念珠藻生長(zhǎng)特性研究

摘 要：研究了念珠藻的生長(zhǎng)周期、固氮特性、生長(zhǎng)條件等生長(zhǎng)特性。得出本實(shí)驗(yàn)?zāi)钪樵蹇梢怨痰?；磷能有效制約其生長(zhǎng)；需要長(zhǎng)時(shí)間的光照等結(jié)果。

關(guān)鍵詞：念珠藻；生長(zhǎng)特性；異形胞

中圖分類號(hào)：Q949．2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847(2006)01-0055-06

念珠藻是淡水中常見的一類絲狀固氮藍(lán)藻，它廣泛分布于全球7大洲，從陸地到淡水生態(tài)系統(tǒng)，從熱帶土壤到極地冰原，即使在極度干旱和高紫外線照射的地區(qū)，念珠藻的一些種類，如Nostoc flagelliforme(發(fā)狀念珠藻，俗稱發(fā)菜)也有分布。念珠藻隸屬于藍(lán)藻門藍(lán)藻綱段殖體目念珠藻科。念珠藻的一些種在民間被作為野生蔬菜食用。已有數(shù)千年的歷史。念珠藻含有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，據(jù)分析，念珠藻體內(nèi)含有豐富的果膠、葉綠素a、葉黃素、胡蘿卜素及藻膽素和藻藍(lán)蛋白(phycoyamin)。其中普通念珠藻(Nostoccommune)氨基酸的組成不亞于動(dòng)物蛋白，鐵的含量每100g高達(dá)5746．39mg，對(duì)貧血患者是很好的補(bǔ)鐵食物，鈣含量占干重的2，91％，是一種具有潛在開發(fā)價(jià)值的補(bǔ)鈣食品源之一。念珠藻類還具有很大的醫(yī)療和保健作用，在《本草綱目》《本草綱目拾遺》中有關(guān)于普通念珠藻的藥用價(jià)值的記載。近些年人們從念珠藻的甲醇提取物中，分離到了一種有抗真菌活性的氨基酸衍生物一環(huán)肽Nostofungicidine，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)中包含新奇的β氨基酸殘基和3—氨基-6-羥基-硬脂酸殘基。在微藻產(chǎn)業(yè)方興未艾的今天，念珠藻的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其應(yīng)用潛力再度引起研究者們的濃厚興趣，念珠藻的食用、藥用及工業(yè)價(jià)值顯示出良好的產(chǎn)業(yè)前景。然而隨著工業(yè)化進(jìn)程的進(jìn)一步深化，水體富營(yíng)養(yǎng)化程度也隨之增加，目前已有一些關(guān)于飲用水中藍(lán)藻產(chǎn)生危害人類身體健康的報(bào)道，念珠藻也位列其中。但是目前很少見到關(guān)于念珠藻生長(zhǎng)特性的報(bào)道，缺少對(duì)念珠藻進(jìn)行深入研究的資料，鑒于此，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)從水源水中分離的念珠藻進(jìn)行了一系列生長(zhǎng)特性的研究，以便于對(duì)其營(yíng)養(yǎng)和安全作進(jìn)一步的研究和評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1．1 供試藻種

河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院普通微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室念珠藻(Nostoc，sp)的純化藻種。

1．2 供試培養(yǎng)基

1)HGZ培養(yǎng)基：為本實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基．配置方法如下(單位mg／L)：NAN03(1-500)，K2HP04(39)，MgS04·H20(75)，NaC03(20)，CaCl2(27)，Na2Si03·9H20(58)，EDTA(1)，檸檬酸(6)，檸檬酸鐵(6)，A5(1)。

2)固體培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上按1．5％加入瓊脂；

3)無(wú)氮培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上去除氮源NAN03；

4)無(wú)磷培養(yǎng)墓：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上去除磷源K2HP03；

5)貧營(yíng)養(yǎng)固體培養(yǎng)基：將2)的濃度降低一半，

1．3 培養(yǎng)條件

溫度(28±1)℃，光照強(qiáng)度1 5001x左右，于光照培養(yǎng)箱內(nèi)24h持續(xù)光照培養(yǎng)，

1，4 實(shí)驗(yàn)方法

1．4．1 藻體生長(zhǎng)狀態(tài)觀察

在無(wú)菌環(huán)境下300 mL的三角瓶中裝入150mLHGZ基礎(chǔ)培養(yǎng)基，取新鮮綠色的藻懸液按l％量接種，置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度(281)℃，光照強(qiáng)度15001x左右，24h持續(xù)光照。每隔3d在顯微鏡下觀察藻培養(yǎng)液一次，記錄其生長(zhǎng)特征。

1．4．2 生長(zhǎng)曲線的繪制

在上述培養(yǎng)狀態(tài)下每天將藻培養(yǎng)液在4 500r／min下端，20rain，去上清，稱取藻體濕重，以生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，藻體濕重為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1．4．3 考察念珠藻對(duì)氮磷的利用

通過(guò)在5)貧營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中將念珠藻培養(yǎng)，以造成念珠藻的饑餓生長(zhǎng)狀態(tài)，收獲，制成藻懸液，將藻懸液按1％量分別接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基、無(wú)氮、無(wú)磷3種培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基裝量為每50mL三角瓶裝液20mL。光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從三角瓶中出現(xiàn)足夠明顯的藻團(tuán)開始每隔一天觀察并離心稱濕重，直至藻體出現(xiàn)大量明顯的死亡，通過(guò)對(duì)比觀察，考察念珠藻對(duì)氮磷的吸收。

1．4．4 考察培養(yǎng)基不同狀態(tài)對(duì)念珠藻生長(zhǎng)的影響

1，4．4，1 藻懸液的制備

取新鮮的念珠藻，離心，去上清，稱重，加入適量蒸餾水配成一定濃度的藻懸液。

1．4．4．2 接種

1)藻種接種于固體培養(yǎng)基上

超凈工作臺(tái)里在瓊脂未凝固時(shí)用量筒準(zhǔn)確量取20mL培養(yǎng)基，倒平板，待平板凝固后用微量取樣器取0.2mL藻懸液接種于固體平板上，用三角刮涂布，光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

2)藻種接種于液體培養(yǎng)基中

50mL三角瓶裝液體培養(yǎng)基20mL，用微量取樣器取念珠藻懸液0．2mL接種，光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1．4．4，3 念珠藻的稱取

1)液體培養(yǎng)念珠藻的稱取

4500r／min離心15min，去上清，稱取藻體濕重。

2)固體培養(yǎng)念珠藻的稱取

用接種環(huán)輕輕刮取固體培養(yǎng)基的藻體，再用無(wú)菌水沖洗培養(yǎng)基表面，將藻體全部移入離心管中，4500r／rain離心15 min，去上清，稱取藻體濕重。

1，4，4．4 比生長(zhǎng)速率的計(jì)算

比增長(zhǎng)率(μ)計(jì)算公式為：

μ=In(x2／X1)／t2-t₁

式中，x₁為某一時(shí)間間隔開始時(shí)的藻類濕重(g)；x₂為某一時(shí)間間隔終結(jié)時(shí)的藻體濕重(g)；t₂-t₁為某一時(shí)間間隔(d)。

1．4，5 考察不同光照時(shí)間對(duì)念珠藻的生長(zhǎng)的影響

用黑紙對(duì)三角瓶進(jìn)行包裹達(dá)到無(wú)光效果，定時(shí)進(jìn)行包裹和拆開來(lái)控制光照時(shí)間。

控制每天受光時(shí)間分別為8、16、24h，28℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14、14d內(nèi)按時(shí)取樣制片，顯微鏡下觀察并記錄14d內(nèi)藻的生長(zhǎng)情況，考察光照時(shí)間對(duì)藻生長(zhǎng)的影響。

2 結(jié)果與討論

2．1 藻體生長(zhǎng)觀察

以下是念珠藻生長(zhǎng)狀況的觀察結(jié)果，根據(jù)表I，以藻鏈的長(zhǎng)度為指征，可以看出第l～3d為藻生長(zhǎng)的遲滯期，少量的斷鏈、死鏈以及厚壁孢子為種子所帶進(jìn)的，或在適應(yīng)過(guò)程中所產(chǎn)生的。當(dāng)生長(zhǎng)進(jìn)入第3～9d的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后斷鏈、死鏈以及厚壁孢子迅速減少，以長(zhǎng)鏈為主。從第9d開始，長(zhǎng)鏈減少，斷鏈增加直至第12d出現(xiàn)死亡，這一階段為穩(wěn)定期；之后進(jìn)入死亡期，斷鏈、死鏈增加而長(zhǎng)鏈減少。

由表I也可以發(fā)現(xiàn)異形胞與鏈的斷裂有關(guān)，可能會(huì)起一個(gè)斷點(diǎn)的作用，即鏈由異形胞處斷裂，當(dāng)鏈斷裂后，異形胞自動(dòng)脫落。

2．2 生長(zhǎng)曲線的繪制

在生長(zhǎng)進(jìn)入的3d時(shí)出現(xiàn)肉眼可見的藻團(tuán)，即開始離心測(cè)定，至20d時(shí)藻體顏色完全變?yōu)辄S色，并藻體呈膠狀，顯微觀察基本看不到生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，遂停止測(cè)定。得出如下生長(zhǎng)曲線：

念珠藻的生長(zhǎng)曲線并不典型，從圖5看出第13d進(jìn)入穩(wěn)定期，第15d進(jìn)入死亡期，與觀察的結(jié)果并不相符，可能是由于念珠藻在生長(zhǎng)的后期會(huì)產(chǎn)生大量的儲(chǔ)藏物如多糖，從圖5可以看出第11-13 d濕重迅速增加，而這一時(shí)期正是顯微鏡觀察到的穩(wěn)定期，大量藻體死亡的同時(shí)產(chǎn)生儲(chǔ)藏物。這一過(guò)程在離心稱重時(shí)也有所反映，三角瓶底部有大量透明膠狀物附著。隨著時(shí)間的推移營(yíng)養(yǎng)物耗盡藻細(xì)胞大量自溶，儲(chǔ)藏物不再產(chǎn)生甚至被消耗，濕重下降。

2．3 氮磷對(duì)念珠藻生長(zhǎng)的影響

以下為念珠藻分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基、無(wú)氮培養(yǎng)基、無(wú)磷培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。

由圖6可見：無(wú)氮源培養(yǎng)基中，念珠藻生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，生長(zhǎng)滯后于HGZ培養(yǎng)基，在第17d時(shí)，藻體顏色仍為深綠色，而正常濃度的培養(yǎng)基中第9d藻體顏色已呈黃色。無(wú)氮培養(yǎng)基中念珠藻異形胞始終都很明顯，正常濃度HGZ培養(yǎng)基中的念珠進(jìn)入穩(wěn)定期的一小段時(shí)期內(nèi)出現(xiàn)。因此推測(cè)，念珠鏈中的異形胞和念珠藻的生物固氮特性關(guān)系緊密。

磷對(duì)念珠藻的生長(zhǎng)影響較大，在無(wú)磷培養(yǎng)基中的念珠藻幾乎沒(méi)有長(zhǎng)，但可以形成厚壁孢子，把厚壁孢子轉(zhuǎn)接入HGZ培養(yǎng)基后，仍可正常生長(zhǎng)。

2．4 不同培養(yǎng)基狀態(tài)對(duì)念珠藻生長(zhǎng)的影響

在第5d固體平板出現(xiàn)一定量的藻群落開始離心測(cè)定，到第10d固體平板局部發(fā)干，部分藻體貼到壁上影響測(cè)定而停止離心測(cè)定。計(jì)算念珠藻生長(zhǎng)的比生長(zhǎng)速率。以生長(zhǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)， 比生長(zhǎng)速率為縱坐標(biāo)繪制比生長(zhǎng)曲線，兩種生長(zhǎng)狀態(tài)下的念珠藻比生長(zhǎng)速率曲線如下圖7(其中左圖為固體培養(yǎng)念珠藻，右圖為液體培養(yǎng)念珠藻)：

從圖7可看出，固體培養(yǎng)的念珠藻在前5d要慢于液體培養(yǎng)，根據(jù)測(cè)定與觀察發(fā)現(xiàn)，固體培養(yǎng)念珠藻第7—9 d時(shí)進(jìn)入旺盛生長(zhǎng)，表現(xiàn)為，藻體布滿培養(yǎng)基表面，藻體表面由于生長(zhǎng)旺盛出現(xiàn)大量氣泡。液體培養(yǎng)念珠藻在第6—7d生長(zhǎng)達(dá)到頂峰，藻體深綠液面有大量氣泡，到第12d時(shí)已出現(xiàn)大量發(fā)黃的藻體。顯微觀察有大量藻體死亡。通過(guò)圖7，可見固體培養(yǎng)的念珠藻仍有繼續(xù)生長(zhǎng)的趨勢(shì)，在第9d時(shí)固體培養(yǎng)的念珠藻生物量已高于液體培養(yǎng)念珠藻的最大生物量．推測(cè)在前期，固體培養(yǎng)基內(nèi)從液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接來(lái)的念珠藻并不適應(yīng)固體培養(yǎng)，也不能像液體培養(yǎng)基中的念珠藻一樣充分獲得氮元素，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的適應(yīng)后，藻體一方面適應(yīng)了固體環(huán)境，另一方面固氮機(jī)制啟動(dòng)，藻體既從培養(yǎng)基中獲取氮源，又通過(guò)自身固氮得到了氮源，所以生長(zhǎng)并不比液體培養(yǎng)狀態(tài)的差，甚至比液體培養(yǎng)的狀態(tài)還要好。同時(shí)也說(shuō)明，其他營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)念珠藻的生長(zhǎng)影響不大。

固體培養(yǎng)念珠藻在不同時(shí)期細(xì)胞大小也有所不同，表2是選取的幾個(gè)有代表意義的時(shí)期細(xì)胞大小。

根據(jù)表2，液體培養(yǎng)念珠藻細(xì)胞變化不大，只是在生長(zhǎng)末期出現(xiàn)細(xì)胞拉長(zhǎng)的現(xiàn)象，是細(xì)胞死亡的表象。固體培養(yǎng)念珠藻變化較為豐富，在生長(zhǎng)期時(shí)細(xì)胞與液體培養(yǎng)基中細(xì)胞大小相似；在生長(zhǎng)旺盛時(shí)細(xì)胞變大，以充分吸收外部的營(yíng)養(yǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)極佳；而到了第18d時(shí)，培養(yǎng)基干涸，為了適應(yīng)缺水的環(huán)境，念珠藻不得不通過(guò)減小細(xì)胞表面積來(lái)減少水分的散失，而此時(shí)觀察到的念珠藻仍然為綠色，有順直的鏈，但鏈并不長(zhǎng)。

可見，念珠藻適應(yīng)能力很強(qiáng)，藻既適應(yīng)固體培養(yǎng)狀態(tài)又適應(yīng)液體培養(yǎng)狀態(tài)，若要盡早收獲藻體可選用液體培養(yǎng)，若要大量收獲則選用固體培養(yǎng)。

2．5 不同光照時(shí)間對(duì)念珠藻生長(zhǎng)的影響結(jié)果

由表3、圖9、10可見：光照對(duì)念珠藻的生長(zhǎng)影響很明顯，每天光照8h的藻基本未見生長(zhǎng)，每天光照16h的藻鏈彎曲，生物量極少，每天光照24h的藻生長(zhǎng)良好，藻鏈長(zhǎng)且順直，異形胞少，一鏈一個(gè)或沒(méi)有，生物量大。可以認(rèn)為在此條件下24 h／d的光照時(shí)間最適宜念珠藻生長(zhǎng)。此結(jié)果不同于自然界中的情況，可能是該藻種經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期馴化的結(jié)果。

3 討論

就本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看念珠藻在300mL三角瓶150mL培養(yǎng)基裝量培養(yǎng)狀態(tài)下，念珠藻的遲滯期為第1～3 d。第3—9d為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，從第9d至第12d為穩(wěn)定期，之后進(jìn)入死亡期。

念珠藻有固氮特性，無(wú)氮培養(yǎng)停滯期較長(zhǎng)，異形胞可能對(duì)固氮特性有作用。

磷元素限制念珠藻生長(zhǎng)，可通過(guò)控制水體中磷的排放減少念珠藻的生長(zhǎng)。

念珠藻既適應(yīng)固體培養(yǎng)狀態(tài)又適應(yīng)液體培養(yǎng)狀態(tài)，若要盡早收獲藻體可選用液體培養(yǎng)，若要大量收獲則選用固體培養(yǎng)。

光照是影響念珠生長(zhǎng)的決定因素，長(zhǎng)時(shí)間足量光照有利于其生長(zhǎng)。

另外，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)當(dāng)念珠藻突然遇到惡劣環(huán)境時(shí)(如培養(yǎng)溫度大幅上升，饑餓等)異形胞數(shù)量顯著增加，可以認(rèn)為異形胞是應(yīng)對(duì)不良環(huán)境所產(chǎn)生的。