甲醛致大鼠鼻腔癌與Ｋ－ｒａｓ癌基因活化相關(guān)

摘 要：為探討甲醛致大鼠鼻腔癌的分子機(jī)制，對(duì)甲醛誘發(fā)的大鼠鼻腔癌細(xì)胞系FAT7中的轉(zhuǎn)化序列進(jìn)行檢測(cè)。采用的實(shí)驗(yàn)方法，包括腫瘤細(xì)胞DNA與選擇標(biāo)志基因(neo)共轉(zhuǎn)染、裸鼠成瘤性分析、Southern雜交、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和序列分析等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在第二輪裸鼠腫瘤DNA中含有大鼠源性的K-ras基因序列，而無(wú)大鼠源性的H-ras、N-ras和p53基因序列。這表明甲醛誘發(fā)的大鼠鼻腔癌細(xì)胞系FAT7中所含的轉(zhuǎn)化序列與H-ras、N-ras及p53基因無(wú)關(guān)，K-ras癌基因的活化可能參與甲醛致大鼠鼻腔癌。

關(guān)鍵詞：甲醛；大鼠：鼻腔癌；K-ras：癌基因

中圖分類號(hào)：R730

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007—7847(2006)01—0071—06

甲醛是一種工業(yè)用途十分廣泛的化學(xué)物質(zhì)，在人們?nèi)粘Ｉ瞽h(huán)境中也大量存在。對(duì)甲醛的致癌性進(jìn)行流行病學(xué)、毒理學(xué)、病理學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)甲醛可引起染色體異常、基因缺失、基因突變、細(xì)胞轉(zhuǎn)化，長(zhǎng)期慢性吸人甲醛可誘發(fā)動(dòng)物腫瘤等，但甲醛致癌的具體機(jī)制迄今仍不清楚，因此甲醛被列為潛在致癌物。為了探討甲醛致癌的分子機(jī)制。本文采用DNA共轉(zhuǎn)染與裸鼠成瘤性分析相結(jié)合的方法，對(duì)來(lái)自甲醛誘發(fā)的大鼠鼻腔癌細(xì)胞系FAT7中的轉(zhuǎn)化序列進(jìn)行了檢測(cè)和初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、質(zhì)粒及裸鼠

甲醛誘發(fā)的大鼠鼻腔癌細(xì)胞系FAT7由陳主初教授在美國(guó)化學(xué)工業(yè)毒理學(xué)研究所(Clit)建立并帶回，小鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3(CRL—1659)購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物中心(ATCC)，人膀胱癌細(xì)胞系T24及質(zhì)粒pkjl·neo由本所保存。裸小鼠(BALB／Cnu／nu)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑

胎牛血清，培養(yǎng)基DMEM、RPMll640均系美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品；分子生物學(xué)試劑，如隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒、PCR試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶、低熔點(diǎn)瓊脂糖等購(gòu)自美國(guó)promega公司；DNA回收試劑盒為上海生工公司產(chǎn)品；轉(zhuǎn)染試劑Fu-GEN^TM6和G418購(gòu)自美國(guó)Roche公司；同位素a-³²P-dCTP(3000ci／mm01)購(gòu)自北京亞輝公司。其它常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1．3 方法

1．3，1 DNA的提取和Southern雜交

質(zhì)粒／真核細(xì)胞DNA的提取、酶切、電泳以及Southem雜交均參照文獻(xiàn)的方法，探針回收和標(biāo)記則按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1．3，2 DNA共轉(zhuǎn)染、G418篩選與棵鼠成瘤性分析

轉(zhuǎn)染前24h，接種約5x10⁵NIH3T3細(xì)胞于100mm平皿中培養(yǎng)過(guò)夜．轉(zhuǎn)染時(shí)，先取3個(gè)含有770 1xL無(wú)血清DMEM的聚丙烯酰胺試管，分別于每管中加入30μL脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，并輕輕混勻；同時(shí)于另外3個(gè)含有800 μL無(wú)血清DMEM的聚丙烯酰胺試管中分別加入FAT7、NIH3T3、T24細(xì)胞基因組DNA各30 ixg和pkj1-neo質(zhì)粒DNA各300ng，同樣輕輕混勻。再將加入了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的試管分別與加入不同細(xì)胞DNA試管中的液體混合，室溫下靜置15min。然后，用無(wú)血清DMEM給待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞換液，并將上述混合液加入到含有4mL無(wú)血清DMEM的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕混勻后置37℃ C0₂培養(yǎng)箱孵育，6h后，補(bǔ)加5，6mL含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)過(guò)夜。

轉(zhuǎn)染72h后，用胰酶消化轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并按1：5傳代培養(yǎng)，同時(shí)在培養(yǎng)基中加入G418(終濃度為400mg／L)進(jìn)行篩選，以后每隔2d換一次篩選培養(yǎng)基(含G418，300mg／L)。約8～10d左右，轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)抗性克隆，而未轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞，篩選10d后全部死亡。繼續(xù)篩選1～2周后，每個(gè)平皿中約有300個(gè)抗性克隆，此時(shí)再用胰酶消化細(xì)胞，并將每組細(xì)胞集中(每組抗性克隆數(shù)≥1000)，細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于4周齡裸小鼠(BALB／cnu／nu)右腋窩皮下，(每只0．5 mL，10⁷個(gè)細(xì)胞)，當(dāng)腫塊超過(guò)1 cm×1cm后，處死荷瘤裸鼠，切下腫塊供進(jìn)一步分析.

1．3．3 PCR擴(kuò)增及序列分析

本研究使用的引物名稱、序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。其中，引物3B5U／3B5L針對(duì)大鼠特異性高度重復(fù)序列3B5，參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，用于Southern雜交的探針標(biāo)記；N-rasE2U／N-rasE2L用于檢測(cè)大鼠N－ras基因外顯子2，參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)：引物H－raselU／H-rasElL和K-rasElU／K-rasElL，分別用于大鼠H-ras和K-ras基因外顯子1的檢測(cè)，系根據(jù)GenBank中相應(yīng)序列用Primer3．0軟件自行設(shè)計(jì)，以上引物均由上海生工技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物p53E5U／p53E5L針對(duì)大鼠p53基因外顯子5，參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，用于大鼠p53基因的檢測(cè)，由本室保存。

PCR反應(yīng)體系均為50μL，其中DNA模板ljxL，10X PCR反應(yīng)緩沖液5 μL，200 mmol／LdNTPs 1μL，401xmol／L上、下游引物混合液0，5μL。Taa酶5U．PCR反應(yīng)條件，對(duì)于3B5探針標(biāo)記和Ha-ras基因檢測(cè)來(lái)說(shuō)，均為：預(yù)變性95℃5min，變性94％50s，退火55℃ 30s，延伸72℃lmin，循環(huán)30次，72℃延伸7min。而對(duì)于N-ras、p53和K-ras基因的PCR，雖然變性和延伸的條件與上述相同，但退火的條件則各有不同，N-fas為45℃ 30s，p53為57℃ 30s，而K-ras則為58℃ 30s。

PCR反應(yīng)完畢后，取5μL產(chǎn)物于1．5％的瓊脂糖凝膠中電泳，EB染色照相。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由上海申友生物技術(shù)有限公司純化并測(cè)序，測(cè)得的序列經(jīng)Intemet用BLASTn軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列同源性比較分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．1 細(xì)胞DNA共轉(zhuǎn)染及裸鼠成瘤性分析

取甲醛誘發(fā)的大鼠鼻腔癌細(xì)胞系FAT7的基因組DNA為供體，并以人膀胱癌細(xì)胞系T24(含有活化的人，H-ras基因)和小鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3(轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞)的基因組DNA分別作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，與含選擇標(biāo)志基因(Neo)的質(zhì)粒plj1—neo共轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，經(jīng)G418篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得的G418抗性細(xì)胞克隆(≥1000)分別接種裸鼠，進(jìn)行裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2．如表2所示，實(shí)驗(yàn)組(FAT7細(xì)胞DNA與Neo共轉(zhuǎn)染)8只裸鼠中有3只接種部位出現(xiàn)腫塊，出現(xiàn)時(shí)間為接種裸鼠后1個(gè)月左右，生長(zhǎng)速度較慢，腫塊長(zhǎng)成I cmxl cm需2周左右，病理切片可見(jiàn)為低分化纖維肉瘤(結(jié)果未示出)；陽(yáng)性對(duì)照組(T24細(xì)胞DNA與Neo共轉(zhuǎn)染)4只裸鼠全部長(zhǎng)瘤且出現(xiàn)較早(不到14d)，生長(zhǎng)迅速，僅需3～4 d即可長(zhǎng)至1cm×1cm；陰性對(duì)照組(NIH3T3細(xì)胞DNA與Neo共轉(zhuǎn)染)所有接種裸鼠則不長(zhǎng)瘤。將實(shí)驗(yàn)組獲得的裸鼠腫瘤，按照成瘤時(shí)間的先后順序命名為FAT7—1，F(xiàn)AT7-2，F(xiàn)AT7-3．隨后從裸鼠腫瘤組織中提取基因組DNA，并與大鼠特異性高度重復(fù)序列3B5探針進(jìn)行Southern雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組3個(gè)裸鼠腫瘤DNA中均含有大鼠源性序列，其中FAT7-1和FAT7—3的雜交信號(hào)較強(qiáng)(圖1)。

2．2 腫瘤DNA共轉(zhuǎn)染及裸鼠成瘤性分析

選擇與3B5探針雜交信號(hào)較強(qiáng)的FAT7—l和FAT7-3裸鼠腫瘤DNA作為供體，同樣以人膀胱癌細(xì)胞系T24和小鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3的基因組DNA分別作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，依前述方法進(jìn)行第二輪DNA共轉(zhuǎn)染和裸鼠成瘤性分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)第二輪DNA共轉(zhuǎn)染和裸鼠成瘤性分析，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組(FAT7—1和FAT7／-3腫瘤DNA與Neo共轉(zhuǎn)染)所接種的6只裸鼠全部在接種部位出現(xiàn)腫塊，但腫瘤出現(xiàn)的時(shí)間仍在接種裸鼠后1個(gè)月左右，生長(zhǎng)速度較慢，腫塊長(zhǎng)成1cm×1cm需兩周左右，由病理切片可見(jiàn)也是低分化纖維肉瘤(結(jié)果未示出)。這提示第二輪DNA共轉(zhuǎn)染和接種裸鼠后形成的腫瘤中相關(guān)轉(zhuǎn)化序列可能已富集，但其轉(zhuǎn)化活性仍偏弱，隨后，用3B5探針與第二輪所獲裸鼠腫瘤DNA進(jìn)行Southern雜交，結(jié)果表明：第二輪裸鼠腫瘤DNA中確實(shí)含有大鼠源性的3B5序列，且含有3B5序列的腫瘤DNA片段明顯集中，說(shuō)明轉(zhuǎn)化序列已相對(duì)富集(圖2)，可進(jìn)行相關(guān)轉(zhuǎn)化基因的克隆及鑒定。

2．3 裸鼠腫瘤DNA中轉(zhuǎn)化相關(guān)序列的初步鑒定

為了鑒定．與甲醛誘發(fā)大鼠鼻腔癌相關(guān)的轉(zhuǎn)化序列，以在化學(xué)誘癌過(guò)程中突變頻率較高的ras癌基因家族(包括H-fas、N-ras、K-ras)為靶基因，對(duì)第二輪裸鼠腫瘤DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增+結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第二輪裸鼠腫瘤DNA中無(wú)大鼠源性的H-fas和N-ras基因序列(圖3、4)；而由于大、小鼠K-fas基因外顯子1序列高度同源的緣故，在第二輪裸鼠腫瘤DNA和作為PCR陰性對(duì)照的NIH3T3未轉(zhuǎn)染細(xì)胞DNA及作為PCR陽(yáng)性對(duì)照的FAT7／細(xì)胞DNA中，均擴(kuò)增出了大小一致的PCR產(chǎn)物帶(圖5)。為了進(jìn)一步確定第二輪裸鼠腫瘤DNA中K-ras基因序列是否為大鼠來(lái)源，將上述針對(duì)K-ms基因外顯子1的PCR產(chǎn)物，回收后直接測(cè)序，并將測(cè)得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BALST分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第二輪裸鼠腫瘤DNA中確實(shí)含有大鼠源性的K-ras基因外顯子1序列，但該段序列除在第3位密碼子有一個(gè)同義突變(GAA—GAG)外，并無(wú)其他有意義的突變(圖6)。

3 討論

腫瘤DNA與選擇標(biāo)記基因共轉(zhuǎn)染及裸鼠成瘤性分析方法，是表型克隆的一種，其基本技術(shù)路線是將外源DNA導(dǎo)入正常受體細(xì)胞并使之發(fā)生轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生惡性表型，再?gòu)霓D(zhuǎn)染細(xì)胞中篩選、克隆出起轉(zhuǎn)化作用的DNA序列。迄今已知的大多數(shù)轉(zhuǎn)化基因(癌基因)都是用這種方法克隆得到的。本研究以甲醛誘發(fā)的大鼠鼻腔癌細(xì)胞系FAT7作為DNA供體，用該方法檢測(cè)與甲醛致大鼠鼻腔癌相關(guān)的轉(zhuǎn)化序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)；在第一輪接種的實(shí)驗(yàn)組裸鼠中，8只裸鼠僅有3只長(zhǎng)出腫瘤；而第二輪接種的實(shí)驗(yàn)組裸鼠中，6只裸鼠全部長(zhǎng)出腫瘤，提示經(jīng)第一輪篩選后，轉(zhuǎn)化相關(guān)序列已經(jīng)相對(duì)富集．我們用大鼠特異性高度重復(fù)序列3B$作為探針檢測(cè)第一、二輪裸鼠腫瘤DNA，也證實(shí)經(jīng)過(guò)兩輪的DNA共轉(zhuǎn)染和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)篩選，裸鼠腫瘤DNA中大鼠源性序列確已高度富集，可進(jìn)行轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的鑒定及分析。

遺傳毒理學(xué)研究表明：甲醛對(duì)核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的氨基(NH2)具有活潑的反應(yīng)性，可與之共價(jià)結(jié)合，形成不穩(wěn)定的甲基化加合物，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的DNA-DNA、蛋白質(zhì)－DNA甲叉交聯(lián)，后者是一種不可逆的遺傳學(xué)改變。一般認(rèn)為，化學(xué)致癌的起始事件是DNA特異部位加合物的形成，如在細(xì)胞分裂前DNA損傷未得到及時(shí)修復(fù)，則發(fā)展為基因突變，從而導(dǎo)致癌基因活化和／或抑癌基因失活。由于甲醛能與DNA等生物大分子形成加合物，造成不可逆的、穩(wěn)定的遺傳學(xué)損害，說(shuō)明在甲醛致大鼠鼻腔癌的過(guò)程中可能涉及到某些轉(zhuǎn)化基因的突變。鑒于在化學(xué)致癌的研究中，ira3癌基因家族(H-ras、N-ras、K-ras)的突變頻率較高，而且DNA共轉(zhuǎn)染及裸鼠成瘤性方法對(duì)檢測(cè)活化的raS癌基因極為敏感，因此首先分析了轉(zhuǎn)化序列與ras癌基因家族的關(guān)系。另外，由于曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)甲醛所致大鼠鼻腔癌及其相應(yīng)細(xì)胞系FAT7中p53基因外顯子5第271密碼子有CGT→CAT(Cys--4His)的突變，對(duì)轉(zhuǎn)化序列是否與p53基因相關(guān)也同時(shí)進(jìn)行了研究(結(jié)果未示出)，通過(guò)PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)在第二輪裸鼠腫瘤DNA中只含有K-ras癌基因的相應(yīng)產(chǎn)物，而無(wú)H-ras、N-fas和p53基因相應(yīng)的產(chǎn)物。但由于PCR引物位于K-ras基因外顯子1(序列較為保守)的緣故，在第二輪裸鼠腫瘤DNA和作為PCR陰性對(duì)照的NIH3T3未轉(zhuǎn)染細(xì)胞DNA及作為PCR陽(yáng)性對(duì)照的FAT7細(xì)胞DNA中，均擴(kuò)增出了大小一致的PCR產(chǎn)物，因此對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序。序列分析的結(jié)果顯示：第二輪裸鼠腫瘤DNA中的確含有大鼠K-ras基因外顯子1序列，不過(guò)該段序列并未發(fā)現(xiàn)有意義的突變。這提示，我們檢測(cè)到的轉(zhuǎn)化相關(guān)序列可能與大鼠H-ras，N-ras及p53基因無(wú)關(guān)，而極有可能是大鼠K-ras癌基因，但鑒于裸鼠腫瘤DNA中K-ras基因外顯子1無(wú)任何有意義的突變，故在甲醛致大鼠鼻腔癌的過(guò)程中K-ras癌基因的作用及其活化機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。