大鼠發育過程中下丘腦神經元鉀離子通道溫度效應變化的研究

摘 要：為了探討出生后鉀離子通道在下丘腦神經元熱敏感分化過程中的作用， 采用膜片鉗技術研究出生一個月內SD大鼠急性分離神經元的溫度效應，結果表明I_K電流密度在出生后一個月內變化不大(P>0．05)，而I_A電流密度則呈現為升高趨勢(P<0．05)。同時升高溫度， 不同出生日期的鉀通道NP₀都有不同程度的升高，但相較P1d的神經元來說，溫度對P18d的電壓依賴性影響更大一些．同時溫度對I_K和I_A的影響是不一樣的。I_A的Q10>2，所有這些顯示I_A通道在神經元溫度敏感性的發育分化過程中起著重要的作用。

關鍵詞：下丘腦；發育；溫度；鉀通道

中圖分類號：Q42；Q494 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847(2006)01-0024-04

中樞性體溫調節的本質和調控因素涉及到外周溫度信息電生理信號的編碼機制，在這種環境信號轉化為生物信號的過程中，視前區—下丘腦前部(POAH)的神經元起著重要的作用，這種重要作用體現在不同的離子通道參與了溫度信息的整合和反應。神經元的溫度敏感性的形成依賴于內在的離子通道敏感機制和突觸輸入的特性。電壓依賴性鉀通道的活動能夠有效地調節神經元的膜興奮性，被認為是溫度敏感神經元溫度敏感機制和放電率之間建立有效聯系的重要橋梁。而大鼠神經元的發育和突觸形成一直持續至出生后的最初幾周，在此期間，神經元的溫度敏感性逐步升高，這種對涉及到下丘腦溫度敏感性的表觀遺傳學變化的研究有利于最終揭示“體溫調定點”學說。為此，我們檢測了發育階段大鼠下丘腦神經元鉀離子通道的溫度效應。

1 材料和方法

1．1 下丘腦腦片制作和神經元急性分離

分別取出生后(3±2)d、(18±2)d和(30±2)dSD大鼠，快速斷頭去腦，分離出下丘腦，迅速置于0℃的高濃度蔗糖液中，用振動切片機(WorldPrecision lnstruments MA752)切割成400lam厚的腦片，在HBSS(Sigma)液中漂洗3次后置于95％O₂和5％CO₂飽和的EBSS(Sigma)液中孵育1h，用針頭將腦片分離成小塊組織后放入32℃通100％02的含1-1．2 g／L細菌蛋白酶XⅣ(Sigma)的HBSS溶液中進行消化，漂洗后用不同管徑的Paster吸管吹打成細胞懸液，靜置待細胞貼壁。

1．2 電生理記錄

玻璃微電極拉制后尖端直徑為1～2 μm，充滿電極內液后阻抗為4-S MΩ，標準電極外液成分(mmol／L)：NaCl 120，MgCl₂ 1，CaCl₂2，CsCl 1，KCl 2．8，8lucose 10，HEPES10，用NaOH調pH至7．4．標準細胞內液成分(mmol／L)：CsCl 120，MgCl₂ 1，EGTA 10，HEPES 10，Thapsigargin 2txmol／L，用CsOH調pH至7．3，記錄在20～24℃的室溫下進行．實驗用CEZ2400膜片鉗放大器，當電極尖端與細胞膜之間形成大于1 GΩ的高阻密封后，即形成細胞貼附式。全細胞記錄模式則是在此基礎上負壓破膜，使電極內液與細胞內液相通后形成，調節放大器的電容-慢控制(C—slow)和電導—串聯控制(G-series)來抵消瞬時電流，電流或電壓信號經放大器放大后通過接口與計算機相連，經1kHz濾波，結果分析等均借助計算機用pCLAMP 9．0軟件完成．浴槽液成分(mmol／L)為NaCl(125)、HEPES(10)、KCI(2，5)、MgCl2(2)、CaCl2(1)、D－glucose(10)(pH 7．2withNaOH)，電極液成分(mmol／L)為K-asparate(120)、NaCl(20)、CaCl2(2)、EGTA(0．2)、HEPES(10)(pH 7．2with KOH)。

1．3 方法

利用控溫浴槽(TC-202A，HARVARDHK)改變神經元的環境溫度，設置3個溫度區間，每個區間的溫度相差為3℃。這3個溫度區間為，32～33℃、36-37℃、39-40℃，文中沒有涉及溫度處理的記錄則是在室溫下完成(20～25℃)．

1.4 數據記錄和分析

單通道的開放概率根據下式計算得出：

其中T為記錄的時間，t為通道的開放時間，i為開放的通道數目。當通道為一級開放時，NP_o=PoI_A人和人電流幅度的計算按照HU(HU HJ etal，1998)和ZHANG(ZHANGC O etal.2001)等的方法，I_A用電流鋒值來計算，I_k用158ms處的電流值來計算。離子通道的Q₁₀表示的是通道活動對溫度的敏感度，根據下列公式計算得出：

P₁和P₂分別表示的是溫度為T₁和T₂時的電流密度(FA／pF)值，實驗數據以x±s表示，數據經SPSSl0．0軟件包處理分析，統計方法采用ANOVA法，P<0．05為存在顯著性差異。

2 實驗結果

2，1 發育過程中鉀通道的活動

按照鉀離子通道的電流活動特性可將其分為瞬時外向鉀電流(I_A)、持續性鉀電流(I_k)等類型，下丘腦神經元在出生后一個月內溫度依賴性的放電特性發生變化，表明神經元在發育過程中鉀通道的活動特性發生了變化，利用兩種電流激活特性的差異，我們研究了不同發育時期下丘腦神經元兩種類型鉀通道的發育變化。圖1A是在膜片鉗全細胞記錄模式下采用不同的電壓刺激分別記錄的兩種鉀電流。保持電位在-60mV，去極化至-100mV 200ms，給予自-40mV至+60mV的，遞增20mV的階梯去極化脈沖刺激，記錄到的全細胞外向電流特點為電流快速激活，并快速回落，形成一個電流峰，在約20ms后融入穩態電流，提示此電壓刺激引發的外向電流包含I_K和I_A兩種成分；而同樣保持電位和去極化至-100mV，予-50 mV 50ms失活I_A后同前述給—40mV至+60mV的，遞增20mV的階梯去極化刺激，記錄到的電流激活速度緩慢，約20～30ms后達到穩態，且在所測定范圍內無自行失活，這種電流成分為入。對于約63％(n=11)的P<18 d下丘腦神經元，I_k組成了發育階段主要的鉀電流成分(圖1A)，而在P>30d的神經元則90％(1l----10)可以記錄到和人兩種電流成分。在最大的去極化階梯脈沖刺激電壓下(V+60mV)，人電流密度在P<18 d時為(16．4±2．1)PA／pF(n=11)，在P>30d時為(17，2±3．2)pA(n=10)，兩者沒有顯著的統計學差異；相反，I_A電流密度由P<18d的(17，5±1，4)pA／pF(n=14)上升為P>30 d的(56．8±2．2)pA／pF(n=7，P<0.05)(圖1B)。

2．2 溫度對發育過程中鉀電流活動的影響

利用細胞貼附式，我們在單通道水平觀察了溫度對出生后不同日期分離出的下丘腦神經元的影響。果表明，溫度從33℃升高到40％，除電流幅度明顯增高外(這里對單通道的電流幅度不進行分析研究)，P1和P18神經元NPo(V_m=-45mV)分別從(0，013±0，011)和(0，106 0±0．025)上升至(0．048±0．037)(n=16，P_o=0.052)和(0．292±0．133)(n=16，P<0．05)(圖2A)。按照B01tzman方程，對不同出生日期和不同溫度下NPo增加e倍所需要的電壓值(K)進行擬和計算，發現出生發育和溫度升高都可以使K值減小，但溫度變化對P18神經元電壓依賴性的影響更大一些(圖2B)。進一步利用全細胞模式驗證溫度對P18d神經元兩種類型的鉀通道的影響，在鉗制電位為-10 mV時的電流密度在溫度升高時呈現增高趨勢，但其溫度敏感系數(依據電流幅度的變化計算q₁₀)Q₁₀<2，圖3顯示的是I_A電流在3種溫度下的電流活動，可以看出溫度升高時，電流峰值明顯增高，在去極化鉗制電壓在+10mV時，電流密度由(P<0．05)33℃時的(34．6±2．8)pA／pF升高為39℃時的(56，8．5．6)，Q₁₀為(2．5±0．8)pA／pF，Q₁₀為2.28(Q₁₀>2)。

3 結果與討論

下丘腦視前區和下丘腦前部(POAH)參與機體體溫調節的溫度感受和整合過程，在周圍環境溫度變化時，該區神經元發生放電頻率的變化，被稱為神經元的熱敏感性，但涉及這種敏感的分子和細胞機制并不為人類所了解。GRIFFINJDt”等認為鉀電流特別是在調節神經元的溫度敏感機制方面可能起著重要作用，瞬時外向鉀電流是動作電位復極早期出現的外向電流，與動作電位頻率的調節存在密切關系。

本文結合神經元出生后的發育從鉀通道參與細胞的溫度敏感機制方面進行研究，神經元放電頻率的變化有賴于發生動作電位前的去極化前電位(DPP：depolarizngprepotentials)，對于溫度敏感神經元，這種前電位能夠隨溫度變化調節動作電位間期，從而增加或減少動作電位的頻率。本文結果提示I_A電流隨著神經元的發育而有著明顯的變化，這種變化提示A電流可能是神經元溫度敏感的機制。A型K⁺電流由于在溫度升高時激活和失活快，從而參與調節DPP，這種調節可能是造成神經元溫度敏感的基礎。

我們重點在通道的蛋白水平比較研究了溫度對發育過程中下丘腦神經元K⁺電流的影響，實驗證實，下丘腦神經元在發育過程中，單通道的活動動力學發生明顯的變化。這種變化主要體現在通道的開放概率方面，同時通道膜上的電流密度增高，所有這些變化促進了神經元溫度敏感性的改變，從而分化出不同類型的溫度敏感神經元，關于出生后通道密度的變化，文獻上也有較多的報道，KILBORN MJ等曾報道出生10d的大鼠心肌細胞膜上的Kir和Ito發生數量上的變化，Kir減少3倍，而ho增加4倍，Gisela等對大鼠的海馬神經元研究發現，出生后兩天的乳鼠不能檢測到火K_t通道的。亞基，6d后才可以檢測到，同樣，乳鼠出生后1個月內下丘腦神經元膜上通道數量也出現再分配，K_v通道數量明顯增多，表現為I_A電流密度升高。

綜合以上結論，下丘腦神經元在出生1個月內的發育過程中，興奮性和熱敏感性都要發生一系列變化，所有的變化都圍繞著神經元成熟后的功能分化進行，這包括從通道蛋白的表達和數量的調整、以及適應細胞周圍環境變化而進行相應的活動動力學的調整，在此過程中，I_A通道可能起著重要的作用。