，光周期是影響其生殖活動的主要環境因素。松果體分泌的褪黑素在光周期感受過程中處于調控的中心地位，褪黑素主要通過與下丘腦-垂體—性腺軸的相互作用達到動物生殖周期與環境光周期的同步變化。實驗證明體外構建的松果體組織具有旺盛的增殖和分泌能力，因此可以考慮給動物植入新的松果體，并人為控制細胞的分泌狀態，延長動物的繁殖季節，以達到增加繁殖率的目的。同樣其它季節性繁殖動物如藏羚羊等瀕臨滅絕物種也可采用該方法來提高種群數目。通過本課題的研究，我們可以為人工繁殖稀有動物提供一個新的思路。