番木瓜性別決定及其鑒定研究新進(jìn)展

摘 要：番木瓜有3種基本性別類型，性別遺傳較為復(fù)雜。就其植株的多型性表現(xiàn)、性別決定及其鑒定研究、連鎖遺傳圖的構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)和花器的發(fā)育等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并對番木瓜性別鑒定的應(yīng)用前景做了展望。

關(guān)鍵詞：番木瓜；性別鑒定；性別決定；研究進(jìn)展

中圖分類號：Q75

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007—7847(2006)01—0001—06

番木瓜(Crica papaya L．)是著名的熱帶果蔬兼用水果，其鮮果外觀美麗，色香味俱佳，素有“嶺南佳果”之美稱，在我國南方地區(qū)大面積種植。除了食用之外，番木瓜還具有極其重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，未成熟的木瓜乳汁中含有種類豐富的木瓜蛋白酶類物質(zhì)，它們在科研、食品加工、醫(yī)療、化妝品、美容等方面應(yīng)用十分廣泛。現(xiàn)代技術(shù)已經(jīng)證明番木瓜是集營養(yǎng)、防病、抗癌、保健、美容于一體的有百益而無一害的果之珍品。

番木瓜通常采用實(shí)生繁殖，因而在育苗過程中出現(xiàn)大量的“木瓜公”，即雄株，植株只有在6—8個(gè)月后開花時(shí)才能鑒別性別，在此之前并不能從形態(tài)上準(zhǔn)確判斷，通常情況下雄株個(gè)體約占3％～5％，必需在開花時(shí)拔掉，這種情況不僅對生產(chǎn)造成極大的浪費(fèi)，而且在有“木瓜公”的果園留種會(huì)使以后繁殖出的幼苗出現(xiàn)大量的“木瓜公”，危害甚大，因此研究番木瓜的性別決定及其鑒定意義重大。本文就此方面的新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1、番木瓜花性的多型性

番木瓜基本花型可分為雄花、雌花和兩性花3種，因此番木瓜的株型也就相應(yīng)分為雄株(male或staminate)、雌株(female或pistillate)和兩性株(hermaphrodite)三種基本類型，栽培品種主要分為兩性株及雌性株兩種類型，目前我國主栽的“穗中紅”品種即屬于兩性株．兩性株栽培廣泛，但它的實(shí)生后代性別經(jīng)常發(fā)生分離，分離比一般為兩性株：雌株2：1，植株只有在生長6-8個(gè)月后開花時(shí)才能判斷性別。

除了常見的3種基本花型外，番木瓜尚有其他花型，呈現(xiàn)出十分廣泛的多型性，并且也有“木瓜公”結(jié)果、兩性株上也有雄花的報(bào)道(即雌花、雄花、兩性花同時(shí)著生在一株植物上的雜性同株現(xiàn)象)，由此可見，番木瓜的花型表現(xiàn)及遺傳是非常復(fù)雜的。

在自然界，雌雄異株是普遍存在的，如高等植物中的銀杏、獼猴桃、蘆筍、羅漢果、紅豆杉等都是雌雄異株植物，大多數(shù)雌雄異株植物的性別決定并不像動(dòng)物那樣在胚胎時(shí)期就已決定，而是在生長、分化和發(fā)育成熟后的某個(gè)階段才能確定，同時(shí)還會(huì)不同程度地受外界環(huán)境條件如營養(yǎng)、溫度、濕度、光強(qiáng)、日照時(shí)間和植物激素等因素的影響，因此許多高等植物的性別分化具有不穩(wěn)定性，對于番木瓜而言，其花型、性別也會(huì)因季節(jié)、高溫、不恰當(dāng)?shù)男藜舳兓缧壑陼?huì)變成雌株或兩性株，即是受環(huán)境因素影響的結(jié)果。

不同性別的番木瓜植株，其結(jié)果性能、果實(shí)形態(tài)及品質(zhì)均存在較大的差異。由于雄株并不能結(jié)果，因此應(yīng)盡量設(shè)法避免“木瓜公”的出現(xiàn)。

2、番木瓜性別決定及其鑒定研究

2．1 形態(tài)鑒定

在苗期鑒定植株的性別，對番木瓜的育種及栽培均具有一定意義。在幼苗形態(tài)上，各種類型的株型幾乎沒有區(qū)別，只有開花時(shí)根據(jù)花器形態(tài)加以判斷。不同品種性別的番木瓜的結(jié)果習(xí)性、果實(shí)形態(tài)及品質(zhì)均存在較大的差異，因此采用形態(tài)學(xué)鑒定的方法在生產(chǎn)中的應(yīng)用十分有限，有人試圖用物理、化學(xué)及組織培養(yǎng)方法來預(yù)測植株的性別，但效果均不理想。

2．2 對于性別遺傳規(guī)律的研究

伴隨著遺傳學(xué)研究水平的提高，植物的性別研究開始成為關(guān)注的重點(diǎn)，同時(shí)植物的性別研究一直是世界植物研究上的薄弱環(huán)節(jié)，解讀植物性別遺傳信息也一直是研究人員夢寐以求的事情，對于番木瓜，盡管它是二倍體，只有9對染色體(2n=18)，基因組也很小，約372 Mbp，但直到目前，人們對它的遺傳學(xué)研究和認(rèn)識還十分膚淺。

對于番木瓜性別遺傳規(guī)律的認(rèn)識，早在60年前已有人提出它的性別是由3個(gè)等位基因控制的假說．根據(jù)3種株型雜交后代性別分離的比例，Storey等認(rèn)為3個(gè)等位基因分別是M₁、M₂及m，它們分別控制雄性、兩性及雌性性狀，其中M₁、M₂為顯性，m為隱性，雄株、兩性株及雌株的基因型分別為M₁m、M₂m及mm，而基因型為M₁M₁，M₁M₂及M₂M₂的合子均表現(xiàn)為敗育，并定位了性別決定基因。顯性組合導(dǎo)致顯性敗育，從而使兩性株的后代發(fā)生2：1的分離。后來Storey繼續(xù)修正了該假說，認(rèn)為性別決定并非單個(gè)基因作用的結(jié)果，而是受聚集在性染色體上十分狹窄范圍內(nèi)的一個(gè)基因復(fù)合體所控制，Hofmeyr進(jìn)一步報(bào)道了M₁和M₂是染色體上丟失了性別決定關(guān)鍵基因的有輕微長度差別的失活區(qū)，根據(jù)屬內(nèi)雜交結(jié)果，Horovitz和Jimenez指出番木瓜的性別決定是XX-XY型，雄性基因型為XY，雌性為XX，兩性為XY₂，Y₂是突變了的Y染色體。最近，Liu等認(rèn)為性染色體的演變包括了性別決定基因附近的染色體區(qū)域重組抑制，一個(gè)永久雜合的染色體區(qū)域或許積累有害的隱性突變并加以固定，通過在Y染色體上較近的有利突變選擇一段時(shí)間后，這些變化或許導(dǎo)致Y染色體的衰退和與X染色體的分離，在人類中已發(fā)現(xiàn)僅有5％的Y染色體還顯示有X-Y染色體的重新交換。因此認(rèn)為番木瓜包含一個(gè)原始的Y染色體，其上僅有的雄性特異區(qū)域(約占該染色體長度的10％)也經(jīng)歷了嚴(yán)格的重組抑制和DNA序列的改變，這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步為性染色體起源于常染色體提供了直接證據(jù)。

另外一個(gè)假說認(rèn)為3種等位基因分別編碼不同的反式作用因子從而指導(dǎo)不同的花型形成，將性別決定由基因水平發(fā)展到蛋白質(zhì)翻譯水平，

2.3 連鎖遺傳圖的構(gòu)建

高密度的連鎖遺傳圖不僅是分離克隆目標(biāo)基因的第一步，而且也是遺傳研究的重要工具，連鎖遺傳圖的構(gòu)建對克隆相關(guān)基因和分子標(biāo)記輔助選擇具有意義。目前很多作物的連鎖遺傳圖已構(gòu)建完成。

番木瓜連鎖遺傳圖的構(gòu)建遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他作物，第一張遺傳圖在60年前構(gòu)建，其中只包括性型、花色、莖色三個(gè)形態(tài)標(biāo)記。1996年Sondurt報(bào)道了第二張基于分子標(biāo)記的遺傳圖，在該遺傳連鎖圖譜中，共有62個(gè)RAPD標(biāo)記，性別決定基因定位于第一個(gè)連鎖群，其位點(diǎn)的兩邊各有一個(gè)標(biāo)記，遺傳距離為7cM，最近夏威夷大學(xué)的HaoL等根據(jù)Kapoho和SunUp的54株F2群體構(gòu)建了第三張高密度分子連鎖遺傳圖，該圖譜共有1 501個(gè)標(biāo)記，其中包括1498個(gè)AFLP標(biāo)記和番木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白標(biāo)記、性別的形態(tài)學(xué)標(biāo)記和鮮果顏色標(biāo)記等。這些標(biāo)記分為12個(gè)連鎖群，共覆蓋3 294．2cM的基因組，標(biāo)記間的平均距離為2．2cM。對這些標(biāo)記進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)在性別決定位點(diǎn)附近共有225個(gè)標(biāo)記與性別基因共分離．幾乎同時(shí)，Chadesworthf構(gòu)建了非常詳細(xì)的攜帶性別決定基因的染色體圖譜，從圖上看出番木瓜的性別決定基因位于該圖中一個(gè)非常集中的重組區(qū)域內(nèi)，與其他的雄性特異區(qū)(如哺乳動(dòng)物的Y染色體)相比，該區(qū)域仍然是番木瓜基因組的一小部分，其研究結(jié)果與Hao相吻合，進(jìn)一步證明性別決定基因及其附近的標(biāo)記是緊密連鎖的，

2．4 與性別連鎖的DNA分子標(biāo)記研究

分子標(biāo)記技術(shù)作為一種基本的遺傳分析手段，已在動(dòng)物、植物、人類遺傳作圖和基因分析等諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，分子標(biāo)記是以生物大分子，尤其是以生物體的遺傳物質(zhì)——核酸的多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記(geneticmarkers)，是鑒別基因組中基因位點(diǎn)(10CUS)的有效手段，分子標(biāo)記由于具有能夠穩(wěn)定遺傳，遺傳方式簡單，可以反映生物個(gè)體和群體特征的特點(diǎn)，因而它是目前發(fā)展最為迅速的一類遺傳標(biāo)記。

分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)是分子標(biāo)記技術(shù)在育種實(shí)踐中的具體應(yīng)用，已在許多作物的早期選擇上有成功的報(bào)道，這也激勵(lì)著研究人員開發(fā)早期剔除番木瓜雄株的分子標(biāo)記選擇技術(shù)。由于番木瓜性別的多型性和偶爾的性別轉(zhuǎn)換以及性染色體的突變?nèi)笔В势湫詣e的分子水平研究一直是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，現(xiàn)已在性別決定及其鑒定方面取得了一些進(jìn)展．夏威夷大學(xué)的Deputy等率先獲得了成功，他們獲得了與番木瓜性別緊密連鎖的3個(gè)RAPD標(biāo)記，經(jīng)測序，合成引物，轉(zhuǎn)換為SCAR標(biāo)記，并認(rèn)為SCARTl2和SCARWll在兩性株和雄株之間能夠產(chǎn)生特異的PCR產(chǎn)物，而在雌株卻極少出現(xiàn)；SCARTI在所有的株性間均有該P(yáng)CR產(chǎn)物產(chǎn)生，因此，利用這3對引物可以很好地區(qū)分3種番木瓜株型。基于此他們成功地開發(fā)了檢測番木瓜株型技術(shù)，即用T1作為正對照，用Wll或T12鑒定兩性株和雄株，在苗期進(jìn)行早期性別鑒定，預(yù)測番木瓜的性別，準(zhǔn)確率為99．2％，達(dá)到了早期選擇的目的，后來Parasnis、Lemos和Uraski也分別成功地開發(fā)了雄性(Male-specific)、兩性(hermaphrodite-specific)和將雌性與雄性、兩性區(qū)分的分子標(biāo)記技術(shù)及標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，并用于性別的早期選擇。Eliana等利用RAPD技術(shù)區(qū)分了商品栽培品種Solo的3個(gè)性別的后代，發(fā)現(xiàn)引物BC210產(chǎn)生的標(biāo)記BC210438可以檢測供試材料的兩性株類型。隨后，SomsriI等應(yīng)用DNA擴(kuò)增指紋技術(shù)對番木瓜的性別基因標(biāo)記也進(jìn)行了研究。

真核生物基因組中的小衛(wèi)星和微衛(wèi)星DNA具有豐富的多態(tài)性，由于它們在整個(gè)基因組上分布廣泛、均勻，具有保守性強(qiáng)、共顯性遺傳、能夠提供大量穩(wěn)定的遺傳信息以及分析方便快速等一系列優(yōu)點(diǎn)，因此已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物遺傳作圖、群體遺傳學(xué)研究等方面。印度的Parasnist3等最近利用微衛(wèi)星和小衛(wèi)星探針來鑒定番木瓜的性別，他們認(rèn)為有一個(gè)微衛(wèi)星探針(GATA)4在所研究的番木瓜品種中表現(xiàn)了性別的特異性，從而開發(fā)了苗期番木瓜性別鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記，同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)番木瓜的X、Y染色體的遺傳物質(zhì)完全不同的原因是由于性別分化過程的不同所導(dǎo)致的，從染色體水平上揭示了性別差異的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。

利用分子標(biāo)記研究番木瓜的性別，我國也有學(xué)者進(jìn)行了探索，陳中海采用同工酶技術(shù)、蛋白質(zhì)SDS-PAGE方法研究番木瓜雌株、雄株和兩性株3種株性之間的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雌株、雄株和兩性株在過氧化物酶(POD)、酯酶(EST)和多酚氧化酶(PPO)同工酶酶譜上存在差異，酶活性總的趨勢是雌株活性較強(qiáng)，雄株和兩性株較弱，并且與雌株和兩性株相比，在雄株葉柄中多一條afl。0．29的過氧化物酶同工酶帶，在成熟葉片中多一條Rf=0．75的酯酶同工酶特異帶，少一條Rf=0．35的多酚氧化酶譜帶，這提示該3種特異的譜帶可作為鑒別番木瓜株性的參考依據(jù)，周國輝”應(yīng)用混合分離群體分析法，在205個(gè)10堿基隨機(jī)引物中，尋找到了番木瓜兩性基因(M2)的RAPD標(biāo)記一OPQ071800和OPE061050，用這兩個(gè)引物檢測了210株番木瓜單株DNA，結(jié)果表明，OPQ071800和OPE061050與M2基因緊密連鎖，并且位于M2基因的兩側(cè)，其遺傳距離分別為4，5cM和1，9cM。該研究為M2基因的克隆、定向育種開辟了新道路，也使傳統(tǒng)的育種工作跨上新臺階。

2．5 其他方法的性別鑒定

除了分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)用于性別鑒定之外，還有人報(bào)道用一些生理生化的方法進(jìn)行早期性別鑒定，Awadt3]以三月齡的Fairchild品種葉片和葉柄為材料，通過分析其化學(xué)成分的差異，探討了番木瓜葉片的化學(xué)成分與性別表現(xiàn)之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雄株與雌株葉片的葉綠素可溶性固形物、總酸和總酚在含量上沒有顯著差異，但可以通過雌株葉片和葉柄中較高的干物質(zhì)、硅、吲哚及葉片氨基酸和游離脯氨酸含量，進(jìn)行雌性株的早期鑒定，雄株則可以通過葉片和葉柄的較高的灰分物質(zhì)含量，及葉柄中較高的過氧化物酶和游離脯氨酸含量來預(yù)測，還有許多不同的研究人員從不同的方面又發(fā)展了一些其他的方法對番木瓜的幼苗進(jìn)行了早期鑒別。

另外，栽培管理上的一些措施也可以影響番木瓜性別表現(xiàn)，Suranant用NAA和GA-3處理番木瓜的幼苗，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)濃度的NAA處理可以減少群體中雄株的百分率，GA-3處理雖然沒有改變雄雌株的比例，但雄性特征的出現(xiàn)早于其他兩種性型。因而，可通過適時(shí)噴灑化學(xué)藥劑NAA和GA—3，達(dá)到雄株的早期鑒別和降低雄株率的目的，Mitra也報(bào)道用100μg／gNAA處理幼苗可以提高雌株的百分率(由46％提高到62，5％)，支持了上述觀點(diǎn)，

3 花器的發(fā)育

為了弄清番木瓜獨(dú)特的花器發(fā)育過程，有研究者對番木瓜兩性株花器形成過程的形態(tài)變化進(jìn)行了觀察，我國臺灣的謝明憲等用解剖顯微鏡及掃描電子顯微鏡觀察了臺農(nóng)二號番木瓜兩性株各齡花芽的發(fā)育過程．根據(jù)形態(tài)，將兩性花的花器形成過程分為4個(gè)階段：萼片及花瓣原基相繼出現(xiàn)的花被原基形成期(第1～3節(jié))，雄蕊及心皮原基相繼開始形成的雌雄花器原基初形成期(第4-6節(jié))，花瓣與花絲明顯可見的雄蕊形成完成期(第7-9節(jié))，以及心皮完全愈合且形成分支狀柱頭的雌蕊形成完成期(第10～14節(jié))。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)番木瓜花器形成的進(jìn)程與其所著生的節(jié)數(shù)有穩(wěn)定的一致關(guān)系，提示生產(chǎn)上可利用節(jié)位標(biāo)定的方法來推測芽體的發(fā)育程度。還發(fā)現(xiàn)番木瓜花器形成的向頂分化模式和花器形成所需時(shí)間會(huì)依季節(jié)不同在4--10周之間變動(dòng)；而花器成熟所需時(shí)間則較為恒定，約為3～5周。在雄蕊形成期間不同階段發(fā)生的發(fā)育受阻現(xiàn)象，則會(huì)形成不同心皮數(shù)及柱頭數(shù)的雌蕊，同時(shí)，盧秉國以雌株、兩性株和雄株3種不同類型的番木瓜為材料，研究了不同類型的番木瓜的花粉育性，觀察了大孢子、雌配子體以及胚胎的發(fā)生及發(fā)育，研究了育性對植株結(jié)實(shí)性能的影響。所有這些研究都在一定程度上探索了番木瓜不同類型的花器及胚胎發(fā)育過程，使人們對該復(fù)雜的過程有了一定認(rèn)識。

4 展望

長期以來，番木瓜主要采用種子進(jìn)行實(shí)生苗繁殖育苗，但幼苗的雄株率一直維持在5％左右。由于缺乏有效的性別鑒定方法，只有等到開花時(shí)才能判斷，這極大地影響了番木瓜生產(chǎn)，如何在苗期快速準(zhǔn)確地判斷、剔除雄株一直是近年研究和努力解決的問題。形態(tài)學(xué)鑒定方法簡單易行，但耗時(shí)費(fèi)力；采用生理生化指標(biāo)鑒別，易受到環(huán)境條件、植株發(fā)育階段和操作人員技術(shù)水平等的影響而導(dǎo)致可靠性降低；快速準(zhǔn)確的分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)雖有一定應(yīng)用，但操作復(fù)雜、費(fèi)用較高，而且技術(shù)的可靠性仍需進(jìn)一步提高。因此，直到目前仍缺乏快速、便捷、高效的鑒別手段預(yù)測番木瓜的株型。隨著研究和診斷水平的不斷提高，性能穩(wěn)定、快速簡便的鑒定技術(shù)必將為番木瓜的早期高效鑒定提供強(qiáng)有力的判定依據(jù)。

相對而言，目前情況下，采用一些廉價(jià)的化學(xué)藥劑如NAA或GA-3處理番木瓜的幼苗應(yīng)該是一條株型早期鑒別的捷徑，這種性別控制的方法操作相當(dāng)簡單，效果較為顯著，可以在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。另一種較為有前途的控制性別的途徑是傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)法，即對已鑒定為雌株或兩性株的優(yōu)良品種，進(jìn)行大規(guī)模的組織培養(yǎng)，進(jìn)而獲得大量遺傳同質(zhì)的雌株或兩性株個(gè)體供應(yīng)生產(chǎn)；也可以對雌株或兩性株的花藥進(jìn)行離體培養(yǎng)，獲得單倍體植株后，再用適當(dāng)濃度的化學(xué)藥劑，如秋水仙素或富民隆進(jìn)行染色體加倍，得到遺傳同質(zhì)的二倍體雌株或兩性株個(gè)體，這種組織培養(yǎng)技術(shù)的要求遠(yuǎn)沒有分子鑒定的復(fù)雜，設(shè)施簡單，耗材廉價(jià)易得，而且操作也已基本程序化，許多苗木公司都擁有自己的組培車間，因此，組織培養(yǎng)法生產(chǎn)遺傳同質(zhì)的雌株或兩性株具有極大的推廣應(yīng)用前景。

研究番木瓜性別遺傳及性別決定的規(guī)律，在未來定向改良番木瓜的性別方面具有重要意義，通過深入研究性別遺傳，弄清其遺傳規(guī)律，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)控制性別的基因(如雌性性別的基因)，最終實(shí)現(xiàn)人為控制性別的目的。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建高效的植物表達(dá)載體，將外源基因轉(zhuǎn)入木瓜并使其在乳管中特異表達(dá)，則可在收獲木瓜蛋白酶的同時(shí)，獲得大量的外源基因產(chǎn)物，從而將番木瓜轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N極其理想的表達(dá)藥物蛋白的植物生物反應(yīng)器，實(shí)現(xiàn)用轉(zhuǎn)基因番木瓜植株生產(chǎn)人類所需藥物的廉價(jià)工廠，這也正是眾多研究人員竟相探索番木瓜性別遺傳規(guī)律的目的所在。